Производные изатина для применения в качестве агентов визуализации in vivo

Производные изатина для применения в качестве агентов визуализации in vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Согласно настоящему изобретению предложены новые производные изатин-5-сульфонамида и их применение в качестве агентов молекулярной визуализации при визуализации и количественном анализе каспазной активности и каспаз-зависимого апоптоза и в терапевтическом использовании.

Апоптоз или программируемая клеточная смерть (ПКС) представляет собой наиболее распространенный путь клеточной смерти и протекает посредством тонко регулируемого экономичного механизма. В нормальном состоянии апоптоз играет ключевую роль в контролировании клеточного роста, регулировании числа клеток, обеспечении морфогенеза и удалении вредных или аномальных клеток. Дисрегуляция этого процесса вовлечена в ряд болезненных состояний, включая состояния, ассоциированные с ингибированием апоптоза, такие как рак и аутоиммунные расстройства, и состояния, ассоциированные со сверхактивным апоптозом, включая нейродегенеративные заболевания, гематологические заболевания, СПИД, ишемию и отторжение аллотрансплантата. Поэтому визуализация и количественный анализ апоптоза полезны в диагностике такой патофизиологии, связанной с апоптозом.

Виды терапевтического лечения этих заболеваний направлены на восстановление сбалансированного апоптоза посредством либо стимулирования, либо ингибирования этого процесса. Неинвазивная визуализация апоптоза в клетках и ткани имеет, таким образом, огромное значение для ранней оценки реакции на терапевтическое воздействие и может предоставить новое понимание разрушительных патологических процессов. Особый интерес представляет ранний мониторинг эффективности терапии рака для обеспечения того, что злокачественная опухоль будет находиться под контролем до того, как состояние перейдет в терминальную стадию.

Среди зондов, доступных для визуализации клеточной смерти, особого внимания заслуживает меченный радиоактивным изотопом аннексии V [1, 2]. Однако аннексии V может обнаруживать явления только на внешней поверхности клетки, а не внутри клетки, и связывается только с отрицательно заряженными фосфолипидами, что делает его неспособным для различения между апоптозом и некрозом. Что касается взаимодействующих с мембраной зондов, разработан ряд производных ди-дансил-цистеина и нафтил-этил-фтораланина для визуализации апоптоза [3, 4, 5]. Однако такие взаимодействующие с мембраной зонды также страдают низкой специфичностью к апоптозным клеткам и неспособны к различению между апоптозом и некрозом без необходимости в проведении отдельного теста [6]. В последнее время растет интерес к разработке специфических соединений, которые связываются с семейством ферментов, называемых каспазами.

Каспазы представляют собой семейство цистеиновых аспартат-специфичных протеаз, которые играют центральную роль в регуляции апоптоза. Внутренние и внешние сигнальные сети активируют каспазы-«инициаторы» 8 (внешняя) или 9 (внутренняя), которые в свою очередь расщепляют неактивные прокаспазы 3, 6 и 7 до активных каспаз-«убийц» 3, 6 и 7. Каспазы-«убийцы» в итоге вызывают клеточную смерть посредством расщепления клеточных белков, которое происходит правее аспартатных остатков высокоселективным образом. Расщепляемые белки включают ферменты репарации ДНК (например поли-АДФ-рибоза-полимераза (ПАРП)), ключевые сигнальные белки (например, Akt, Ras), ядерные скелетные белки (например, актин, α-фодрин, ламины) и регуляторы клеточного цикла (например, p27Kip1).

Использование пептидных необратимых ингибиторов каспаз, таких как [¹³¹I]IZ-VAD-fmk, в качестве агентов молекулярной визуализации оказалось неудовлетворительным, так как они являются лишь умеренно селективными и обладают плохой клеточной проницаемостью, так что накопление в клетках является недостаточным для визуализации in vivo.

Совсем недавно была исследована группа химических веществ, известных как изатины, в качестве потенциальных ингибиторов каспазы. Полагают, что механизм действия изатинов включает образование внутриклеточного комплекса фермент-ингибитор с каспазой 3 и 7 посредством ковалентного связывания с ферментным активным центром активированной каспазы. Дикарбонильная функциональная группа изатинов является существенной для механизма действия; она связывается с остатком цистеина активного центра, образуя тиополукеталь посредством электрофильного карбонильного атома углерода С-3 изатина и нуклеофильного функционального тиолат-иона цистеина [7].

В результате высокопроизводительного скрининга Lee et al. идентифицировали непептидный изатин, N-(1-метил)-5-нитроизатин, в качестве ингибитора каспазы-3. Структурная оптимизация привела к разработке (S)-1-бензил-5-(2-феноксиметил-пирролидин-1-сульфонил)изатин-сульфонамида (2,5 нМ) [8] (обозначенного здесь как соединение 13). Были разработаны другие изатин-сульфонамиды в качестве ингибиторов каспазы 3 и 7 [9-12]. Kopka [13] и Mach [14] независимо разработали ¹⁸F-меченный (S)-1-(4-(2-фторэтокси)-бензил)-5-[1-(2-фенилоксиметилпирролидинил)сульфонил]изатин в качестве потенциальной изотопной метки для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), и Kopka [13] исследовал биологические свойства меченного радиоактивным йодом аналога [¹²⁵I]-((S)-1-(4-иодбензил)-5-(2-феноксиметил-пирролидин-1-сульфонил)изатина) (обозначенного здесь как соединение 14). В WO 99/06367 и WO 01/22966 описан ряд производных изатина и их применение для ингибирования каспаз. В WO 2006/074799, US 2005/0250798 и GB 1240648 описан ряд производных изатин-5-сульфонамида и их применение в качестве агентов визуализации апоптоза. Однако эти известные соединения страдают рядом недостатков, включая низкую молекулярную стабильность, относительно низкое сродство к каспазе-3 и высокую липофильность. Низкая молекулярная стабильность приводит к быстрому метаболизму, что ведет к плохо контрастируемым изображениям с низким отношением сигнала к шуму. Низкое сродство к каспазе-3 также может приводить к плохо контрастируемым изображениям. Высокая липофильность приводит к плохой системной элиминации и может повышать общее неспецифическое связывание с макромолекулами.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить новые производные изатина с повышенной молекулярной стабильностью, повышенным сродством к ферментам каспазам и пониженной липофильностью.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложены новые производные изатин-5-сульфонамида формулы А:

или их соль, гидрат или пролекарство, где:

R представляет собой фенил, 3-фторфенил, 2,4-дифторфенил, 3,5-дифторфенил, возможно замещенный тетрагидропиран, возможно замещенный диазин и возможно замещенный триазолилметил; R' представляет собой возможно замещенный фенил или возможно замещенный триазол; где

когда R представляет собой фенил, R' представляет собой возможно замещенный триазол.

В предпочтительном воплощении R включает возможно замещенный триазолилметил и R' включает возможно замещенный фенил. В другом предпочтительном воплощении R включает возможно замещенный фенил и R' включает возможно замещенный триазол.

Предпочтительно, возможно замещенный фенил, возможно замещенный тетрагидропиран и возможно замещенный диазин возможно замещены одной или более чем одной электроноакцепторной группой. Предпочтительно, указанная электроноакцепторная группа выбрана из группы, включающей галоген, нитрогруппу и карбоксильную группу или другую карбонилсодержащую функциональную группу, такую как альдегид или кетон. Наиболее предпочтительно, указанная электроноакцепторная группа представляет собой галоген. Предпочтительно, указанный галоген представляет собой фтор.

Предпочтительно, возможно замещенный фенил представляет собой 2,4-дифторфенил.

В одном воплощении возможно замещенный триазол(триазолилметил) возможно замещен замещенным алкилом. Предпочтительно, указанный замещенный алкил представляет собой галоген-замещенный алкил. Более предпочтительно, указанный галоген-замещенный алкил представляет собой С_1-4фторалкил. Предпочтительно, указанный С_1-4фторалкил представляет собой фторметил, 2-фторэтил, 3-фторпропил или 4-фторбутил. Наиболее предпочтительно, указанный С_1-4фторалкил представляет собой 2-фторэтил.

В альтернативном воплощении возможно замещенный триазол(триазолилметил) возможно замещен алкилом. Предпочтительно, указанный алкил представляет собой метил.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение также включает все стереоизомеры соединений по настоящему изобретению, включая их энантиомеры и диастереоизомеры. Соединения по настоящему изобретению могут существовать в форме по существу чистых растворов конкретных энантиомеров или в виде рацемических смесей. Предпочтительно, соединения по настоящему изобретению существуют в виде по существу чистого раствора S-энантиомера или раствора, состоящего по существу из S-энантиомера. Предпочтительно, в рацемической смеси, содержащей как S-энантиомер, так и R-энантиомер, указанный S-энантиомер содержит по меньшей мере 50% соединений по настоящему изобретению в указанной рацемической смеси. Более предпочтительно, указанный S-энантиомер содержит по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% соединений по настоящему изобретению в указанной рацемической смеси.

Особо предпочтительные соединения по настоящему изобретению включают соединения формулы А, где R и R' определены следующим образом:

3
4
5
6
7
8
9
10
11

Предпочтительно, термин «соли» включает соли, полученные из органических и неорганических кислот, таких как уксусная, пропионовая, молочная, лимонная, винная, янтарная, фумаровая, малеиновая, малоновая, миндальная, яблочная, фталевая, соляная, бромистоводородная, фосфорная, азотная, серная, метансульфоновая, нафталинсульфоновая, бензолсульфоновая, толуолсульфоновая, камфорсульфоновая, и подобных известных приемлемых кислот, когда соединение по этому изобретению содержит основную группировку. Соли также могут быть образованы из органических и неорганических оснований, предпочтительно соли щелочных металлов, например натрия, лития или калия, когда соединение по этому изобретению содержит карбоксилатную или фенольную группировку или подобную группировку, способную образовать соли присоединения оснований.

Используемый здесь термин «гидрат» относится к формам соединений по настоящему изобретению, которые химически соединены с водой.

Используемый здесь термин «пролекарство» относится к соединению, которое превращается in vivo посредством метаболического пути в соединение по настоящему изобретению.

Используемая здесь фраза «возможно замещенный фенил» относится к фенильной группе, которая возможно может содержать один или более чем один заместитель, находящийся в одном или более чем одном из положений 2, 3, 4, 5 и 6 в кольце.

Используемый здесь термин «тетрагидропиран» относится к органическому соединению, состоящему из насыщенного шестичленного кольца, содержащего пять атомов углерода и один атом кислорода.

Используемый здесь термин «триазол» относится к соединениям с молекулярной формулой C₂HN₃, имеющим пятичленное кольцо с двумя атомами углерода и тремя атомами азота. Эти соединения включают изомеры 1,4- и 1,5-дизамещенных 1,2,3-триазолов.

Используемый здесь термин «галоген» относится к брому, хлору, фтору и иоду.

Используемый здесь термин «алкил» относится к алифатической углеводородной цепи и включает прямые или разветвленные цепи, имеющие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода, но не ограничен ими, если не оговорено особо. Алкилы включают метил, этил, н-пропил, изопропил, м-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил и им подобные.

Используемая здесь фраза «замещенный алкил» относится к алкилу, дополнительно содержащему один или более чем один заместитель, выбранный из группы, включающей галоген, гидроксил, тиол, амино, альтернативный гетероатом, ароматическую или гетероароматическую группу и спейсерные группы, такие как полиэфир, включая полиэтиленгликоль, сукцинидил, -NH-(CH₂)_n-NH- и полиамиды.

Используемый здесь термин «диазин» относится к группе органических соединений, имеющих молекулярную формулу C₄H₄N₂, каждое из которых содержит бензольное кольцо, в котором два атома углерода замещены азотом. Эти соединения включают изомеры пиразина (1,4-диазин), пиримидина (1,3-диазин) и пиридазина (1,2-диазин).

Соединения по настоящему изобретению являются специфичными к активированным каспазам и поэтому обладают высоким сродством. Они являются сильнодействующими и селективными ингибиторами каспаз 3 и 7. В частности, соединения по настоящему изобретению обладают высоким сродством к каспазе-3 и каспазе-7. Они экспрессируются в активной форме только во время апоптоза, и активность каспазы-3 и/или каспазы-7, поэтому, является достоверным индикатором каспаз-зависимого апоптоза.

Соединения по настоящему изобретению обладают пониженной липофильностью по сравнению со многими известными производными изатин-5-сульфонамида, что делает возможной хорошую системную элиминацию и уменьшает общее неспецифическое связывание с макромолекулами. Однако каспазы являются внутриклеточными протеазами, поэтому соединения по настоящему изобретению являются еще и достаточно липофильными, чтобы пересекать клеточные мембраны посредством необлегченной диффузии, для того чтобы они могли свободно проходить в клетку и из клетки. В связи с этим, соединения будут обладать быстрым двусторонним переносом и удерживанием только в клетках с активированной каспазой-3 и/или каспазой-7. Оптимальная липофильность (выраженная в виде Log P) варьирует в зависимости от типа клетки, в которую соединения должны проходить, помимо ряда других факторов. В одном воплощении липофильность находится предпочтительно в пределах от 1,0 до 2,0.

Соединения по настоящему изобретению обладают повышенной метаболической стабильностью, что снижает скорость, с которой соединения подвергаются метаболизму и, в некоторых случаях, экскреции. Повышенная метаболическая стабильность делает возможным накопление соединения по настоящему изобретению в клетках, подвергающихся апоптозу, при связывании с активированными каспазами. Это обеспечивает хорошо контрастируемые изображения с высоким отношением сигнала к шуму. Это является благоприятным для агента молекулярной визуализации, поскольку делает возможной четкую визуализацию и количественный анализ каспазной активности в клетках и тканях.

Предпочтительно, соединения по настоящему изобретению имеют низкое накопление в необработанных опухолях, ткани сердца и головного мозга. Это способствует мониторингу изменений при связывании этих соединений с активированными каспазами в тканях млекопитающих, которые ассоциированы с изменениями в каспазной активности.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложены соединения по первому аспекту настоящего изобретения, где указанные соединения включают метку визуализирующей группировкой.

Указанное мечение может включать визуализирующую группировку в пределах функциональной группы или присоединение визуализирующей группировки в виде дополнительной группы.

Указанная визуализирующая группировка может включать любую группировку, способную давать детектируемый сигнал. Такие группировки включают флуоресцентные метки и радиоактивные метки.

Флуоресцентные метки содержат ковалентно присоединенный флуорофор. Предпочтительные флуорофоры включают флуоресцеинизотиоцианат, производные родамина, кумариновые и цианиновые красители, Alexa Fluors и DyLight Fluors.

Предпочтительно, соединения метят радиоактивным изотопом. Использование радиоактивного изотопа в качестве визуализирующей группировки обладает преимуществами, так как радиоактивный изотоп значительно не увеличивает молекулярную массу соединения по настоящему изобретению и может быть использован для клинической неинвазивной визуализации.

Предпочтительно, радиоактивный изотоп представляет собой позитронный излучатель. Радиоактивный изотоп может быть выбран из группы, включающей ³H, ¹⁴С, ¹⁸F, ¹¹С, ¹²⁰I, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^94mTc, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ^94mTc, ^99mTc, ²⁰¹TI, ¹¹¹In, ⁸⁶Y и ⁸⁹Zr.

Если визуализирующая группировка должна быть визуализирована с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), радиоактивный изотоп предпочтительно выбран из группы, включающей ¹⁸F, ¹¹С, ¹²⁰I, ¹²⁴I, ^94mTc, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁶Y, ⁷⁵Br и ⁷⁶Br.

Если визуализирующая группировка должна быть визуализирована с использованием однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), радиоактивный изотоп предпочтительно выбран из группы, включающей ¹²³I, ^99mTc и ¹¹¹In.

Предпочтительно, визуализирующая группировка представляет собой ¹⁸F или ¹¹С.

Предпочтительно, в любом из соединений от 1 до 12 и от 29 до 34 один или более чем один атом фтора в R и/или R' представляет собой ¹⁸F.

Добавление 1,2,3-триазольной группы в R или R', как, например, в соединениях от 6 до 12 и от 29 до 36, имеет дополнительное преимущество, поскольку в такое соединение может быть легко введена метка ¹⁸F или ¹¹С.

Особо предпочтительное воплощение соединения по изобретению имеет формулу:

Другие предпочтительные соединения по настоящему изобретению имеют общие формулы:

и

где R и R' являются такими, как определено выше.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложена композиция, содержащая соединение по первому аспекту изобретения, возможно, в комбинации с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предложена композиция, содержащая соединение по второму аспекту изобретения, возможно, в комбинации с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

Эти композиции могут также содержать один или более чем один дополнительный активный агент. Указанные дополнительные активные агенты могут включать агент, который усиливает сигнал, продуцируемый соединениями по настоящему изобретению. Предпочтительно, указанный активный агент включает соединения, которые уменьшают или модулируют уровни клеточного глутатиона, включая диэтилмалеат (ДЭМ), L-бутионин-(S,R)-сульфоксим (БСО) и их производные.

Композиции по третьему или четвертому аспекту настоящего изобретения могут быть введены любым подходящим способом.

Композиции можно привести в контакт с клетками посредством экспонирования, инкубирования, соприкосновения, ассоциирования или обеспечения соединению доступа в клетки.

Композиции могут быть введены субъекту посредством перорального (включая ингаляцию), парентерального, мукозального (например, трансбуккального, сублингвального, назального), ректального или трансдермального введения, и композиции подобраны соответственно.

Для перорального введения композиции могут быть приготовлены в виде жидкостей или твердых веществ, например растворов, сиропов, суспензий или эмульсий, таблеток, капсул и лепешек.

Жидкий препарат будет обычно состоять из суспензии или раствора соединения или его физиологически приемлемой соли, гидрата или пролекарства в подходящем водном или неводном жидком носителе(ях), например воде, этаноле, глицерине, полиэтиленгликоле или масле. Препарат может также содержать суспендирующий агент, консервант, корригент или краситель.

Композиция в форме таблетки может быть приготовлена с использованием любого(ых) подходящего(их) фармацевтического(их) носителя(ей), обычно используемого(ых) для приготовления твердых препаратов. Примеры таких носителей включают стеарат магния, крахмал, лактозу, сахарозу и микрокристаллическую целлюлозу.

Композиция в форме капсулы может быть приготовлена с использованием стандартных методов инкапсулирования. Например, порошки, гранулы или пеллеты, содержащие активный ингредиент, могут быть приготовлены с использованием стандартных носителей и затем помещены в твердую желатиновую капсулу. Альтернативно, дисперсия или суспензия могут быть приготовлены с использованием любого(ых) подходящего(их) фармацевтического(их) носителя(ей), например жидких камедей, целлюлоз, силикатов или масел, и эту дисперсию или суспензию затем помещают в мягкую желатиновую капсулу.

Композиции для перорального введения могут быть приспособлены для защиты активного ингредиента от разложения, когда он проходит через пищеварительный тракт, например, с помощью наружного покрытия препарата на таблетке или капсуле.

Композиции для назального или перорального введения могут быть легко приготовлены в виде аэрозолей, капель, гелей и порошков. Аэрозольные препараты типично содержат раствор или тонкую суспензию активного вещества в физиологически приемлемом водном или неводном растворителе и обычно представлены в количестве, предназначенном для однократного или многократного дозирования, в стерильной форме в герметичном контейнере, который может иметь форму картриджа или сменного баллончика для применения в распылительном устройстве. Альтернативно, герметичный контейнер может представлять собой единичное распределительное устройство, такое как однодозовый назальный ингалятор или аэрозольный распылитель, снабженный дозатором, которое предназначено на выброс, как только содержимое контейнера будет израсходовано. Когда лекарственная форма содержит аэрозольный распылитель, он будет содержать фармацевтически приемлемый пропеллент. Аэрозольные лекарственные формы могут также иметь форму помпового распылителя.

Композиции, подходящие для трансбуккального или сублингвального введения, включают таблетки, лепешки и пастилки, в которых активный ингредиент включен в состав препарата с носителем, таким как сахар и аравийская камедь, трагакант или желатин и глицерин.

Композиции для ректального или вагинального введения удобны в форме суппозиториев (содержащих традиционную основу для суппозиториев, такую как масло какао), пессариев, вагинальных таблеток, пенок или клизм.

Композиции, подходящие для трансдермального введения, включают мази, гели, пластыри и инъекции, включая порошковые инъекции.

Удобно, чтобы композиция находилась в стандартной лекарственной форме, такой как таблетка, капсула или ампула.

Предпочтительно, соединения или композиции по настоящему изобретению вводят субъекту посредством парентерального введения. В частности, композиции могут быть введены внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутрилимфатически или внутримышечно.

Типичные парентеральные композиции состоят из парентерально приемлемого раствора или суспензии соединения или физиологически приемлемой соли в стерильном водном или неводном носителе, который имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области техники могут приготовить подходящие растворы с использованием, например, изотонических носителей, таких как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. В случае необходимости могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферные агенты, антиоксиданты и/или другие вспомогательные вещества.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения предложены соединения по первому или второму аспекту настоящего изобретения или фармацевтические композиции по третьему или четвертому аспекту настоящего изобретения для применения в качестве агентов молекулярной визуализации.

Предпочтительно, указанные агенты молекулярной визуализации предназначены для визуализации и количественного анализа каспазной активности в клетках и тканях. Предпочтительно, указанные агенты молекулярной визуализации предназначены для визуализации и количественного анализа каспазной активности в клетках и тканях млекопитающих, включая клетки и ткани человека. Указанный количественный анализ может включать анализ величины радиоактивности в клетках и тканях или скорости поглощения, диссоциации или распределения.

При образовании комплекса с активными каспазами поглощение и накопление меченого соединения в клетках и тканях можно затем визуализировать для индикации уровня каспазной активности в этих клетках и тканях. Поэтому, согласно шестому аспекту настоящего изобретения, предложен способ молекулярной визуализации каспазной активности, включающий стадии:

а) приведения указанных клеток или тканей в контакт с соединением по второму аспекту настоящего изобретения или композицией по четвертому аспекту настоящего изобретения и

б) детектирования указанной каспазной активности.

Предпочтительно, стадия детектирования указанной каспазной активности включает стадии помещения субъекта в область детекции устройства обнаружения и детектирования указанных соединений у субъекта с помощью указанного устройства обнаружения.

Этот способ может быть осуществлен in vitro. Приведение клеток или тканей в контакт с соединением или композицией по настоящему изобретению может включать экспонирование, инкубирование, соприкосновение, ассоциирование или обеспечение соединению доступа в клетки и ткани.

Когда соединение или композиция по настоящему изобретению включает радиоизотопную метку, указанную каспазную активность можно детектировать in vitro с использованием любого соответствующего устройства радиоизотопной диагностики. Указанное устройство может включать счетчик бета-излучения, такой как Packard Topcount, или счетчик гамма-излучения, такой как Packard Cobra II™ (Perkin Elmer, UK), или сканер для радио-TLC.

Когда соединение или композиция по настоящему изобретению включает флуоресцентную метку, указанную каспазную активность можно детектировать in vitro с использованием любого соответствующего считывающего прибора для измерения флуоресценции. Такие приборы включают флуоресцентный микроскоп, флуорометр или флуоресцентный планшетный ридер, такой как Perkin Elmer Victor.

Альтернативно, этот способ может быть осуществлен in vivo. Соединения или композиции могут быть введены субъекту любым способом, рассмотренным в третьем и четвертом аспектах настоящего изобретения. Предпочтительно, соединения вводят парентерально.

Когда соединение или композиция по настоящему изобретению включает радиоизотопную метку, указанную каспазную активность можно детектировать с использованием устройства радиоизотопной диагностики. Указанное устройство радиоизотопной диагностики может включать сканер позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или сканер однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). Предпочтительно, указанное устройство радиоизотопной диагностики представляет собой сканер позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Указанный ПЭТ-сканер может детектировать пары гамма-лучей, испускаемых опосредованно позитрон-испускающими радиоизотопами, такими как ¹⁸F, для получения трехмерного изображения концентрации радиоизотопов в тканях. Таким образом, ПЭТ может быть использована для получения трехмерного изображения локализации меченых радиоактивными изотопами соединений и композиций по настоящему изобретению в клетках млекопитающих.

Когда соединение или композиция по настоящему изобретению включает флуоресцентную метку, указанную каспазную активность можно детектировать с использованием любого соответствующего считывающего прибора для измерения флуоресценции. Указанный считывающий прибор для измерения флуоресценции может включать флуоресцентный эндоскоп.

Предпочтительно, каспазная активность представляет собой активность каспазы-3.

Согласно настоящему изобретению также предложено применение соединений по второму аспекту настоящего изобретения для производства фармацевтической или диагностической композиции для визуализации и количественного анализа каспазной активности.

В альтернативном воплощении шестого аспекта соединения по первому аспекту настоящего изобретения или фармацевтические композиции по третьему аспекту настоящего изобретения могут быть введены согласно стадии (а). Указанные соединения затем могут быть помечены флуоресцентно или радиоактивными изотопами после указанного введения.

Как рассмотрено выше, ферменты каспазы вызывают апоптоз, и как таковая каспазная активность может быть использована в качестве индикатора апоптоза. Поэтому, согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, предложено применение соединений по второму аспекту настоящего изобретения или фармацевтических композиций по четвертому аспекту настоящего изобретения для визуализации in vivo каспаз-зависимого апоптоза в клетках или ткани млекопитающих.

Этот способ может включать:

а) введение субъекту соединения по второму аспекту настоящего изобретения или композиции по четвертому аспекту настоящего изобретения;

б) помещение субъекта в область детекции устройства обнаружения; и

в) детектирование указанных соединений у субъекта с помощью указанного устройства обнаружения.

Предпочтительно указанное соединение или композицию вводят субъекту посредством инъекции.

Визуализирующую группировку можно детектировать либо наружно, неинвазивным способом, либо изнутри путем использования детекторов, разработанных для применения in vivo, таких как внутрисосудистые радиационные или оптические детекторы, или радиационных детекторов, разработанных для интраоперационного применения. Предпочтительно, визуализирующую группировку детектируют неинвазивным способом.

В одном воплощении указанные соединения метят флуоресцентно и детектируют путем измерения флуоресценции, излучаемой флуоресцентно мечеными соединениями, с помощью считывающего прибора для измерения флуоресценции, как определено выше в шестом аспекте.

Во втором воплощении, являющемся предпочтительным, указанные соединения метят радиоактивными изотопами и детектируют путем измерения излучения, испускаемого мечеными радиоактивными изотопами соединениями, с помощью устройства радиоизотопной диагностики, как определено выше в шестом аспекте.

Предпочтительно, указанная каспазная активность представляет собой активность каспазы-3.

В альтернативном воплощении седьмого аспекта соединения по первому аспекту настоящего изобретения или фармацевтические композиции по третьему аспекту настоящего изобретения могут быть введены согласно стадии (а). Указанные соединения затем могут быть помечены in vivo флуоресцентно или радиоактивными изотопами после указанного введения.

Как рассмотрено выше, виды терапевтического лечения ряда заболеваний направлены на восстановление нормального сбалансированного апоптоза посредством стимулирования или ингибирования этого процесса. Поэтому, согласно восьмому аспекту настоящего изобретения предложено применение соединений по второму аспекту настоящего изобретения или фармацевтических композиций по четвертому аспекту настоящего изобретения для оценки терапевтического воздействия исследуемого вещества на каспазную активность в клетках или тканях млекопитающих. Этот способ может включать:

а) приведение клеток или тканей млекопитающих в контакт с соединением по второму аспекту настоящего изобретения или композицией по четвертому аспекту настоящего изобретения;

б) помещение указанных клеток или тканей млекопитающих в область детекции устройства обнаружения;

в) детектирование соединений с помощью указанного устройства обнаружения;

г) повторение стадий (а), (б) и (в).

В одном воплощении указанные соединения метят флуоресцентно и детектируют посредством измерения флуоресценции, излучаемой флуоресцентно мечеными соединениями, с помощью считывающего прибора для измерения флуоресценции, как определено выше в шестом аспекте.

Во втором воплощении, являющемся предпочтительным, указанные соединения метят радиоактивными изотопами и детектируют путем измерения излучения, испускаемого мечеными радиоактивными изотопами соединениями, с помощью устройства радиоизотопной диагностики, как определено выше в шестом аспекте.

В альтернативном воплощении восьмого аспекта соединения по первому аспекту настоящего изобретения или фармацевтические композиции по третьему аспекту настоящего изобретения могут быть введены согласно стадии (а). Указанные соединения затем могут быть помечены флуоресцентно или радиоактивными изотопами после указанного введения.

Предпочтительно, этот способ может быть осуществлен in vivo и может включать:

а) введение субъекту соединения по второму аспекту настоящего изобретения или композиции по четвертому аспекту настоящего изобретения;

б) помещение субъекта в область детекции устройства радиоизотопной диагностики;

в) измерение излучения, испускаемого мечеными радиоактивными изотопами соединениями, у субъекта с помощью указанного устройства радиоизотопной диагностики;

г) повторение стадий (а), (б) и (в).

Как для in vitro, так и для in vivo способов по восьмому аспекту, стадию (г) предпочтительно осуществлять в избранные промежутки времени, когда указанное повторение является эффективным для отслеживания изменений в каспазной активности в течение времени. Промежутки времени для стадии (г) должны быть подходящими для субъекта и исследуемого соединения, о которых идет речь. Для людей подходящие промежутки времени включают от 12 до 24 часов, 48 часов, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель или 6 недель, но не ограничены ими.

Каспазную активность, измеряемую при каждом повторении, можно сравнить для оценки количественных изменений величины и локализации каспазной активности, и следовательно, количественных или полуколичественных изменений в каспаз-зависимом апоптозе, в течение времени. Изменения величины и локализации каспазной активности могут служить признаком терапевтического воздействия исследуемого соединения на каспаз-зависимый апоптоз либо посредством стимулирования, либо ингибирования каспазной активности. Этот способ может быть использован для оценки реакции субъекта на терапевтическое лечение с использованием признанных лекарственных средств и оценки эффективности новых лекарственных средств.

Соединение или композицию по настоящему изобретению можно вводить до, после или одновременно с исследуемым веществом. Предпочтительно, стадии от (а) до (в) проводят на субъекте