Нуклеиновая кислота, кодирующая основанный на fret дальне-красный биосенсор для измерения активности каспазы 3 внутри клеток

Нуклеиновая кислота, кодирующая основанный на fret дальне-красный биосенсор для измерения активности каспазы 3 внутри клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[002] ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Данное изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на биосенсоры для детекции активности каспазы 3, сконструированные на основе флуоресцентных белков.

[004] УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[005] Процесс запрограммированной клеточной гибели, апоптоз, является одним из ключевых процессов для эмбрионального развития и поддержания тканей в здоровом состоянии, в частности противодействия опухолевому росту. В инициации и эффекторной стадии апоптоза ключевую роль играют ферменты каспазы.

[006] Каспазы представляют собой семейство внутриклеточных специфичных цистеиновых протеаз, которые являются высококонсервативными в многоклеточных организмах. В млекопитающих было идентифицировано 14 представителей семейства каспаз, сгруппированных в 2 главные руппы, воспалительные и апототические каспазы. Связанные с апоптозом каспазы далее классифицируется на 2 группы: инициирующие каспазы (каспазы 2, 8 и 9), которые функционируют в начале каспазного сигнального пути, и эффекторные каспазы 3, 6 и 7 [Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of caspases. Oncogene. 2003; 22(53):8543-8567].

[007] Инициирующие каспазы 8 и 9 активицируются посредством автокаталитического расщепления, опосредуемого высокомолекулярным адапторным коплексом, известным как апоптосома. Данный комплекс обычно формируется в ответ на внутриклеточные или внеклеточные стимулы, сигнализирующие о необходимости гибели клетки [Riedl SJ, Salvesen GS. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol CelS Biol. 2007; 8(5):405-413]. Главной мишенью активированных инициирующих каспаз являются неактивные предшественники эффекторных каспаз 3, 6 и 7-прокаспазы. Расщепление каспазами 8 и 9 активирует эффекторные каспазы. Мишенями расщепления эффекторных каспаз, в частности каспазы 3, являются множество клеточных белков, что приводит к контролируемой гибели клетки. В дополнение к ключевой роли в апоптозе недавние исследования демонстрируют наличие не связанных с апоптозом функций эффекторных каспаз, включающих регулирование иммунного ответа, пролиферации, дифференцировки и подвижности клеток [Kuranaga E, Miura M. Nonapoptotic functions of caspases: caspases as regulatory molecules for immunity and cell-fate determination. Trends Cell Biol. 2007; 17(3):135-144; Yi CH, Yuan J. The Jekyll and Hyde functions of caspases. Dev Cell. 2009; 16(1):21-34].

[008] Каспазы характеризуются высокой субстратной специфичностью. Они распознают специфическую последовательность в белках-мишенях. С помощью библиотек флуоресцентно меченых тетрапептидных субстратов было установлено, что каспазы 3 и 7 распознают в качестве мишени последовательность DEVD.

[009] Как указывает ряд авторов, специфичность каспаз к субстратам, определенная in vitro с помощью указанного подхода, не является абсолютно точным отражением необходимых для расщепления условий in vivo. На специфичность расщепления каспаз in vivo влияют особенности конформации аминокислотных последовательностей, фланкирующих расщепляемый тетрапептидный мотив, которые могут контролировать молекулярный электростатический потенциал и стерическую доступность активного центра протеазы и белка-мишени [Muneef Ayyash, Hashem Tamimi, and Yaqoub Ashhab Developing a powerful In Silico tool for the discovery of novel caspase-3 substrates: a preliminary screening of the human proteome. BMC Bioinformatics. 2012; 13: 14]. Например, несмотря на одинаковую расщепляемую тетрапептидную последовательность DEVD, каспазы 3 и 7 характеризуются четким различием расщепляемых природных субстратов [Walsh JG et al. Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(35): 12815-12819]. Было показано, что кроме терапептидной расщепляемой последовательности DEVD (P4-P1) расположенные вне коровой последовательности остатки Р6, Р5, Р2' и РЗ' являются исключительно важными для идентификации белков как субстратов каспазы 3 и каспазы 7 [Demon D et al. Proteome-wide substrate analysis indicates substrate exclusion as a mechanism to generate caspase-7 versus caspase-3 specificity. Mol Cell Proteomics. 2009; 8(12):2700-2714].

[010] Описанные выше ограничения по стерической доступности, электростатическому заряду остатков на поверхности белка и влиянию определенных остатков за пределами коровой последовательности DEVD, накладываемые на мишени каспаз in vivo, делают конструирование искусственных белковых субстратов для каспаз нетривиальной задачей. При этом перенос известной расщепляемой каспазой последовательности в новый химерный полипептид, не являющийся субстратом каспазы, не гарантирует работоспособности полученного химерного полипептида в качестве субстрата каспазы.

[011] Среди эффекторных каспаз фермент каспаза 3 считается наиболее важным эффектором, расщепляющим большое количество клеточных субстратов. Инактивация каспазы 3 с использованием антител ингибирует большую часть протеолитических реакций, имеющих место при апоптозе, в то время как инактивация других эффекторных каспаз оказывает незначительный эффект на маркеры апоптоза и эффективность их протеолиза [Walsh JG et al. Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(35):12815-12819]. Исследования за последние 10 лет выявили более 200 субстратов каспазы 3 и их количество продолжает расти.

[012] Определение уровня подвергающихся апоптозу клеток, например, через измерение активности каспазы 3, может быть использовано, в частности, для оценки эффективности противораковой терапии [Rossi E et al. Dynamic changes of live/apoptotic circulating tumour cells as predictive marker of response to sunitinib in metastatic renal cancer. Br J Cancer. 2012 Oct 9; 107(8): 1286-94; Yang F et al. Sunitinib induces apoptosis and growth arrest of medulloblastoma tumor cells by inhibiting STAT3 and АКТ signaling pathways. Mol Cancer Res. 2010 Jan; 8(1):35-45]. В литературе описан широко востребованный метод определения активности каспазы 3, основанный на иммунохимическом выявлении продукта активности каспазы, расщепленного цитокератина 18 (М30 CytoDEATH™, Peviva). Однако при высокой чувствительности и надежности данный метод обладает рядом недостатков, таких как невозможность отслеживать изменения активность каспаз в динамике, высокая стоимость и сложность анализа.

[013] Данных недостатков лишены анализы с использованием генетически кодируемых биосенсоров на основе флуоресцентных белков [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3):1103-63].

[014] Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616):87-91 и Chudakov et al. (Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3): 1103-63).

[015] Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.

[016] GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60:85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет.кДНК, кодирующая A. victoria GFP была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

[017] GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaetherand Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

[018] Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Была проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих («гуманизированный« GFP, Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Были получены различные мутанты GFP, в том числе «усиленный зеленый флуоресцентный белок« (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.

[019] В 1999 г. гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Arrthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладали большим спектральным разнообразием и включали циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10):953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5):841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.

[020] Были получены кристаллические структуры avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.

[021] Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).

[022] Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91:12501-12504; Ormo et al. Science. 1996;273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996; 14:1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997; 4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001; 2:6; Gross et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97:11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000; 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98:462-467; Pakhomov, A.A. and Martynov, V.I. Chem. Biol. 2008, 15, 755-764; Quillinet al. (2005) Biochemistry 44, 5774- 5787; Yampolsky et al. (2005) Biochemistry 44, 5788- 5793; Shu et al. (2006) Biochemistry 45, 9639-9647; Kikuchi et al. (2008) Biochemistry 47, 11573-11580; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009, 48 (33), p.8077-8082).

[023] GFP-подобные белки широко используют для создания генетически кодируемых биосенсоров. Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких генетически кодируемых биосенсоров становится все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров.

[024] Для наблюдения за процессами в толще тканей млекопитающих животных, характеризующихся значительным поглощением и светорассеянием при длинах волн менее 650 нм, были разработаны родственные GFP флуоресцентные белки с максимумами эмиссии в дальне-красной области. Были описаны флуоресцентный белок Katushka (максимум возбуждения 588 нм, максимум эмиссии 635 нм) [Shcherbo D et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 2007 Sep; 4(9):741-6], а также его вариант с увеличенной мономерностью mKate2, eqFP650 (димерный белок, максимум возбуждения 592 нм, максимум эмиссии 650 нм), NiRFP (eqFP670, димерный белок, максимум возбуждения 605 нм, максимум эмиссии 670 нм) [Shcherbo D et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010 Oct; 7(10):827-9]. eqFP650 является одним из самых ярких флуоресцентных белков с максимумом эмиссии с длиной волны более 635 нм, а eqFP670 обладает высокой фотостабильностью и является на сегодняшний день флуоресцентным белком с наиболее длинноволновым максимумом эмиссии флуоресценции среди GFP-подобных белков.

[025] В 2010 году был описан флуоресцентый белок, не родственный белку GFP, обладающий совершенно иной структурой и уникальными спектральными свойствами. Флуоресцентный белок с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра (iRFP) представляет собой белок на основе бактериального фитохрома RpBphP2 из фотосинтетической бактерии Rhodopseudomonas palustris с максимумами поглощения и эмиссии 690 и 713 нм, соответственно. Белок был разработан для функциональных исследований с использованием флуоресценции в тканях млекопитающих животных in vivo, при котором применение большинства родственных GFP флуоресцентных белков ограничено за счет высокого поглощения света гемоглобином и меланином кожи. Для данных целей максиму поглощения и эмиссии должны находиться в близкой к инфракрасной области спектра от 650 до 900 нм, где поглощение и рассеяние света тканями является наименьшим.

[026] Роль флуорофора в белке играет молекула линейного тетрапиррола биливердина IXα, ковалентно присоединяющаяся к остатку цистеина полипептидной цепи. В клетках млекопитающих iRFP не требует дополнительного добавления в среду необходимого для флуоресценции кофактора биливердина, т.к. данное соединение является интермедиатом в метаболизме гема и присутствует в клетках. Белок обладает высокой яркостью флуоресценции, внутриклеточной стабильностью и фотостабильностью по сравнению с ранее известными флуоресцентными белками на основе фитохромов. По сравнению с дальне-красными флуоресцентными белками на основе GFP, iRFP характеризуется более высоким отношением сигнал/фон в тканях животных из-за эмиссии в близкой к инфракрасной области спектра.

[027] Теоретически, из-за своих спектральных свойств белок iRFP может быть использован в качестве акцептора для FRET в паре с такими донорами, как дальне-красные флуоресцентные белки семейства GFP. Теоретически, данный белок может быть использован для конструирования основанных на FRET биосенсоров с использованием таких доноров, как дальне-красные флуоресцентные белки семейства GFP, однако возможность создания таких сенсоров ранее экспериментально не проверялась.

[028] Белок представляет собой димер, что осложняет конструирование биосенсоров с его использованием. Для получения белков слияния с iRFP его разработчиками рекомендуется использовать тандемные димеры данного белка (Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM, Zhang J, Kim K, Verkhusha W. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011 Jul 17; 29(8):757-61].

[029] Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белок, белковый домен или полипептид, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например, изменению активности какого-либо белка фермента (такого как протеаза. например, каспаза). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки или их варианты, между которыми может происходить процесс Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3):1103-63].

[030] Ферстеровский перенос энергии, иначе диполь-дипольный перенос энергии; флуоресцентный резонансный перенос энергии; индуктивно-резонансный перенос энергии (FRET) - механизм переноса энергии между двумя хромофорами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором. Характерной чертой данного процесса является тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции акцептора. Эффективность переноса энергии (или отношение числа событий переноса энергии к числу событий возбуждения донора) напрямую связана со скоростью переноса и зависит от расстояния между объектами (убывает как r^-6). Эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50% от максимума, называют ферстеровским радиусом. Для большинства систем его величина составляет 20-50 Å.

[031] Эффективность переноса энергии также зависит от множества факторов, таких как расстояние между донором и акцептором, степень перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, взаимная ориентация диполей донора и акцептора [Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. - Springer, 2006].

[032] Таким образом, надежно предсказать эффективность FRET между известными белками-флуорофорами заранее практически невозможно, следовательно, создание работоспособного флуоресцентного биосенсора на основе FRET с новой парой флуорофоров является нестандартной и сложной задачей [Campbell RE. Fluorescent-protein-based biosensors: modulation of energy transfer as a design principle. Anal Chem. 2009 Aug 1; 81(15):5972-9.].

[033] Детекция молекулярной динамики с помощью FRET является современным и высоко востребованным методом анализа белок-белковых взаимодействий при активации внутриклеточных сигнальных путей. Исследования с использованием FRET между мечеными производными GFP молекулами показали образование комплексов между сигнальными белками в различных клеточных компартментах. Также были созданы биосенсоры на основе FRET для детекции каспазной активности [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S. Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3):1103-63].

[034] Например, для детекции активности каспазы 3 был сконструирован и успешно применен биосенсор на основе FRET, состоящий из двух флуоресцентных белков, являющихся производными зеленого флуоресцентного белка GFP, таких как циановый флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), и включающий распознаваемую каспазой последовательность в линкере между ними. В данной системе расщепление линкерной части активированной каспазой приводило к исчезновению FRET за счет физического расхождения двух флуорофоров. Также был получен похожий сенсор для каспазы 8 [Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC. Measuring dynamics of caspase-8 activation in a single living HeLa cell during TNFalpha-induced apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 2; 304(2):217-22].

[035] Также описан схожий по характеристикам генетически кодируемый биосенсор активности каспазы 3 Casper3-BG (Subach ОМ et al. Chem Biol. 2008 Oct 20; 15(10): 1116-24), основанный на FRET между синим флуоресцентным белком TagBFP и зеленым флуоресцентным белком TagGFP2 из семейства GFP-подобных белков, разделенными линкером с расщепляемой каспазой 3 последовательностью DEVD. Активация каспазы 3 при апоптозе приводит к расщеплению линкерной последовательности между белками и исчезновению FRET, которое можно детектировать по ослаблению зеленой флуоресценции TagGFP2 и одновременному усилению флуоресценции TagBFP. Отмечена меньшая способность белков TagGFP2 и TagBFP по сравнению с YFP и CFP образовывать гетеродимеры, что приводит к уменьшению фонового уровня FRET биосенсора.

[036] К числу биосенсоров каспазной активности на основе FRET также принадлежит генетически кодируемый биосенсор, состоящий из красного флуоресцентного белка TagRFP (максимум эмиссии 584 нм) в качестве донора для FRET и не флуоресцентного в условиях измерения хромобелка KFP в качестве акцептора FRET [Savitsky АР et al. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostics. 2012; 2(2):215-261.

[037] Был описан биосенсор на основе FRET для одновременной детекции активности каспазы 8 и каспазы 3 CYR83, сконструированный из трех флуоресцентных белков семейства GFP: цианового флуоресцентного белка seCFP (возбуждение 420 нм, эмиссия 476 нм), желтого флуоресцентного белка Venus (возбуждение 514 нм, эмиссия 528 нм) и красного флуоресцентного белка mRFP1 (возбуждение 500 нм, эмиссия 608 нм). Белки seCFP и Venus были соединены расщепляемым каспазой 8 линкером, далее белок Venus был соединен с белком mRFP1 посредством расщепляемого каспазой 3 линкера. Детекцию активности каспазы 3 осуществляли по исчезновению FRET между Venus и mRFP1 по увеличению флуоресценции при 528 нм и падению флуоресценции при 608 нм.

[038] Однако все описанные генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры каспазной активности не позволяют проводить измерения в удобном для измерения флуоресценции в животных моделях диапазоне длин волн 650-900 нм. Таким образом, существует необходимость разработки новых генетически кодируемых биосенсоров активности каспазы 3 с использованием дальне-красных флуоресцентных белков, обеспечивающих аналитический флуоресцентный сигнал от биосенсора в области длин волн более 650 нм.

[039] До настоящего времени не создано флуоресцентных биосенсоров каспазной активности, работающих на основе FRET, с использованием дальне-красных флуоресцентных белков в качестве доноров для переноса энергии. Не описано также биосенсоров, работающих на основе FRET, сконструированных с использованием флуоресцентного белка с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра iRFP.

[040] Так как наличие и эффективность FRET между донорным и акцепторным флуорофорами, в частности двумя флуоресцентными белками, зависит от множества параметров, предсказать возможность создания основанного на FRET биосенсора, исходя из теоретических предпосылок о свойствах iRFP и дальне-красных мутантов GFP, не представляется возможным.

[041] Так как используемые при конструировании генетически кодируемых биосенсоров по настоящему изобретению флуоресцентные белки семейства GFP eqFP650 и eqFP670 и флуоресцентный белок iRFP in vivo представляют собой димеры, связанные нековалентными связями, биосенсоры по изобретению также представляют собой димеры или структуры более высоко порядка в системах in vivo, что может полностью стерически блокировать чувствительный к каспазе 3 линкер и препятствовать расщеплению биосесора каспазой. Данная ситуация также осложняется тем, что сам фермент каспаза 3 активна в клетке в виде димера [Savitsky АР et al. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostics. 2012; 2(2):215-26]. Так как структура белка iRFP кардинально отличается от структуры GFP-подобных белков, структуру биосенсоров по изобретению нельзя аппроксимировать из известных структур биосенсоров на основе только GFP-подобных белков.

[042] РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[043] Настоящее изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентные биосенсоры для измерения активности каспазы 3, аналитический сигнал которых представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра.

[044] В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации активности каспазы 3 внутри клеток. В некоторых воплощениях указанный биосенсор при увеличении активности каспазы 3 в среде реагирует увеличением флуоресценции белка донора FRET в дальне-красной области с длиной волны более 650 нм при его возбуждении относительно флуоресценции белка iRFP. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок семейства GFP. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок mKate2, флуоресценцию которого возбуждают светом с длиной волны приблизительно 588 нм и измеряют при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 635 нм, предпочтительно приблизительно 650 нм. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок eqFP650, флуоресценцию которого возбуждают светом с длиной волны приблизительно 592 нм и измеряют при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 650 нм. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок eqFP670, флуоресценцию которого возбуждают светом с длиной волны приблизительно 605 нм и измеряют при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 670 нм. Предпочтительно изменения флуоресценции дальне-красного флуоресцентного белка, являющегося донором для FRET, нормируют на флуоресценцию белка iRFP при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 713 нм при возбуждении светом с длиной волны приблизительно 690 нм.

[045] В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения состоит из молекулы дальне-красного флуоресцентного белка семейства GFP (SEQ ID NO:1, 2 или 3), оперативно соединенного через подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, с флуоресцентным белком iRFP с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра (SEQ ID NO:4). В некоторых воплощениях подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 или 7 (mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP или NiRFP-kasp-iRFP). В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор настоящего изобретения имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9, 10 или 11.

[046] Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, так же входят в рамки настоящего изобретения.

[047] В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше. Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты, и/или векторы, и/или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения.

[048] КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[049] Рисунок 1 иллюстрирует структуру биосенсоров настоящего изобретения и принцип их работы. Изображены флуоресцентные белки - донор и акцептор для FRET, разделенные содержащим последовательность DEVD линкером. Разрезание линкера каспазой 3 сопровождается исчезновением FRET.

[050] Рисунок 2А показывает спектр возбуждения флуоресценции mKate2-kasp-iRFP до и после добавления каспазы 3 при эмиссии при 740 нм.

[051] Рисунок 2Б показывает спектр возбуждения флуоресценции FP650-kasp-jrfp до и после добавления каспазы 3 при эмиссии при 740 нм.

[052] Рисунок 2В показывает спектр возбуждения флуоресценции NiRFP-kasp-iRFP до и после добавления каспазы 3 при эмиссии при 740 нм.

[053] Рисунок 3А показывает спектры эмиссии флуоресценции mKate2-kasp-iRFP при возбуждении при 550 нм до и после добавления каспазы 3.

[054] Рисунок 3Б показывает спектры эмиссии флуоресценции FP650-kasp-iRFP при возбуждении при 580 нм до и после добавления каспазы 3.

Рисунок 3В показывает спектры эмиссии флуоресценции NiRFP-kasp-iRFP при возбуждении при 590 нм до и после добавления каспазы 3.

[055] ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[056] Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.

[057] Как указано выше, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют флуоресцентные биосенсоры для измерения активности каспазы 3, аналитический сигнал которых представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра.

[058] Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 или 7. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.

[059] Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих различных приложениях и методах, в частности для мониторинга изменений активности каспазы 3 внутри клеток.

[060] Определения

[061] Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.

[062] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок» означает белок, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора. Как таковые флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.

[063] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок на основе GFP» означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.

[064] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра iRFP» или «iRFP» означает белок на основе бактериального фитохрома RpBphP2 из фотосинтетической бактерии Rhodopseudomonas palustris с максимумами поглощения и эмиссии 690 и 713 нм, обладающий аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:4.

[065] Как здесь используется, термин «каспаза» относится к белкам семейства внутриклеточных специфичных цистеиновых протеаз, вовлеченных в процесс апоптоза. Более предпочтительно, термин каспаза относится к эффекторным каспазам, более предпочтительно, к каспазе 3.

[066] Как здесь используется, термин «avGFP» относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей интенсивности флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).

[067] Как здесь используется, термин «Ферстеровский перенос энергии» (FRET) означает механизм переноса энергии между двумя хромофорами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором. При этом эффективность FRET может быть различной.

[068] Как здесь используется, термин «дальне-красный флуоресцентный белок» относится к белкам семейства GFP с максимумом эмиссии флуоресценции при длине волны более 630 нм, предпочтительно при длине волны более 650 нм, таким как белки Katushka, mKate2, eqFP650, NiRFP (eqFP670).

[069] Как здесь используется, термин «выделенный» или «изолированный» означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.

[070] Как здесь используется, термин «мутант» или «производное» относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены, и/или замещены, и/или удалены (делегированы), и/или вставлены (инвертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин «мутант» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант« здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.

[071] Термин «гомология» используется здесь для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

[072] Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности «по существу сходны» или «по существу такие же, как референсная последовательность», если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют, по крайней мере, 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны.

[073] Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, p.403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbj.nlm.njh.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.

[074] Как здесь используется, термин «подобные белки» или «по существу сходные белки» относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%). Длина гомологичных аминокислотных последовательностей у «подобных белков» при этом может составлять, по крайней мере, 100 аминокислотных остатков, чаще, по крайней мере, 200 аминокислотных остатков или 300 аминокислотных остатков.

[075] В некоторых воплощениях, термин «подобные белки» или «по существу сходные белки» относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).

[076] Как здесь используется, термин «функциональный» означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытани