Пневмококковая вакцина и ее применения

Пневмококковая вакцина и ее применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым пневмококковым вакцинам. Изобретение также относится к вакцинации субъектов, в частности субъектов с ослабленным иммунитетом, против пневмококковых инфекций с использованием указанных новых пневмококковых вакцин.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пневмококковые заболевания являются важной проблемой здравоохранения во всем мире. Инфекции, вызванные пневмококками, являются важной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Пневмония, фебрильная бактериемия и менингит являются наиболее частыми проявлениями инвазивного пневмококкового заболевания, в то время как распространение бактерий по дыхательным путям может приводить к инфекции среднего уха, синуситу или рецидивирующему бронхиту. По сравнению с инвазивным заболеванием неинвазивные проявления обычно менее тяжелые, но встречаются значительно чаще.

Несмотря на важность пневмококкового заболевания, информации об ущербе от заболевания, в частности в развивающихся странах, недостаточно. Это отчасти обусловлено неизбежной проблемой постановки этиологического диагноза в случаях пневмонии. Тем не менее, согласно доступным данным острые респираторные инфекции приводят к смерти приблизительно 2,6 миллиона детей младше пяти лет ежегодно. Пневмококк является причиной более 1 миллиона этих летальных исходов, большая часть из которых происходит в развивающихся странах, где пневмококк является, вероятно, наиболее важным патогеном у детей раннего возраста. В Европе и Соединенных Штатах пневмококковая пневмония является наиболее распространенной внебольничной бактериальной пневмонией, которая, согласно оценкам, поражает приблизительно 100 из 100000 взрослых ежегодно. Соответствующие цифры для фебрильной бактериемии и менингита составляют 15-19 на 100000 и 1-2 на 100000 соответственно. Риск одного или более чем одного из этих проявлений значительно выше у детей и пожилых людей, а также людей с ослабленным иммунитетом любого возраста. Даже в экономически развитых областях инвазивное пневмококковое заболевание приводит к высокой смертности; для взрослых показатель смертности от пневмококковой пневмонии составляет в среднем 10%-20%, в то же время он может превышать 50% в группах высокого риска. Общепризнанно, что пневмония является наиболее частой причиной смерти от пневмококковых заболеваний во всем мире.

Этиологический агент пневмококковых заболеваний, Streptococcus pneumoniae (пневмококк), является грамположительным инкапсулированным кокком, окруженным полисахаридной капсулой. Различия состава этой капсулы позволяют серологически различать приблизительно 90 капсульных типов, некоторые из которых часто связаны с пневмококковым заболеванием, другие - редко. Инвазивные пневмококковые инфекции включают пневмонию, менингит и фебрильную бактериемию; частыми неинвазивными проявлениями являются средний отит, синусит и бронхит.

Устойчивость пневмококков к основным антимикробным агентам, таким как пенициллины, цефалоспорины и макролиды, является серьезной и быстро растущей проблемой во всем мире.

Состояния, связанные с повышенным риском серьезного пневмококкового заболевания, включают детский и пожилой возраст (дети, пожилые люди) и ослабленный иммунитет по любой причине, включая, без ограничения, инфекцию, вызванную вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекцию), другие хронические вирусные инфекции, серповидно-клеточную анемию, диабет, рак и лечение рака, курение, хроническую органную недостаточность, трансплантацию органов и иммуносупрессивную терапию.

Недавнее развитие широко распространенной устойчивости микроорганизмов к основным антибиотикам и увеличивающееся число людей с ослабленным иммунитетом подчеркивают неотложную потребность в более эффективных пневмококковых вакцинах.

Некоторые недостатки современной вакцинации включают: необходимость нескольких введений для обеспечения защитного эффекта; задержку выработки защитных антител; распространенность людей, не отвечающих на вакцины (эта проблема особенно важна у индивидов с ослабленным иммунитетом); стоимость получения антигенов и изготовления вакцин, что является очень существенным ограничением при разработке новых конъюгированных пневмококковых вакцин; слабые защитные свойства антител с низкой аффинностью; снижение титров антител с течением времени.

Задачей новой пневмококковой вакцины по изобретению является по меньшей мере частичное преодоление некоторых из этих недостатков, в частности, с целью вакцинации субъектов с ослабленным иммунитетом против пневмококковых инфекций.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение направлено на новые пневмококковые вакцины, содержащие один или более чем один антиген полисахаридов пневмококков, конъюгированный с белком-носителем, в качестве антигена и агонист Toll-подобного рецептора-9 (TLR-9) в качестве адъюванта.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на применение пневмококковой вакцины, содержащей один или более чем один антиген полисахаридов пневмококков, конъюгированный с белком-носителем, в качестве антигена и агонист TLR-9 в качестве адъюванта, для вакцинации субъектов с ослабленным иммунитетом.

В одном аспекте изобретение направлено на любую пневмококковую вакцину, раскрытую здесь, для применения в вакцинации субъектов с ослабленным иммунитетом, предпочтительно любых субъектов с ослабленным иммунитетом, раскрытых здесь.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на применение любых пневмококковых вакцин, раскрытых здесь, для вакцинации субъектов с ослабленным иммунитетом, предпочтительно любых субъектов с ослабленным иммунитетом, раскрытых здесь.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на любые вакцины, раскрытые здесь, для предотвращения или лечения заболеваний, вызванных инфекцией S. pneumoniae, предпочтительно у субъекта с ослабленным иммунитетом.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ иммунизации субъекта, предпочтительно любых субъектов с ослабленным иммунитетом, раскрытых здесь, против заболеваний, вызванных инфекцией S. pneumoniae, включающий введение указанному субъекту иммунопротективной дозы любой вакцины, раскрытой здесь.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на применение любых вакцин, раскрытых здесь, для изготовления лекарственного средства для предотвращения или лечения заболеваний, вызванных инфекцией S. pneumoniae, предпочтительно у субъекта с ослабленным иммунитетом.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на любые пневмококковые вакцины, раскрытые здесь, и по меньшей мере один агонист TLR-9, раскрытый здесь.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на любые пневмококковые вакцины, раскрытые здесь, и по меньшей мере один агонист TLR-9, раскрытый здесь, для применения в вакцинации любых субъектов с ослабленным иммунитетом, раскрытых здесь.

Агонист Toll-подобного рецептора-9 (агонист TLR-9) по изобретению

В одном воплощении настоящего изобретения агонист TLR-9 для использования в настоящем изобретении представляет собой CpG-олигонуклеотид. CpG-олигонуклеотид при использовании здесь относится к иммуностимулирующему CpG-олигодезоксинуклеотиду (CpG ODN), и, соответственно, эти термины использованы взаимозаменяемо, если не указано иное. Иммуностимулирующие CpG-олигодезоксинуклеотиды содержат один или более чем один иммуностимулирующий CpG-мотив, представляющий собой неметилированный динуклеотид цитозин-гуанин, возможно в окружении определенных предпочтительных оснований. Состояние метилирования иммуностимулирующего CpG-мотива обычно относится к цитозиновому остатку динуклеотида. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид, представляет собой олигонуклеотид, который содержит 5'-неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3'-гуанином, и активирует иммунную систему посредством связывания с Toll-подобным рецептором-9 (TLR-9). В другом воплощении иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или более чем один метилированный CpG-динуклеотид, активирующий иммунную систему через TLR9, но не так сильно, как если бы CpG-мотив(ы) был(и) неметилированным(и). Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут содержать один или более чем один палиндром, который, в свою очередь, может охватывать CpG-динуклеотид. CpG-олигонуклеотиды описаны в нескольких выданных патентах, опубликованных заявках на патенты и других публикациях, включая патенты США №6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068.

Были идентифицированы различные классы иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов. Их называют классами А, В, С и Р, и они описаны более подробно ниже. Способы по изобретению включают применение иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов этих различных классов.

Олигонуклеотиды любого класса могут быть подвергнуты Е-модификации, усиливающей их активность. Е-модификация может представлять собой замещение 5'-концевого нуклеотида галогеном; примеры таких замещений включают, без ограничения, замещение бромуридином или йодуридином. Е-модификация может также включать замещение 5'-концевого нуклеотида этилуридином.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды «класса А» функционально характеризуются способностью индуцировать высокие уровни секреции интерферона-альфа (IFN-α) плазмацитоидными дендритными клетками (pDC) и индукцией активации естественных клеток-киллеров (NK-клеток) при минимальных эффектах на активацию В-клеток. Структурно, для этого класса типичны стабилизированные поли-С-последовательности на 5'- и 3'-концах. Он также имеет палиндромную последовательность с фосфодиэфирными связями, содержащую CpG-динуклеотиды, по меньшей мере из 6 нуклеотидов, например, но не обязательно, он содержит один из следующих гексамерных палиндромов: GACGTC, AGCGCT или AACGTT, описанных Yamamoto и коллегами. Yamamoto S et al. J. Immunol 148:4072-6 (1992). Класс А иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов и типичные последовательности этого класса были описаны в непредварительной заявке на патент США №09/672126 и опубликованной РСТ-заявке PCT/USOO/26527 (WO 01/22990), поданных 27 сентября 2000 г.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотид «класса А» по изобретению имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO:1).

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов класса А включают:

5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO:2); где * относится к фосфоротиоатной связи, и _ относится к фосфодиэфирной связи.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды «класса В» функционально характеризуются способностью активировать В-клетки и pDC, за исключением относительно слабой индукции IFN-α и активации NK-клеток. Структурно, олигонуклеотиды этого класса обычно могут быть полностью стабилизированы фосфоротиоатными связями, но они могут также иметь одну или более чем одну фосфодиэфирную связь, предпочтительно между цитозином и гуанином CpG-мотива (CpG-мотивов), в случае чего молекулу называют полумягкой («semi-soft»). В одном воплощении агонист TLR-9 для использования в настоящем изобретении представляет собой' CpG-олигонуклеотид класса В, представленный по меньшей мере формулой:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3', где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды. В одном воплощении Х₂ представляет собой аденин, гуанин или тимин. В другом воплощении Х₃ представляет собой цитозин, аденин или тимин.

В другом воплощении агонист TLR-9 для использования в настоящем изобретении представляет собой CpG-олигонуклеотид класса В, представленный по меньшей мере формулой:

5' N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂ 3', где X₁, X₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды, и N представляет собой любой нуклеотид, и N₁ и N₂ представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, каждая из которых состоит из приблизительно 0-25 N. В одном воплощении X₁X₂ представляет собой динуклеотид, выбранный из группы, состоящей из GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, ТрТ и TpG; и Х₃Х₄ представляет собой динуклеотид, выбранный из группы, состоящей из ТрТ, ApT, TpG, ApG, CpG, ТрС, АрС, СрС, TpA, ApA и CpA. Предпочтительно, X₁X₂ представляет собой GpA или GpT, и Х₃Х₄ представляет собой ТрТ. В других воплощениях X₁ или Х₂ либо X₁ и Х₂ представляют собой пурин, и Х₃ или Х₄ либо Х₃ и Х₄ представляют собой пиримидин, или X₁X₂ представляет собой GpA, и Х₃ или Х₄ либо Х₃ и Х₄ представляют собой пиримидин. В одном предпочтительном воплощении X₁X₂ представляет собой динуклеотид, выбранный из группы, состоящей из ТрА, АрА, АрС, ApG и GpG. В еще одном воплощении Х₃Х₄ представляет собой динуклеотид, выбранный из группы, состоящей из ТрТ, ТрА, TpG, АрА, ApG, GpA и СрА. В другом воплощении X₁X₂ представляет собой динуклеотид, выбранный из группы, состоящей из ТрТ, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT и CpG; Х₃ представляет собой нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из А и Т, и Х₄ представляет собой нуклеотид, но когда X₁X₂ представляет собой TpC, GpT или CpG, Х₃Х₄ не представляет собой TpC, ApT или АрС.

В другом предпочтительном воплощении CpG-олигонуклеотид имеет последовательность 5' TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄ 3'. В некоторых воплощениях CpG-олигонуклеотиды по изобретению содержат X₁X₂, выбранный из группы, состоящей из GpT, GpG, GpA и АрА, и Х₃Х₄, выбранный из группы, состоящей из ТрТ, CpT и TpC.

Последовательностями CpG-олигонуклеотидов класса В по изобретению являются последовательности, широко описанные выше, а также раскрытые в опубликованных РСТ-заявках на патенты PCT/US95/01570 и PCT/US97/19791 и в патентах США №6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068. Типичные последовательности включают, без ограничения, последовательности, раскрытые в этих последних заявках и патентах.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотид «класса В» по изобретению имеет следующую нуклеотидную последовательность:

5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO:3), или

5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO:4), или

5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO:5), или

5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO:6), или

5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO:7).

В любой из этих последовательностей все связи могут представлять собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении в любой из этих последовательностей одна или более чем одна связь может быть фосфодиэфирной, предпочтительно между «С» и «G» CpG-мотива, что делает CpG-олигонуклеотид полумягким. В любой из этих последовательностей 5' Т может быть замещен этилуридином или галогеном; примеры замещений галогенами включают, без ограничения, замещение бромуридином или йодуридином.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов класса В включают:

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO:8), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO:9), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO:10), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO:11), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO:12),

где * относится к фосфоротиоатной связи.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды «класса С» функционально характеризуются способностью активировать В-клетки и NK-клетки и индуцировать IFN-a. Структурно, олигонуклеотиды этого класса обычно содержат область с одним или более чем одним иммуностимулирующим CpG-мотивом типа класса В и палиндром или область, сходную с палиндромом, богатые GC, что позволяет молекулам формировать структуры вторичного (например, «стебель-петля») или третичного (например, димер) типа. Некоторые из этих олигонуклеотидов имеют как обычную «стимулирующую» CpG-последовательность, так и «мотив с высоким содержанием GC» или «мотив, нейтрализующий В-клетки». Эти олигонуклеотиды с комбинацией мотивов оказывают иммуностимулирующие эффекты, занимающие промежуточное положение между эффектами, связанными с обычными CpG-олигонуклеотидами класса В (то есть сильной индукцией активации В-клеток и активации дендритных клеток (DC)), и эффектами, связанными с CpG ODN класса А (то есть сильной индукцией IFN-α и активации NK-клеток при относительно слабой индукции активации В-клеток и DC). Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды класса С с комбинацией мотивов могут иметь полностью стабилизированные каркасы (например, когда все связи являются фосфоротиоатными), химерные каркасы (с фосфодиэфирными связями в центральной области) или полумягкие каркасы (например, с фосфодиэфирной связью в пределах CpG-мотива). Этот класс описан в заявке на патент США US 10/224523, поданной 19 августа 2002 г.

Один стимулирующий домен или мотив CpG-олигонуклеотида класса С определен формулой: 5' X₁DCGHX₂ 3'. D представляет собой нуклеотид, не являющийся С. С представляет собой цитозин. G представляет собой гуанин. Н представляет собой нуклеотид, не являющийся G. X₁ и Х₂ представляют собой любую нуклеотидную последовательность длиной 0-10 нуклеотидов. X₁ может содержать CG, в случае чего непосредственно перед этим CG предпочтительно присутствует Т. В некоторых воплощениях DCG представляет собой TCG. X₁ предпочтительно имеет длину 0-6 нуклеотидов. В некоторых воплощениях Х₂ не содержит никаких поли-G- или поли-А-мотивов. В других воплощениях иммуностимулирующий олигонуклеотид имеет поли-Т-последовательность на 5'-конце или на 3'-конце. При использовании здесь «поли-А» или «поли-Т» будет относиться к участку из четырех или более следующих друг за другом А или Т, соответственно, например 5" АААА 3" или 5" ТТТТ 3'. При использовании здесь «поли-С-конец» будет относиться к участку из четырех или более следующих друг за другом G, например 5" GGGG 3', расположенному на 5'-конце или 3'-конце нуклеиновой кислоты. При использовании здесь «поли-G-олигонуклеотид» будет относиться к олигонуклеотиду, имеющему формулу 5' X₁X₂GGGX₃X₄ 3', где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды, и предпочтительно по меньшей мере один из Х₃ и Х₄ представляет собой G. Некоторые предпочтительные варианты домена, стимулирующего В-клетки, имеющего такую формулу, включают TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT.

Второй мотив CpG-олигонуклеотида класса С называют Р или N, и он расположен сразу за X₁ ближе к 5'-концу или сразу за Х₂ ближе к 3'-концу.

N представляет собой последовательность, нейтрализующую В-клетки, начинающуюся тринуклеотидом CGG и имеющую длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. Мотив, нейтрализующий В-клетки, содержит по меньшей мере одну CpG-последовательность, в которой перед CG присутствует С или в которой после CG присутствует G (Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sd USA 95:12631-12636), или представляет собой CG-содержащую последовательность ДНК, в которой С пары CG метилирован. Нейтрализующие мотивы или последовательности имеют некоторую степень иммуностимулирующей способности, когда они присутствуют в мотиве, который без них не является стимулирующим, но когда они присутствуют в контексте других иммуностимулирующих мотивов, они снижают иммуностимулирующий потенциал других мотивов.

Р представляет собой палиндром с высоким содержанием GC, содержащий последовательность длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов.

При использовании здесь «палиндром» и, эквивалентно, «палиндромная последовательность» будут относиться к инвертированному повтору, то есть такой последовательности, как ABCDEE'D'C'B'A', где А и А', В и В', и так далее представляют собой основания, способные образовывать обычные пары оснований Уотсона-Крика.

При использовании здесь «палиндром с высоким содержанием GC» будет относиться к палиндрому, имеющему состав оснований, по меньшей мере на две трети представленный G и С. В некоторых воплощениях домен с высоким содержанием GC расположен предпочтительно ближе к 3'-концу от «домена, стимулирующего В-клетки». Таким образом, в случае палиндрома с высоким содержанием GC длиной 10 оснований палиндром содержит по меньшей мере 8 G и С. В случае палиндрома с высоким содержанием GC длиной 12 оснований палиндром также содержит по меньшей мере 8 G и С. В случае палиндрома с высоким содержанием GC длиной 14 оснований по меньшей мере десять оснований палиндрома представляют собой G и С. В некоторых воплощениях палиндром с высоким содержанием GC состоит исключительно из G и С.

В некоторых воплощениях палиндром с высоким содержанием GC имеет состав оснований, по меньшей мере на 81% представленный G и С. Таким образом, в случае такого палиндрома с высоким содержанием GC длиной 10 оснований палиндром состоит исключительно из G и С. В случае такого палиндрома с высоким содержанием GC длиной 12 оснований предпочтительно по меньшей мере десять оснований (83%) палиндрома представляют собой G и С. В некоторых предпочтительных воплощениях палиндром с высоким содержанием GC длиной 12 оснований состоит исключительно из G и С. В случае палиндрома с высоким содержанием GC длиной 14 оснований по меньшей мере двенадцать оснований (86%) палиндрома представляют собой G и С. В некоторых предпочтительных воплощениях палиндром с высоким содержанием GC длиной 14 оснований состоит исключительно из G и С. С-основания палиндрома с высоким содержанием GC могут быть неметилированными, или они могут быть метилированными.

Обычно этот домен имеет по меньшей мере 3 С и G, более предпочтительно 4 С и G и наиболее предпочтительно 5 или более С и G. В том, чтобы число С и G в этом домене было одинаковым, нет необходимости. Предпочтительно, С и G расположены таким образом, что они способны образовывать самокомплементарный дуплекс или палиндром, такой как CCGCGCGG. Эта последовательность может содержать А или Т, но предпочтительно самокомплементарность по меньшей мере частично сохранена, как, например, в мотивах CGACGTTCGTCG или CGGCGCCGTGCCG. Когда комплементарность не сохранена, предпочтительно некомплементарные пары оснований представляют собой TG. В предпочтительном воплощении присутствуют не более 3 расположенных друг за другом оснований, не являющихся частью палиндрома, предпочтительно не более 2 и наиболее предпочтительно только 1. В некоторых воплощениях палиндром с высоким содержанием GC включает по меньшей мере один тример CGG, по меньшей мере один тример CCG или по меньшей мере один тетрамер CGCG. В других воплощениях палиндром с высоким содержанием GC не является CCCCCCGGGGGG или GGGGGGCCCCCC, CCCCCGGGGG или GGGGGCCCCC.

По меньшей мере один G области с высоким содержанием GC может быть заменен на инозин (I). В некоторых воплощениях Р включает более чем один I.

В определенных воплощениях иммуностимулирующий олигонуклеотид имеет одну из следующих формул: 5' NX₁DCGHX₂ 3', 5' X₁DCGHX₂N 3', 5' PX₁DCGHX₂ 3', 5' X₁DCGHX₂P 3', 5' X₁DCGHX₂PX₃ 3', 5' X₁DCGHPX₃ 3', 5' DCGHX₂PX₃ 3', 5' TCGHX₂PX3 3', 5' DCGHPX₃ 3' или 5' DCGHP 3'.

Согласно изобретению предложены другие иммуностимулирующие олигонуклеотиды, определенные формулой 5' N₁PyGN₂P 3'. N₁ представляет собой любую последовательность длиной 1-6 нуклеотидов. Ру представляет собой пиримидин. G представляет собой гуанин. N₂ представляет собой любую последовательность длиной 0-30 нуклеотидов. Р представляет собой палиндром с высоким содержанием GC, содержащий последовательность длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов.

N₁ и N₂ могут содержать более чем 50% пиримидина и более предпочтительно более чем 50% Т. N₁ может включать CG, в случае чего непосредственно перед этим CG предпочтительно присутствует Т. В некоторых воплощениях N₁PyG представляет собой TCG и наиболее предпочтительно TCGN2, где N2 не является G.

N_iPyGN₂P может включать один или более чем один инозиновый (I) нуклеотид. С или G в N₁ могут быть заменены инозином, но CpI более предпочтителен, чем IpG. Для инозиновых замен, таких как IpG, оптимальная активность может быть достигнута с использованием «полумягкого» или химерного каркаса, где связь между IG или CI является фосфодиэфирной. N₁ может включать по меньшей мере один мотив CI, TCI, IG или TIG.

В определенных воплощениях N₁PyGN₂ представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT и TCGTCGT.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотиды «класса С» по изобретению имеют следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:13), или

5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:14), или

5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:15), или

5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:16), или

5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:17), или

5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:18), или

5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:19), или

5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO:20), или

5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:21), или

5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:22), или

5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3' (SEQ ID NO:23), или

5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3' (SEQ ID NO:24), или

5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEQ ID NO:25).

В любой из этих последовательностей все связи могут представлять собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении в любой из этих последовательностей одна или более чем одна связь может быть фосфодиэфирной, предпочтительно между «С» и «G» CpG-мотива, что делает CpG-олигонуклеотид полумягким.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов класса С включают:

5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:26), или

5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:27), или

5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:28), или

5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:29), или

5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:30), или

5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:31), или

5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:32), или

5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:33), или

5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:34), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:35), или

5' T*C*G*T*C*G*T*T*TT*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:36), или

5' T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:37), или

5' T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:38),

где * относится к фосфоротиоатной связи и _ относится к фосфодиэфирной связи.

В любой из этих последовательностей 5" Т может быть замещен этилуридином или галогеном; примеры замещений галогенами включают, без ограничения, замещение бромуридином или йодуридином.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды «класса Р» описаны в WO 2007/095316 и характеризуются тем фактом, что они содержат области, образующие дуплекс, такие как, например, полные или неполные палиндромы на обоих (5'- и 3'-) концах или близи обоих (5'- и 3'-) концов, что придает им способность образовывать структуры более высокого порядка, такие как конкатемеры. Эти олигонуклеотиды, называемые олигонуклеотидами класса Р, в некоторых случаях обладают способностью индуцировать значительно более высокие уровни секреции IFN-α, чем олигонуклеотиды класса С. Олигонуклеотиды класса Р обладают способностью к спонтанной самосборке с образованием конкатемеров in vitro и/или in vivo. Без связи с конкретной теорией механизма действия этих молекул одна возможная гипотеза состоит в том, что это свойство придает олигонуклеотидам класса Р большую способность к перекрестному связыванию с TLR9 внутри определенных иммунокомпетентных клеток, индуцируя паттерн иммунной активации, отличающийся от описанных ранее классов CpG-олигонуклеотидов.

В одном воплощении агонист TLR-9 для использования в настоящем изобретении представляет собой CpG-олигонуклеотид класса Р, содержащий 5'-домен, активирующий TLR, и по меньшей мере две палиндромные области, одна из которых представляет собой 5'-палиндромную область длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов и связана с 3'-палиндромной областью длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов либо непосредственно, либо через спейсер, где олигонуклеотид включает по меньшей мере один YpR-динуклеотид. В одном воплощении указанный олигонуклеотид не является T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO:27). В одном воплощении CpG-олигонуклеотид класса Р включает по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид. В другом воплощении домен, активирующий TLR, представляет собой TCG; TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT или TTTT. В еще одном воплощении домен, активирующий TLR, расположен в 5'-палиндромной области. В другом воплощении домен, активирующий TLR, расположен непосредственно за 5'-палиндромной областью, ближе к 5'-концу. В еще одном воплощении 5'-палиндромная область имеет длину по меньшей мере 8 нуклеотидов. В другом воплощении 3'-палиндромная область имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. В другом воплощении 5'-палиндромная область имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. В еще одном воплощении 3'-палиндромная область включает неметилированный CpG-динуклеотид. В другом воплощении 3'-палиндромная область включает два неметилированных CpG-динуклеотида. В другом воплощении 5'-палиндромная область включает неметилированный CpG-динуклеотид. В еще одном воплощении 5'-палиндромная область включает два неметилированных CpG-динуклеотида. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 25. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 30. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 35. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 40. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 45. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 50. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 55. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 60. В другом воплощении 5'- и 3'-палиндромные области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 65.

В одном воплощении две палиндромные области соединены непосредственно. В другом воплощении две палиндромные области соединены 3'-3'-связью. В другом воплощении две палиндромные области перекрываются на один нуклеотид. В еще одном воплощении две палиндромные области перекрываются на два нуклеотида. В другом воплощении две палиндромные области не перекрываются. В другом воплощении две палиндромные области соединены спейсером. В одном воплощении спейсер представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую длину 1-50 нуклеотидов. В другом воплощении спейсер представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую длину 1 нуклеотид. В другом воплощении спейсер представляет собой ненуклеотидный спейсер. В одном воплощении ненуклеотидный спейсер представляет собой D-спейсер. В другом воплощении ненуклеотидный спейсер представляет собой линкер. В одном воплощении олигонуклеотид имеет формулу 5' XP₁SP₂T 3', где X представляет собой домен, активирующий TLR, P₁ представляет собой палиндром, S представляет собой спейсер, Р₂ представляет собой палиндром и Т представляет собой 3'-хвост длиной 0-100 нуклеотидов. В одном воплощении Х представляет собой TCG, TTCG или TTTCG. В другом воплощении Т имеет длину 5-50 нуклеотидов. В еще одном воплощении Т имеет длину 5-10 нуклеотидов. В одном воплощении S представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую длину 1-50 нуклеотидов. В другом воплощении S представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую длину 1 нуклеотид. В другом воплощении S представляет собой ненуклеотидный спейсер. В одном воплощении ненуклеотидный спейсер представляет собой D-спейсер. В другом воплощении ненуклеотидный спейсер представляет собой линкер. В другом воплощении олигонуклеотид не является антисмысловым олигонуклеотидом или рибозимом. В одном воплощении Pi имеет высокое содержание А и Т. В другом воплощении P₁ включает по меньшей мере 4 Т. В другом воплощении Р₂ представляет собой полный палиндром. В другом воплощении Р₂ имеет высокое содержание G-C. В еще одном воплощении Р₂ представляет собой CGGCGCX₁GCGCCG, где X₁ представляет собой Т или отсутствует.

В одном воплощении олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь. В другом воплощении все межнуклеотидные связи олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении олигонуклеотид включает по меньшей мере одну связь, подобную фосфодиэфирной. В другом воплощении связь, подобная фосфодиэфирной, представляет собой фосфодиэфирную связь. В другом воплощении с олигонуклеотидом конъюгирована липофильная группа. В одном воплощении липофильная группа представляет собой холестерин.

В одном воплощении агонист TLR-9 для использования в настоящем изобретении представляет собой CpG-олигонуклеотид класса Р с 5'-доменом, активирующим TLR, и по меньшей мере двумя комплементарность-содержащими областями, 5'- и 3'-комплементарность-содержащей областью, каждая из которых имеет длину по меньшей мере 8 нуклеотидов и связана с другой либо непосредственно, либо через спейсер, где олигонуклеотид включает по меньшей мере один пиримидин-пуриновый динуклеотид (YpR-динуклеотид) и где по меньшей мере одна из комплементарность-содержащих областей не является полным палиндромом. В одном воплощении олигонуклеотид включает по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид. В другом воплощении домен, активирующий TLR, представляет собой TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT или TTTT. В другом воплощении домен, активирующий TLR, расположен в 5'-комплементарность-содержащей области. В другом воплощении домен, активирующий TLR, расположен непосредственно за 5'-комплементарность-содержащей областью, ближе к 5'-концу. В другом воплощении 3'-комплементарность-содержащая область имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. В еще одном воплощении 5'-комплементарность-содержащая область имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. В одном воплощении S'-комплементарность-содержащая область включает неметилированный CpG-динуклеотид. В другом воплощении 3'-комплементарность-содержащая область включает два неметилированных CpG-динуклеотида. В еще одном воплощении 5'-комплементарность-содержащая область включает неметилированный CpG-динуклеотид. В другом воплощении 5'-комплементарность-содержащая область включает два неметилированных CpG-динуклеотида. В другом воплощении комплементарность-содержащие области включают по меньшей мере один аналог нуклеотидов. В другом воплощении комплементарность-содержащие области образуют внутримолекулярный дуплекс. В одном воплощении внутримолекулярный дуплекс включает по меньшей мере одну пару оснований, не являющуюся парой оснований Уотсона-Крика. В другом воплощении пара оснований, не являющаяся парой оснований Уотсона-Крика, представляет собой G-T, G-A, G-G или С-А. В одном воплощении комплементарность-содержащие области образуют межмолекулярные дуплексы. В одном воплощении по меньшей мере один межмолекулярный дуплекс включает по меньшей мере одну пару оснований, не являющуюся парой оснований Уотсона-Крика. В другом воплощении пара оснований, не являющаяся парой оснований Уотсона-Крика, представляет собой G-T, G-A, G-G или С-А. В еще одном воплощении комплементарность-содержащие области содержат ошибочное спаривание. В еще одном воплощении комплементарность-содержащие области содержат два ошибочных спаривания. В другом воплощении комплементарность-содержащие области содержат промежуточный нуклеотид. В другом воплощении комплементарность-содержащие области содержат два промежуточных нуклеотида.

В одном воплощении 5'- и 3'-комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 25. В другом воплощении 5'- и 3'-комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 30. В другом воплощении 5'- и 3'-комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 35. В другом воплощении комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 40. В другом воплощении комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 45. В другом воплощении комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 50. В другом воплощении комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 55. В другом воплощении комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 60. В другом воплощении комплементарность-содержащие области имеют показатель устойчивости дуплекса по меньшей мере 65.

В другом воплощении две комплементарность-содержащие области соединены непосредственно. В другом