Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах

Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам, в которых используются композиции, содержащие по меньшей мере один термолизин-подобный нейтральный фермент протеазу, обладающий повышенной стабильностью при хранении и/или повышенной каталитической активностью, а также к указанным композициям. В некоторых вариантах изобретения, термолизин применяется для очистки и в других целях, требующих использования детергентов. В некоторых своих особенно предпочтительных вариантах, настоящее изобретение относится к способам, в которых используются термолизин-содержащие композиции, полученные или сконструированные в целях предотвращения индуцированной детергентом инактивации, а также к указанным композициям.

Предшествующий уровень техники

Бациллы (Bacilli) представляют собой грамположительные бактерии, секретирующие ряд применяемых в промышленности ферментов, которые с минимальными затратами могут быть продуцированы в больших объемах путем ферментации. Примерами секретируемых бациллами ферментов являются: сериновая протеаза субтилизин, цинк-содержащие нейтральные протеазы, альфа-амилазы и целлюлазы. Протеазы Bacillus широко применяются в текстильной промышленности, в производстве стиральных порошков и моющих средств, используемых в домашнем хозяйстве (Galante, Current Organic Chemistry, 7:1399-1422, 2003; and Showell, Handbook of Detergents, Part D: Formulation, Hubbard (ed.), NY: Taylor and Francis Group, 2006). Для высокоэффективного удаления окрашивающих веществ и пятен из белья, подвергаемого стирке, требуются протеазы. Однако жидкие препараты, включающие очищающие и моющие средства, обычно содержат модифицирующие добавки, поверхностно-активные вещества и вещества, образующие хелатные комплексы с металлами, которые обладают дестабилизирующим действием на большинство протеаз.

Детергенты и другие очищающие композиции обычно включают сложную комбинацию активных ингредиентов. Так, например, большинство очищающих продуктов включает систему поверхностно-активных веществ, ферменты для очистки, отбеливатели, модифицирующие добавки, ингибиторы образования мыльной пены, грязь-суспендирующие агенты, грязеотталкивающие агенты, оптические отбеливатели, мягчители, диспергирующие вещества, соединения, ингибирующие перенос красителя, абразивы, бактерициды и отдушки. Несмотря на сложный состав используемых в настоящее время детергентов, существуют множество красителей, которые трудно удалить полностью. Кроме того, часто образуется стойкий остаток, который приводит к изменению цвета (например, к пожелтению) и к ухудшению внешнего вида, вызываемому неполной очисткой. В последнее время, эти проблемы осложняются все возрастающим применением стирки при низких температурах (например, холодной водой) и более короткими циклами стирки. Кроме того, многие пятна состоят из сложных смесей волокнистых материалов, включающих, главным образом, углеводы и производные углеводов, волокно и компоненты клеточных стенок (например, растительный материал, компоненты древесины, грязь, содержащая почву/глину, и компоненты плодов). Присутствие таких пятен создает значительные трудности для приготовления и применения очищающих композиций.

Кроме того, цветная одежда быстрее изнашивается и теряет свой внешний вид. Часть ее окраски теряется в процессе стирки, а в частности, в процессе стирки в стиральных машинах и машинной сушки. Кроме того, очевидно, что потеря прочности при растяжении ткани является неизбежным результатом механического или химического действия, обусловленного ноской, изнашиванием и/или стиркой и сушкой. Таким образом, необходимо разработать средство для действенной и эффективной стирки цветной одежды, которая как минимум не ухудшала бы ее внешний вид.

В целом, несмотря на успехи в производстве очищающих композиций, необходимость в получении детергентов, которые обладали бы способностью удалять пятна, сохранять цвет ткани и ее внешний вид, а также предотвращать потерю окраски, остается актуальной. Кроме того, существует также необходимость в получении моющего средства и/или композиций по уходу за тканью, которые обеспечивали бы и/или сохраняли бы прочность ткани при растяжении, предохраняли бы ткань от образования складок и вздутий и/или от ее усадки, а также придавали ткани антистатические свойства и мягкость, сохраняли бы желаемый цвет ткани и придавали бы ей износостойкость и другие ценные свойства. В частности, необходимость в создании композиций, способных к удалению окрашивающих компонентов пятен, которые часто сохраняются на ткани после стирки, остается актуальной. Кроме того, необходимо также разработать более эффективные методы и композиции, которые могут быть использованы для отбеливания текстильных изделий.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам, в которых используются композиции, содержащие по меньшей мере один термолизин-подобный нейтральный фермент протеазу, обладающий повышенной стабильностью при хранении и/или повышенной каталитической активностью, а также к указанным композициям. В некоторых вариантах изобретения, термолизин применяется для очистки и в других целях, требующих использования детергентов. В некоторых своих особенно предпочтительных вариантах, настоящее изобретение относится к способам, в которых используются термолизин-содержащие композиции, полученные или сконструированные в целях предотвращения индуцированной детергентом инактивации, а также к указанным композициям.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим выделенный термолизин и ингибитор нейтральной металлопротеазы, где указанным термолизином является термолизин Geobacillus или термолизин Bacillus. В некоторых вариантах изобретения, композиции согласно изобретению включают выделенный термолизин и ингибитор нейтральной металлопротеазы, выбранный из фосфорамидона и галардина. В некоторых вариантах изобретения, термолизином композиций согласно изобретению является термолизин G. caldoproteolyticus или G. stearothermophilus, а в других вариантах изобретения, термолизином композиций согласно изобретению является термолизин B. thermoproteolyticus. В некоторых конкретных вариантах изобретения, композиции согласно изобретению содержат термолизин, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 50% (50-100%, а предпочтительно, по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична аминокислотной последовательности термолизина, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3. В некоторых других вариантах изобретения, композиции согласно изобретению содержат термолизин, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3. В других вариантах изобретения, композиции согласно изобретению содержат термолизин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному варианту термолизина, обладающему повышенной стабильностью и/или эффективностью. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения, вариантом термолизина является вариант термолизина Geobacillus, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к выделенному варианту термолизина Geobacillus, имеющему аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и обладающему повышенной стабильностью и/или эффективностью. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3.

В некоторых других своих вариантах, настоящее изобретение относится к варианту термолизина, содержащему одну или несколько замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2, и обладающему повышенной стабильностью и/или эффективностью. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, AO58P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному варианту термолизина, обладающему повышенной стабильностью и/или эффективностью по сравнению с термолизином Geobacillus sp. дикого типа (например, термолизином, содержащим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3). В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к выделенному варианту термолизина, обладающему улучшенными свойствами, включающими одно или несколько таких свойств, как повышенная термостабильность, повышенная эффективность при более низком или более высоком рН, и повышенная аутолитическая стабильность.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам Bacillus sp., трансформированным полинуклеотидом, кодирующим вариант термолизина, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 50-99% (по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования фермента, обладающего активностью термолизина, где указанные способы включают: (i) трансформацию клетки-хозяина экспрессионным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант термолизина, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 50-99% (по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична аминокислотной последовательности термолизина, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и (ii) культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования термолизина. Способ согласно изобретению также включает, но необязательно, сбор полученного термолизина. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам продуцирования фермента, обладающего активностью термолизина, где указанный способ включает (i) трансформацию клетки-хозяина экспрессионным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант термолизина, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности термолизина, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и (ii) культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования термолизина. Указанные способы также включают, но необязательно, стадию сбора полученного термолизина. В некоторых других своих вариантах, настоящее изобретение относится к способу продуцирования фермента, обладающего активностью термолизина, где указанный способ включает (i) трансформацию клетки-хозяина Bacillus sp. (например, B. subtilis) экспрессионным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант термолизина, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 50-99% (по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентична аминокислотной последовательности термолизина, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и (ii) культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования термолизина. Указанные способы также включают, но необязательно, стадию сбора полученного термолизина.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере один вариант термолизина, полученный из рекомбинантной клетки-хозяина Bacillus sp. согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция, содержащая по меньшей мере один вариант термолизина, также содержит по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка. В некоторых альтернативных вариантах изобретения, указанная композиция, содержащая по меньшей мере один вариант термолизина, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, композиции, содержащие по меньшей мере один вариант термолизина, содержат по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой из перечисленных выше стабилизаторов может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых других вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества.

В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции, включающей по меньшей мере один вариант термолизина, полученный из рекомбинантной клетки-хозяина Bacillus sp. согласно изобретению, в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным ферментом или производным фермента, выбранным из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз. В некоторых вариантах изобретения, композиция, содержащая по меньшей мере один вариант термолизина и по меньшей мере один дополнительный фермент или производное фермента, выбранные из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, композиции, включающие по меньшей мере один вариант термолизина, содержат по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой из вышеупомянутых стабилизаторов может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В подварианте этих вариантов, стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых других вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к очищающей композиции, содержащей по меньшей мере один вариант термолизина, полученный из рекомбинантной клетки-хозяина Bacillus sp. согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, очищающая композиция, включающая по меньшей мере один вариант термолизина, дополнительно включает по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка. В некоторых альтернативных вариантах изобретения, очищающая композиция, включающая по меньшей мере один вариант термолизина, дополнительно включает по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов изобретения, указанный стабилизатор выбирают из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, стабилизирующий указанный термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, очищающие композиции, включающие по меньшей мере один вариант термолизина, содержат по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой один из стабилизаторов, упоминаемых выше, может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В некоторых вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере конкурентный ингибитор, стабилизирующий термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества.

В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к очищающей композиции, включающей по меньшей мере один вариант термолизина, полученный из рекомбинантной клетки-хозяина Bacillus sp. согласно изобретению, в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным ферментом или производным фермента, выбранными из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз. В некоторых вариантах изобретения, очищающая композиция, содержащая по меньшей мере один вариант термолизина и по меньшей мере один дополнительный фермент или производное фермента, выбранное из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, очищающие композиции, включающие по меньшей мере один вариант термолизина, содержат по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой из вышеупомянутых стабилизаторов может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В подварианте этих вариантов, стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых других вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, стабилизирующий термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью. В некоторых вариантах изобретения, композиция, включающая выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, также содержит по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка. В некоторых альтернативных вариантах изобретения, композиция, содержащая выделенные варианты термолизина, обладающие повышенной стабильностью и/или эффективностью, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов изобретения, указанный стабилизатор выбирают из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, стабилизирующий указанный термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, композиции, включающие выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, содержат по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой один из вышеупомянутых стабилизаторов может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В подварианте этих вариантов изобретения, указанный стабилизатор выбирают из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых других вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере конкурентный ингибитор, стабилизирующий термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах изобретения, вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, представляет собой вариант термолизина Geobacillus, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к выделенному варианту термолизина Geobacillus, имеющему аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и обладающему повышенной стабильностью и/или эффективностью. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В некоторых других вариантах изобретения, вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, содержит одну или несколько замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2.

В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции, включающей выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным ферментом или производным фермента, выбранным из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз. В некоторых вариантах изобретения, композиция, содержащая выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, и по меньшей мере один дополнительный фермент или производное фермента, выбранные из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, композиции, включающие выделенные варианты термолизина, обладающие повышенной стабильностью и/или эффективностью, содержат по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой из вышеупомянутых стабилизаторов может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых других вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, который стабилизирует термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах изобретения, вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, представляет собой вариант термолизина Geobacillus, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к выделенному варианту термолизина Geobacillus, имеющему аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и обладающему повышенной стабильностью и/или эффективностью. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В некоторых других вариантах изобретения, вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, содержит одну или несколько замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151 S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к очищающим композициям, содержащим выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью. В некоторых вариантах изобретения, очищающая композиция, включающая выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, также содержит по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка. В некоторых альтернативных вариантах изобретения, очищающая композиция, содержащая выделенный вариант термолизина, обладающие повышенной стабильностью и/или эффективностью, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов изобретения, указанный стабилизатор выбирают из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, стабилизирующий указанный термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. Альтернативно, очищающая композиция, включающая выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, содержит по меньшей мере один ион кальция и/или ион цинка в комбинации по меньшей мере с одним стабилизатором. Любой один из вышеупомянутых стабилизаторов может быть объединен по меньшей мере с одним ионом кальция и/или ионом цинка с получением композиций, содержащих по меньшей мере один вариант термолизина. В подварианте этих вариантов изобретения, указанный стабилизатор выбирают из буры, глицерина, ионов цинка, ионов кальция и формиата кальция. В некоторых других вариантах изобретения, указанным стабилизатором является по меньшей мере один конкурентный ингибитор, стабилизирующий термолизин в присутствии анионогенного поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах изобретения, вариант термолизина, содержащийся в очищающих композициях и обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, представляет собой вариант термолизина Geobacillus, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278 и 280 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В других вариантах изобретения, вариант термолизина, содержащийся в очищающих композициях и обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, представляет собой вариант термолизина Geobacillus, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен в положениях, выбранных из положений, эквивалентных положениям 4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 и 297 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. В некоторых других вариантах изобретения, вариант термолизина, содержащийся в очищающих композициях и обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, представляет собой вариант термолизина Geobacillus, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151 W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2. В подварианте этих вариантов, одной или несколькими заменами являются одна, две, три, четыре или пять замен, выбранных из группы замен T006G, T006H, T006I, T006K, T006M, T006N, T006P, T006Q, T006R, T006V, T006W, T006Y, V007F, V007H, V007K, V007L, V007M, V007P, V007Q, V007R, V007T, V007Y, T049G, T049H, T049I, T049K, T049L, T049N, T049P, T049Q, T049W, A058I, A058P, A058R, F063I, F063L, F063P, S065K, S065Y, Y075G, Y075M, Y075T, Q128H, Q128I, Q128L, Q128M, Q128V, Q128Y, Y151D, Y151E, Y151H, Y151K, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151T, Y151V, Y151W, I156M, I156R, I156T, I156W, G196R, Q273I, Q273P, Q273Y, T278K, T278M, T278P, N280K, N280R, T006A, T006C, T049D, T049I, T049L, T049M, T049N, T049S, A056C, A056R, A056Y, A058S, S065C, S065E, S065I, S065T, S065V, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151D, Y151E, Y151H, Y151M, Y151N, Y151Q, Y151R, Y151 S, Y151T, Y151V, Y151W, I156E, I156H, I156K, I156M, I156R, I156T, I156W, G196D, G196H, Q273A, Q273N, Q273T, Q273W, Q273Y, T278C, T278H, T278M, T278N, T278S, T278Y, N280E, N280I, N280L, N280M, N280S, T006C, T049D, T049N, T049Q, T049S, A056C, A056E, A058C, A058E, Q061E, Q061M, S065C, S065D, S065E, S065P, S065V, S065W, S065Y, Q128C, Q128I, Q128M, Q128T, Q128V, Q128Y, Y151A, Y151C, Y151N, Y151S, Y151T и I156E, перечисленных в таблицах 7-1, 8-1 и 8-2.

В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к очищающей композиции, включающей выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным ферментом или производным фермента, выбранным из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз. В некоторых вариантах изобретения, очищающая композиция, содержащая выделенный вариант термолизина, обладающий повышенной стабильностью и/или эффективностью, и по меньшей мере один дополнительный фермент или производное фермента, выбранные из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз, также содержит по меньшей мере один стабилизатор. В подварианте этих вариантов, указанный стабилизатор выбран