Онколитический аденовирус для лечения рака, его применение и фармацевтическая композиция, содержащая его

Онколитический аденовирус для лечения рака, его применение и фармацевтическая композиция, содержащая его

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины, в частности к области онкологии, а именно к виротерапии.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время лечение рака основывается, главным образом, на химиотерапии, лучевой терапии и хирургии. Несмотря на высокую степень успеха при лечении рака на ранних стадиях, наиболее продвинутые случаи рака являются неизлечимыми, поскольку они не могут быть удалены хирургическим путем или потому что дозы вводимых радио- или химиотерапевтических веществ ограничены в силу их токсичности по отношению к нормальным клеткам. Для смягчения этой ситуации были разработаны биотехнологические подходы с целью повышения эффективности и избирательности лечения онкологических заболеваний. Среди них генная терапия и виротерапии используют вирусы в терапевтических целях против рака. В генной терапии вирус модифицируют для предотвращения его репликации и для применения в качестве средства доставки или в целях использования в качестве вектора для терапевтического генетического материала. Наоборот, в виротерапии используют вирус, который реплицируется и размножается избирательно в опухолевых клетках. При виротерапии опухолевые клетки погибают вследствие цитопатического эффекта, вызываемого репликацией вируса внутри них, а не за счет терапевтического гена. Преимущественная репликация в опухолевой клетке называется онкотропизмом, а лизис опухоли называется онколизом. В строгом смысле, вирусы, которые избирательно реплицируются в опухолях, называются онколитическими, хотя в более широком смысле слово «онколитический» можно применять к любому репликационно-компетентному вирусу, способному лизировать клетки опухоли, даже без избирательности. В этом описании термин «онколитический» используется в обоих смыслах.

Виротерапия рака предшествует генной терапии. Первые исследования по лечению опухолей вирусами относятся к началу прошлого века. В 1912 De Pace добился регрессий опухолей после введения вируса бешенства в цервикальные карциномы. С тех пор в опухоли для их лечения вводили многие виды вирусов. Существуют вирусы, которые отображают природный онкотропизм, такие как автономный парвовирус, вирус везикулярного стоматита и реовирус. Другими вирусами для избирательной репликации в опухолях можно манипулировать генетически. Например, вирус простого герпеса (ВПГ) становится онкотропным в результате элиминации гена рибонуклеотидредуктазы, не являющейся необходимой ферментативной активностью в активно размножающихся клетках, таких как клетки опухоли. При этом аденовирус, вследствие его низкой патогенности и высокой способности инфицировать клетки опухоли, является вирусом, чаще используемом в виротерапии и в генной терапии рака.

Пятьдесят один серотип аденовируса человека был идентифицирован и систематизирован в 6 различных групп от A до F.

Аденовирус человека типа 5 (Ad5), который принадлежит к группе C, представляет собой вирус, образованный белковым икосаэдрическим капсидом, в который упакована линейная ДНК длиной 36 тысяч пар нуклеотидов. У взрослых инфекция Ad5 обычно протекает бессимптомно, а у детей она вызывает насморк и конъюнктивит. Обычно Ad5 поражает эпителиальные клетки, которые в ходе естественной инфекции представляют собой клетки эпителия бронхов. Он попадает в клетку путем взаимодействия волокна, вирусного белка, который вытягивается как антенна из двенадцати вершин капсида, с клеточным белком, участвующим в межклеточной адгезии, который называется аденовирусным рецептором Коксаки (CAR). При попадании вирусной ДНК внутрь ядра начинается упорядоченная транскрипция ранних генов (с E1 по E4) вируса. Первые экспрессируемые вирусные гены представляют собой гены ранней области 1А (Е1А). Е1А связывается с клеточным белком Rb для высвобождения E2F, который активирует транскрипцию других вирусных генов, таких как E2, E3 и E4, и клеточных генов, которые активируют клеточный цикл. С другой стороны, Е1В связывается с р53 для активации клеточного цикла и предотвращения апоптоза инфицированных клеток. E2 кодирует белки, участвующие в репликации вируса; E3 кодирует белки, которые подавляют противовирусный иммунный ответ; E4 кодирует белки, участвующие в транспорте вирусной РНК. Экспрессия ранних генов приводит к репликации вирусной ДНК, и после того, как ДНК реплицировалась, активизируется главный поздний промотор и запускает транскрипцию матричной РНК, которая после дифференциального сплайсинга образует все РНК, кодирующие структурные белки, которые формируют капсид.

Существует два важных для рассмотрения аспекта применительно к разработке онколитических аденовирусов: избирательность и активность. Для того чтобы добиться избирательности в отношении опухолевых клеток, были использованы три стратегии: элиминация вирусных функций, необходимых для репликации в нормальных клетках, но не являющихся необходимыми в опухолевых клетках; контроль вирусных генов, которые запускают репликацию с помощью промоторов, избирательно действующих в опухолях; и модификация капсидных белков вируса, имеющих значение при инфицировании клетки-хозяина. С такими генетическими модификациями можно достичь значительного уровня избирательности, с эффективностью репликации в опухолевых клетках, в 10000 раз превышающей эффективность репликации в нормальных клетках. В отношении онколитической активности, для ее увеличения было описано несколько генетических модификаций. Эти изменения включают: a) увеличение высвобождения вирусов, например, путем элиминации E1B19K, суперэкспрессии E3-11.6K (ADP) или локализации белка E3/19K в плазматической мембране; и b) встраивание терапевтического гена в геном онколитического аденовируса для образования «заряженного онколитического аденовируса». В этом случае терапевтический ген мог бы опосредовать гибель неинфицированных опухолевых клеток путем активации пролекарства с наблюдательным действием (то есть можно сказать, что уничтожает неинфицированные соседние клетки), активацию иммунной системы в отношении опухоли, индукцию апоптоза, подавление ангиогенеза или элиминацию внеклеточного матрикса, среди прочего. В этих случаях способ и время экспрессии терапевтического гена будут иметь решающее значение для конечного результата терапевтического подхода.

В последнее десятилетие пациентам с карциномами головы и шеи, яичника, толстой и прямой кишки, поджелудочной железы и со злокачественной гепатомой, среди прочих, вводили различные онколитические аденовирусы. Профиль безопасности этих аденовирусов в клинических исследованиях был весьма многообещающим. Обнаруженные побочные эффекты, такие как симптомы гриппа и повышение уровней трансаминаз, хорошо переносились даже после системного введения высоких доз вируса (см. D. Ко et al., «Development of transcriptionally regulated oncolytic 25 adenoviruses», Oncogene 2005, vol. 24, pp. 7763-74; и T. Reid et al., «adenoviral Intravascular agents in cancer patients: lessons from clinical trials», Cancer Gene Therapy 2002, vol. 9, pp. 979-86). Хотя введение рекомбинантного аденовируса индуцировало частичное подавление роста опухоли, полная эрадикация опухолей не была достигнута, и через короткий промежуток времени опухоли снова быстро росли. Такие результаты, вероятно, имели место потому, что введенный аденовирус распределялся лишь по небольшой части опухоли, производя ограниченный противоопухолевый ответ, поскольку неинфицированные клетки продолжали быстро расти. В недавней работе было отмечено, что репликация онколитических аденовирусов в ксенотрансплантатных опухолях человека продолжалась в течение от 35 до 100 дней после системного введения, хотя эта репликация не приводила к полной эрадикации опухоли (см. H. Sauthoff et al., «intratumoural spread of wild-type adenovirus is limited to after local injection of human xenograft tumours: virus persists and spreads systemically at late time points», Human Gene Therapy 2003, vol. 14, pp. 425-33). Такая низкая противоопухолевая эффективность имеет место отчасти потому, что соединительная ткань и внеклеточный матрикс (ECM) в опухоли препятствуют распространению аденовируса внутри опухоли.

Эта проблема эффективного распространения онколитических аденовирусов в массе опухоли также была описана для других противоопухолевых средств, таких как доксорубицин, таксол, винкристин или метотрексат. Многие исследования свидетельствуют о роли ЕСМ в устойчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам (см. BP Toole et al., «Hyaluronan: a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells», Seminars in Cancer Biology 2008, vol. 18, pp. 244-50). Опухолевые и стромальные клетки продуцируют и образуют матрикс из коллагена, протеогликанов и других молекул, который затрудняет транспорт макромолекул внутри опухоли. Гиалуроновая кислота (НА) является одним из основных компонентов ECM, вовлеченных в устойчивость опухолевых клеток к терапевтическим препаратам. НА сверхэкспрессируется в самых различных злокачественных тканях, и во многих случаях уровень НА является фактором прогноза прогрессирования опухоли. Взаимодействие НА с рецепторами CD44 и RHAMM увеличивает выживаемость опухоли и инвазию. Кроме того, НА может индуцировать опухолевые метастазы, вызывая клеточную адгезию и миграцию, и защиту от иммунной системы.

С другой стороны, ингибирование взаимодействия между гиалуроновой кислотой и опухолевыми клетками возвращает устойчивость ко многим препаратам. Различные исследования показали, что гиалуронидазы (ферменты, вызывающие деградацию НА) усиливают действие различных химиотерапий у пациентов с меланомой, саркомой Капоши, опухолями головы и шеи, метастазами печени и карциномой толстой кишки. Механизм действия гиалуронидаз до сих пор неизвестен, но, как правило, это связано с уменьшением барьеров клеточной адгезии, уменьшением внутритканевого давления и улучшением проникновения противоопухолевого препарата в опухоль, а не с его ингибирующим эффектом на сигнальный путь, связанный с клеточной выживаемостью.

В последнее время было описано, что совместное введение гиалуронидазы и онколитических аденовирусов при помощи внутриопухолевой инъекции уменьшает прогрессирование опухоли (см. S. Ganesh et al., «Intratumoural coadministration of hyaluronidaseenzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency inmestastasic tumour models», Clin Cancer Res 2008, vol. 14, pp. 3933-41). В этих исследованиях онколитические аденовирусы вводят четырьмя внутриопухолевыми инъекциями и гиалуронидазу вводят внутриопухолево во все другие дни в течение всего лечения. Этот режим введения имеет небольшое применение у пациентов, поскольку большинство опухолей являются недоступными для внутриопухолевого инъецирования. Лечение, предложенное Ганеш с соавторами, может не принести пользы пациентам с рассредоточенным заболеванием (метастазами).

Несмотря на эти усилия, в настоящее время по-прежнему необходим поиск новых терапевтических подходов, эффективных при лечении рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения обнаружили, что аденовирус, который реплицируется и содержит ген гиалуронидазы в своем геноме, распределяется более эффективно в опухолевой массе. Экспрессия гиалуронидазы онколитическим аденовирусом приводит в деградации гиалуроновой кислоты, которая является частью внеклеточного матрикса опухоли. Деградация гиалуроновой кислоты приводит к снижению внутритканевого давления в опухоли и меньшей устойчивости опухоли к распространению аденовируса, и следовательно, улучшению распространения вируса от клетки к клетке в опухолевом образовании. Это улучшенное распространение воплощается в усилении онколитического эффекта. Авторы обнаружили, что при внутривенном инъецировании онколитического аденовируса по изобретению достигается регрессия объема опухоли. Таким образом, онколитический аденовирус по настоящему изобретению является пригодным для лечения рака. Кроме того, экспрессия гена гиалуронидазы не влияет ни на вирусную репликацию, ни на цитотоксичность онколитического аденовируса.

Как упоминалось ранее, было описано, что внутриопухолевое совместное введение онколитического аденовируса и растворимой гиалуронидазы повышает противоопухолевую эффективность онколитического аденовируса. Тем не менее до этого изобретения ген гиалуронидазы не вводили в какой-либо онколитический аденовирус для лечения рака.

Как описывается в примерах, внутриопухолевое in vivo-введение онколитического аденовируса по изобретению улучшает противоопухолевый эффект по сравнению с контрольным аденовирусом без встроенной гиалуронидазы (см. ФИГ.7). Следует отметить, что когда онколитический аденовирус по изобретению вводится внутривенно (см. ФИГ.8 и ФИГ.9) и, по сравнению с результатами, представленными на Фигуре 2 оригинала Ganesh et al., гораздо большее подавление роста опухоли наблюдается в случае аденовируса по настоящему изобретению. Это означает, что лечение по изобретению является более эффективным. Опухоли мышей с инъекцией онколитического аденовируса на изобретение (ICOVIR17) демонстрируют обширные некротические области, области с менее жизнеспособными клетками и крупные и многочисленные центры репликации вируса, по сравнению с опухолями с инъекцией аденовирусного контроля, ICOVIR15.

Кроме того, введенные дозы аденовируса по изобретению являются меньшими: у Ganesh et al. (выше) вводится четыре внутриопухолевых инъекции по 1×10¹⁰ вирусных частиц, тогда как в настоящем изобретении вводится одна внутривенная доза с 2×10⁹ вирусных частиц. Это означает уменьшение дозы в 20 раз и то преимущество, что доза является однократной. В своем подходе, Ganesh et al. вводят гиалуронидазу внутриопухолево через день на протяжении всего эксперимента. Кроме того, аденовирус также вводят внутриопухолево в начале лечения. Такое внутриопухолевое введение вируса и гиалуронидазы вряд ли применимо в клинике, поскольку большинство опухолей являются недоступными для внутриопухолевого введения. Предположительно, совместное введение раствора с гиалуронидазой и аденовирусом не делалось системным способом, поскольку вероятность того, что оба компонента вместе достигнут рассредоточенные по организму клетки опухоли, является низкой.

Настоящее изобретение делает возможным экспрессию гиалуронидазы в участке и в момент времени, когда происходит репликация вируса. Такая экспрессия гиалуронидазы улучшает распространение вируса по опухолевой массе и увеличивает ее противоопухолевую активность. Целесообразно вводить адаптированные дозы, нетоксичные для животных, с большой эффективностью для лечения.

В настоящем изобретении, онколитические аденовирусы достигают опухолевые клетки-мишени. Оказавшись внутри, вирус реплицируется, экспрессируются его капсидные белки и, в то же время, экспрессируется гиалуронидаза, кодируемая геномом аденовируса. Эта гиалуронидаза была модифицирована для высвобождения во внеклеточную среду, которая окружает клетки. Во внеклеточной среде гиалуронидаза разрушает матрикс и помогает аденовирусам, которые реплицировались при инфицировании соседних опухолевых клеток.

Таким образом, аспект изобретения относится к онколитическому аденовирусу, который содержит встроенную в его геном последовательность, кодирующую фермент гиалуронидазу.

В рамках изобретения, термин «онколитический аденовирус» означает аденовирус, который способен реплицироваться или который является компетентным для репликации в опухолевой клетке. В этом описании онколитический аденовирус и реплицирующийся аденовирус являются синонимами. Они отличаются от нереплицирующегося аденовируса, поскольку этот последний неспособен реплицироваться в клетке-мишени. Нереплицирующимися являются аденовирусы, используемые в генной терапии в качестве переносчиков генов к клеткам-мишеням, поскольку целью является экспрессия терапевтического гена в интактных клетках, а не лизис клетки. Вместо этого терапевтическое действие онколитических аденовирусов основано на способности реплицироваться и лизировать клетку-мишень, в частности опухолевую клетку, которую следует элиминировать.

Еще один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит терапевтически эффективное количество онколитического аденовируса совместно с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями.

Еще один аспект изобретения относится к онколитическому аденовирусу по изобретению для его применения в качестве лекарственного средства.

Еще один аспект изобретения относится к онколитическому аденовирусу по изобретению для лечения рака или предопухолевой формы рака у млекопитающего, включая человека.

Еще один аспект изобретения относится к применению онколитического аденовируса для получения лекарственного средства для лечения рака или предопухолевой формы рака у млекопитающего, включая человека. Лечение основывается на репликации этих онколитических аденовирусов в опухолях. Альтернативно, этот аспект изобретения можно сформулировать как способ лечения у млекопитающего, включая человека, рака или предопухолевой формы рака, который включает введение указанному млекопитающему эффективного количества онколитического аденовируса.

Еще один аспект изобретения относится к челночному вектору, способному рекомбинировать с геномом аденовируса, для конструирования онколитического аденовируса по изобретению. Этот вектор содержит инвертированные концевые повторяющиеся последовательности аденовируса («инвертированные концевые повторы», ITR), последовательность, которая способствует экспрессии последовательности, кодирующей фермент гиалуронидазу, последовательность, которая кодирует фермент, и последовательность полиаденилирования.

В частном варианте осуществления онколитический аденовирус по изобретению является аденовирусом человека, означая, что инфицируются люди. В частности, аденовирус человека выбирают из группы, состоящей из серотипов 1-51 аденовируса человека и их производных. Под «производным» понимается рекомбинантный аденовирусный гибрид двух или нескольких аденовирусов различных серотипов, например, аденовируса серотипа 5 с волокном аденовируса серотипа 3. В частном варианте осуществления изобретения онколитический аденовирус человека относится к серотипу 5.

Гиалуронидазы представляют собой семейство ферментов, которые разлагают гиалуроновую кислоту. У человека существует 6 генов, кодирующих гиалуронидазы с различными свойствами и локализациями. Изоформы Hyal1 и Hyal2 присутствуют в большинстве тканей. Hyal1 является преобладающей формой в плазме человека. Hyal3 присутствует в костном мозге и семенниках, однако ее функция недостаточно хорошо изучена. Гиалуронидаза PH20 высоко экспрессируется в семенниках и участвует в процессе оплодотворения ооцита сперматозоидом. Гиалуронидаза PH20 заякорена в плазматической мембране и во внутренней акросомальной мембране сперматозоида и придает сперматозоиду способность проникать через внеклеточный матрикс скопления (богатого гиалуроновой кислотой), чтобы достичь прозрачной зоны ооцита. Во время акросомальной реакции часть гиалуронидаз, заякоренных в мембране сперматозоида, ферментативно процессируется с образованием растворимой формы белка, который высвобождается из акросомальной мембраны. Кроме того, гиалуронидаза была идентифицирована как фактор распространения яда змей, пауков, скорпионов и ос.

В частном варианте осуществления фермент гиалуронидаза представляет собой тестикулярную гиалуронидазу млекопитающего, конкретнее, тестикулярную гиалуронидазу человека. Тестикулярная гиалуронидаза человека (GenBank GenelD: 6677) также известна как SPAM1 или молекула 1 адгезии спермы, и как PH-20. Мембранный белок PH20 является единственным ферментом семейства гиалуронидаз млекопитающих с активностью при нейтральный pH. Кодирующий его ген образует два транскрипционных варианта: вариант 1, более длинный, который кодирует изоформу 1 белка (инвентарный номер GenBank NP_003108.2) и вариант 2, который использует сигнал альтернативного сплайсинга с 3'-конца кодирующей области, по сравнению с вариантом 1, приводящий к изоформе 2 с укороченным C-концом (инвентарный номер GenBank NP_694859.1).

В частном варианте осуществления изобретения последовательность фермента делетируют по последовательности, соответствующей карбокси-концу мембран-связывающего домена, для продуцирования растворимого фермента (см. ФИГ.2). Делеция этого карбоксиконцевого домена приводит к секреции гиалуронидазы во внеклеточную среду. Таким образом, был получен онколитический аденовирус, который экспрессирует секретируемую гиалуронидазу с ферментативной активностью при нейтральном pH. В частном варианте осуществления последовательность, встроенная в геном аденовируса, представляет собой последовательность, которая кодирует SEQ ID NO: 1. В еще одном частном варианте осуществления встроенная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления последовательность фермента встроена в онколитический аденовирус после нуклеотидной последовательности волокна аденовируса.

В другом варианте осуществления экспрессия фермента контролируется промотором, активным в клетках животных. В частности, промотор выбирают из группы, состоящей из промотора цитомегаловируса, главного позднего промотора аденовируса, промотора SV40, промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса, промотора RSV, промотора EF1-альфа, промотора бета-актина, промотора IL-2 человека, промотора IL-4 человека, промотора IFN, промотора E2F и промотора GM-CSF человека. Промотор, который контролирует экспрессию фермента, может представлять собой натуральный промотор аденовируса, как имеет место в случае главного позднего промотора аденовируса (см. ФИГ.1(а), MLP, «главный поздний промотор»). Промотор также можно встраивать перед последовательностью, которая кодирует фермент. В предпочтительном варианте осуществления промотором является главный поздний промотор аденовируса.

Репликативный аденовирус по изобретению может иметь модификации в своей геномной последовательности, которые придают способность избирательной репликации в опухолевых клетках. В частном варианте осуществления это достигается встраиванием тканеспецифического промотора или опухолеспецифического промотора. Это промотор контролирует экспрессию одного или нескольких генов группы Е1а, E1b, E2 и E4. В частности, промотор выбирается из группы, состоящей из промотора E2F, теломеразного промотора hTERT, тирозиназного промотора, промотора специфического антигена предстательной железы (PSA), альфа-фетопротеин промотор, промотора COX-2, а также искусственных промоторов, образованных несколькими участками связывания транскрипционных факторов, такими как участки связывания фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1), транскрипционного фактора Ets, опухолевого цитотоксического фактора (tcf), транскрипционного фактора E2F или транскрипционного фактора Sp1. Предпочтительно, промотор контролирует экспрессию Е1а.

Еще одной модификацией для получения избирательной репликации в опухолях является элиминация функций Е1А, который блокирует ретинобластомный (RB) путь. Другие вирусные гены, которые взаимодействуют непосредственно с pRB, такие как E4 и E4orf6/7, представляют собой кандидатов на элиминирование для достижения избирательной репликации в опухолевых клетках. Как показано в примерах, онколитический аденовирус ICOVIR17 характеризуется одновременным содержанием гена гиалуронидазы, делецией А24, что влияет на взаимодействие Е1а с pRB, включением четырех E2F1-сайтов связывания и одного Sp1-сайта связывания в эндогенный промотор Е1а для контролирования экспрессии Е1а и, наконец, включением RGD-пептида в волокно аденовируса для повышения инфекционной активности вируса. ICOVIR17 представляет собой предпочтительный вариант осуществления изобретения.

Еще одной модификацией для получения избирательной репликации в опухолях является элиминация аденовирусных генов, кодирующих связанные с вирусом РНК (VA-RNA). Эти РНК блокируют противовирусную активность интерферона и, в случае делетирования, аденовирус становится чувствительным к ингибированию интерфероном. Поскольку опухолевые клетки характеризуются ограничением интерферонового пути, такие аденовирусы реплицируются в опухолях на нормальном уровне. Таким образом, в другом конкретном варианте осуществления избирательной репликации в опухолях достигается при помощи мутаций в одном или нескольких генах группы E1a, E1b, E4 и VA-RNA аденовируса. Предпочтительными являются мутации в Е1а.

Эти две стратегии для достижения избирательной репликации в опухолях не исключают друг друга.

В другом варианте осуществления изобретения аденовирус включает модификации в своем капсиде, увеличивающие его инфицирующую способность или нацеленные на его рецептор, присутствующий в опухолевых клетках. В предпочтительном варианте осуществления аденовирусные капсидные белки модифицируют генетически так, чтобы включить лиганды, которые увеличивают инфицирующую способность или которые нацеливают вирус на рецептор в опухолевой клетке. Нацеленность аденовируса на опухоль можно достичь при помощи бифункциональных лигандов, которые связываются с вирусом, с одной стороны, и с рецепторами опухоли, с другой. С другой стороны, для повышения устойчивости аденовируса в крови и, следовательно, увеличения возможности достижения рассредоточенных опухолевых вкраплений капсид может быть покрыт полимерами, такими как полиэтиленгликоль. В предпочтительном варианте осуществления онколитический аденовирус имеет капсид, модифицированный для увеличения его инфицирующей способности или для улучшения его нацеленности на клетки-мишени при помощи замены гепаринсульфат-связывающего домена KKTK в волокне аденовируса доменом RGDK. В примерах поясняется конструирование аденовируса ICOVIR17RGDK с такими характеристиками.

В еще одном конкретном варианте осуществления аденовирус содержит последовательность, которая оптимизирует трансляцию в белок последовательности, кодирующей гиалуронидазу.

В еще одном конкретном варианте осуществления аденовирус содержит последовательность, которая активирует экспрессию последовательности, кодирующей гиалуронидазу. В частности, эта последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательности сплайсинга, которая обеспечивает процессинг РНК, последовательности IRES («внутренний участок рибосомного входа») и последовательности 2А пикорнавируса.

В еще одном конкретном варианте осуществления онколитический аденовирус содержит другие гены, встроенные в его геном, которые обычно используются в области генной терапии рака для увеличения цитотоксичности онколитических аденовирусов по отношению к клеткам опухоли. Некоторые из них представляют собой ген тимидинкиназы, ген цитозиндиаминазы, гены проапоптоза, гены, стимулирующие иммунитет, гены опухолевых супрессоров или гены, активирующие пролекарства.

Эти модификации в геноме аденовируса не исключают друг друга. Существует несколько способов манипулирования геномом аденовируса. В области генной терапии и виротерапии с применением аденовирусов известны способы конструирования генетически-модифицированных аденовирусов. Наиболее широко используемый способ основывается на конструировании сначала нужной генетической модификации в плазмиде, содержащей подлежащую модификации область аденовируса, а затем осуществление гомологичной рекомбинации в бактериях при помощи плазмиды, содержащей остальную часть вирусного генома.

Аденовирус, который содержит ген гиалуронидазы - предмет настоящего изобретения, размножается и амплифицируется в клеточных линиях, обычно используемых в области генной терапии и виротерапии, таких как клеточные линии HEK-293 и A549. Предпочтительным способом размножения является способ при помощи инфицирования клеточной линии, пермиссивной к репликации аденовируса. Клеточная линия легочной аденокарциномы A549 является примером линии с такими характеристиками. Размножение осуществляется, например, следующим образом: клетки A549 засевают в пластиковые планшеты для культивирования клеток тарелки и инфицируют из расчета 100 вирусных частиц на клетку. Два дня спустя наблюдается цитопатический эффект, отражающий продуцирование вируса, в виде кластеризации и округления клеток. Клетки собирают в пробирках. После центрифугирования при 1000g в течение 5 минут клеточный осадок замораживают и оттаивают три раза, чтобы разрушить клетки. Полученный клеточный экстракт центрифугируют при 1000g в течение 5 минут, супернатант с вирусом наслаивают на градиент хлорида цезия и центрифугируют в течение 1 часа при 35000g. Зону вируса, полученную из градиента, наслаивают на другой градиент хлорида цезия и снова центрифугируют в течение 16 часов при 35000g. Зону вируса собирают и диализируют против PBS-10% глицерина. Диализованный вирус разделяют на аликвоты и хранит при -80°C. Количественную оценку числа вирусных частиц и бляшкообразующих единиц осуществляют по стандартным протоколам. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с глицерином до 5% является стандартным составом для хранения аденовируса. Тем не менее были описаны новые составы, которые повышают стабильность вирусов. Способы очистки аденовируса, содержащего ген гиалуронидазы, для его применения при лечении рака являются такими же, как описано для других аденовирусов и аденовирусных векторов, используемых в виротерапии и генной терапии рака.

Онколитический аденовирус по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему, предпочтительно человеку. Целью введения онколитического аденовируса является лечение, включая, в качестве неограничивающих примеров, меланомы, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки и рака легких. Кроме того, рассматривается введение онколитического аденовируса в опухоли, находящиеся в предраковой стадии. Понятно, что онколитический аденовирус вводят в фармацевтически приемлемой форме. Специалисты в данной области могут обеспечить необходимую дозу с использованием стандартных процедур. Понятно, что доза должна представлять собой эффективное количество онколитического аденовируса для того, чтобы обеспечить уменьшение опухоли при лечении пациента. Вирус можно вводить непосредственно в опухоль, в полость, в которой опухоль находится, в сосудистую сеть опухоли, вокруг опухоли или путем системной внутривенной инъекции в организм пациента. Предпочтительно, введение является системным.

Протоколы использования вирусов, описанных в настоящем изобретении, для лечения рака являются теми же процедурами, которые используются в области виротерапии при помощи аденовирусов и генной терапии с использованием аденовирусов. В области генной терапии существует большой опыт использования неонколитических и онколитических аденовирусов. Имеются многочисленные публикации, описывающие лечение опухолевых клеток в культуре, экспериментальных моделях на животных и клинических испытаниях с пациентами. Для лечения клеток в культуре in vitro аденовирус, очищенный с помощью любого из составов, описанных выше, добавляют к культуральной среде для получения инфицирования опухолевых клеток. Для лечения опухолей в экспериментальных моделях на животных или у пациентов аденовирус может вводится регионально путем инъекции в опухоль или в полость тела, где находится опухоль, или системно путем инъекции в кровяное русло.

Онколитический аденовирус по изобретению можно вводить отдельно или в композиции с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Специалист в рассматриваемой области адаптирует композицию в соответствии с конкретным способом введения. Композиции могут включать онколитический аденовирус в качестве единственного противоопухолевого агента или в комбинации с другим терапевтическим средством, таким как химиотерапевтический препарат или вектор со встроенным терапевтическим геном. Кроме того, терапию с использованием онколитических аденовирусов можно комбинировать с лучевой терапией.

Если иное не определено, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такой же смысл, как это обычно понимается любым специалистом в рассматриваемой области. Способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, могут быть использованы в практике настоящего изобретения. Повсюду в описании и пунктах формулы изобретения слово «включать» и его вариации не предназначается для исключения других технических особенностей, добавок, компонентов или стадий. Дополнительные объекты, преимущества и особенности изобретения станут очевидными для специалистов в рассматриваемой области после изучения описания или могут быть изучены из практики изобретения. Следующие конкретные варианты осуществления и чертежи предоставляются в виде иллюстрации, и они не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ.1 (а) показана структура онколитических аденовирусов, характеризующихся содержанием и экспрессией гена гиалуронидазы PH20. Аденовирус AdwtRGD-PH20 содержит ген белка PH20, встроенный после ген волокна аденовируса. Экспрессия гена белка PH20 регулируется главным поздним промотором (MLP) аденовируса посредством вставки акцептора сплайсинга (SA) аденовируса перед геном белка PH20. Трансляция белка этого гена оптимизируется за счет введения последовательности kozak (k) перед последовательностью начала трансляции. Аденовирус ICOVIR15 и ICOVIR17 являются аденовирусами, избирательно реплицирующимися в опухоли. Они характеризуются содержанием 4 участков связывания E2F и одного участка связывания Sp1 в эндогенном промоторе Е1а. Оба вируса также представляют модифицированную версию вирусного волокна, в которое был встроен пептид RGD-4C, и мутантный вариант белка Е1А, у которого были делетированы аминокислоты 121-129 полипептидной цепи (мутация Δ24). Кроме того, ICOVIR17 содержит ген гиалуронидазы PH20, встроенный, как в аденовирусе AdwtRGD-PH20. (b) показывает последовательность, встроенную в аденовирус AdA24RGD вместо последовательности от нуклеотида 419 до нуклеотида 422. Эта вставка сделана для того, чтобы встроить четыре участка связывания с фактором E2F-1 и один участок связывания с фактором Sp1. Последовательности, подчеркнутые как «nt 385-419» и «nt 422-461», соответствуют дикому типу AdA24RGD. (c) показывает полную кассету, встроенную в геномы ICOVIR17 и AdwtRGD-PH20, относительно геномов ICOVIR15 и AdwtRGD (SEQ ID NO: 4). Показаны акцептор сплайсинга IIIa, kozak и последовательность полиаденилирования (polyA). Последовательность, кодирующая белок PH20, простирается от kozak до последовательности полиаденилирования. ФИГ.1 относится к ПРИМЕРУ 3.

ФИГ.2 демонстрирует аминокислотную последовательность белка PH20 (SEQ ID NO: 1) и профиль гидрофобности в соответствии с алгоритмом Кайт-Дулитл. Белок РН20 представляет собой мембранный белок, присутствующий в плазматической и акросомальной мембране сперматозоидов. (a) Аминокислотная последовательность показывает гидрофобную последовательность, ответственную за заякоривание белка в мембране (подчеркнутая последовательность). В настоящем изобретении экспрессируемый вирусом белок PH20 представляет делетированный гидрофобных хвост. Точка расщепления указана внутри круга. За счет этой делеции белок PH20 секретируется во внеклеточную среду. (b) Профиль гидрофобности 100 концевых аминокислот белка PH20 по Кайт-Дулитл. Стрелка указывает на начало гидрофобного участка, который был элиминирован.

ФИГ.3 показывает, что онколитический аденовирусы, содержащие ген гиалуронидазы PH20, экспрессируют растворимый белок, который демонстрирует активность гиалуронидазы. Гели показывают, что образцы гиалуроновой кислоты, инкубированные с супернатантом вируса, экспрессирующего гиалуронидазу PH20, расщеплялись с образованием олигосахаридов различных размеров. Образцы, инкубированные с супернатантами контрольных аденовирусов (AdwtRGD и ICOVIR15), демонстрируют наличие нерасщепленной гиалуроновой кислоты. ФИГ.3 соответствует ПРИМЕРУ 4.

ФИГ.4 показывает, что встраивание и экспрессия гена гиалуронидазы PH20 не мешает репликации аденовируса, избирательно реплицирующегося в опухоли. Клетки клеточных линий A549 (a) и SKMel28 (b) инфицировали онколитическими аденовирусами ICOVIR15 и ICOVIR17 (который отличается от ICOVIR15 содержанием гена PH20) и количество вируса в клеточных экстрактах определяли (ось X, общий