Противовирусное однодоменное мини-антитело, нуклеотидная последовательность, экспрессирующий рекомбинантный вирусный вектор, фармацевтическая композиция и способ профилактики или терапии гриппа типа а

Противовирусное однодоменное мини-антитело, нуклеотидная последовательность, экспрессирующий рекомбинантный вирусный вектор, фармацевтическая композиция и способ профилактики или терапии гриппа типа а

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вирусологии и предполагает использование антител, представляющих собой однодоменные мини-антитела, для профилактики и терапии гриппа, а также к использованию генов этих антител в комбинации с вирусным вектором (вектором на основе рекомбинантного аденовируса) и их экспрессии в организме млекопитающих для профилактики и терапии гриппа.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Вирусы гриппа способны вызывать чрезвычайные эпидемические ситуации. Эти вирусы широко распространены в природе и могут поражать людей, многие виды млекопитающих (лошадей, свиней, тюленей и т.д.), а также все виды птиц. Респираторные заболевания, вызываемые вирусами гриппа, в некоторых случаях могут протекать с осложнениями и заканчиваться смертью.

Вирусы гриппа характеризуются большой антигенной вариабельностью. Наиболее подвержены изменениям поверхностные гликопротеины вириона - гемагглютинин и нейраминидаза. Известны два пути их изменения.

Первый - антигенный дрейф. Под давлением популяционного иммунитета мутации, позволяющие уйти из-под контроля иммунной системы, дают вирусу серьезное преимущество и закрепляются. В итоге новые антигенные варианты гемагглютинина и нейраминидазы постоянно сменяют друг друга. В результате возникают эпидемии, т.к. защита от предыдущих штаммов вирусов, в том числе того же самого субтипа, недостаточна для нейтрализации нового штамма. К сожалению, применение современных субъединичных и инактивированных вакцин не решает эту проблему, т.к. обеспечивает хорошую защиту только от штамма, из которого они были получены. Поэтому в настоящее время для защиты населения от новых эпидемических штаммов требуется постоянно создавать новые вакцины.

Второй путь изменения вирусов гриппа - антигенный шифт (сдвиг), т.е. изменение антигенной формулы вируса в результате замены гена(ов) и соответствующего белка(ов). В основе механизма антигенного шифта лежит реассортация или рекомбинация генов, которая может происходить при совместной инфекции двумя и более вирусами [Кочергин-Никитский К.С. // Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человека. М., ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. 2007]. Шифтовые изменения, как правило, затрагивают антигенную структуру гемагглютинина, реже - нейраминидазы. Таким образом, через нерегулярные интервалы времени появляются пандемические варианты вирусов гриппа с новыми антигенными и биологическими свойствами, которые вызывают тяжелые заболевания и гибель людей [Lvov D.K. // Sov. Med. Rev. E. Virol. Rev. 1987. V.2. P.15-37; Webster R.G., Bean W.J., German O.T., et al. // Microbiol. Rev. 1992. V.56. P.152-179]. Например, пандемия «испанки» - вируса гриппа H1N1, в 1918-1920 гг. привела к смерти около 50 млн человек по всему миру. В июне 2009 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) присвоила новому вирусу H1N1, случаи заболевания которым начали выявлять в начале апреля 2009 г., шестую степень угрозы пандемии. Этот вирус представляет собой реассортант, содержащий гены птичьего, человеческого и свиного вирусов [Shinde V., Bridges С.В., Uyeki Т.М. // The New England journal of medicine. 2009. V.360; 25. P.2616-2625]. При возникновении нового пандемического штамма создание вакцины занимает слишком много времени, что не позволяет быстро остановить распространение опасного вируса. Таким образом, несмотря на проводимые широкомасштабные профилактические меры, включающие вакцинацию, во многих странах мира, в том числе в России, ежегодно регистрируются сезонные вспышки гриппа, охватывающие все слои населения от детей до лиц преклонного возраста. Для решения этой проблемы необходимы новые подходы к профилактике и лечению гриппа.

Помимо вакцин для борьбы с гриппом на сегодняшний день существует широкий выбор лекарственных средств. Однако следует отметить, что профилактика подобными средствами не обладает достаточной эффективностью, к тому же многие лекарственные средства имеют широкий перечень противопоказаний и могут вызвать побочные реакции.

В настоящее время для лечения и профилактики гриппа используются препараты нескольких групп, среди которых особое место занимают препараты ингибиторы М2-каналов и ингибиторы нейраминидазы. Из препаратов первой группы в нашей стране в течение многих лет применялся ремантадин, оказывавший выраженный терапевтический и профилактический эффект при гриппе, вызванном вирусом типа А. Однако широкое использование ингибиторов М2-каналов привело к появлению устойчивых штаммов вирусов гриппа, резистентных к ремантадину. Из препаратов второй группы в России зарегистрированы препараты занамивир и осельтамивир. Занамивир не пригоден для широкого использования в клинической практике, т.к. может применяться только в виде ингаляций, что неприемлемо для детей дошкольного возраста и пожилых пациентов. Кроме того, возможен целый ряд нежелательных реакций, включая бронхоспазм и отек гортани. Другой препарат - осельтамивир (Тамифлю) - зарекомендовал себя как высокоэффективный и безопасный препарат, но одним из самых принципиальных недостатков этого препарата является необходимость его раннего применения (наиболее эффективен при приеме в первые 36 часов заболевания).

Проблема своевременного обращения за медицинской помощью и раннего лечения респираторных вирусных инфекций относится к наиболее острым проблемам практического здравоохранения. По данным НИИ гриппа РАМН основная часть пациентов обращаются за медицинской помощью только на 2-3-и сутки, когда становится очевидным, что пациент болен не простой простудой и нельзя ограничиться лечением только жаропонижающими препаратами, однако уже с тяжелыми формами гриппа и вирусными пневмониями пациенты поступают в клиники Института гриппа РАМН только на 5-е сутки. В связи с этим ингибиторы нейраминидазы не могут быть широко использованы в реальных условиях начинающейся эпидемии.

Таким образом, можно заключить, что на сегодняшний день нет эффективных и безопасных препаратов для терапии или профилактики гриппа.

Решением данной проблемы может стать создание препаратов на основе антител, полученных против вируса гриппа типа А. Действие этих препаратов основано на введении в организм антител, полученных к протективному антигену патогена, которые способны защищать организм хозяина от развития инфекции. Такой подход применяется начиная с первой половины 20-го века. До конца 1960-х гг. в СССР сравнительно широко применялась гипериммунная лошадиная сыворотка для профилактики и лечения гриппа. Однако зачастую в качестве побочной реакции данный препарат вызывал аллергию, и в этой связи от него пришлось отказаться. Но сама идея использования содержащихся в крови людей противовирусных антител в настоящее время все еще реализуется в виде препаратов крови. Эти препараты называют иммуноглобулинами. Наиболее эффективен и распространен в России препарат «специфический противогриппозный иммуноглобулин» из крови доноров, специально и многократно вакцинированных против гриппа. Помимо противогриппозных антител, специально стимулируемых вакцинацией, в донорском иммуноглобулине содержатся антитела ко многим широко распространенным инфекционным агентам, в том числе и к респираторным вирусам. В последние годы появились сообщения о формировании антител к введенному человеческому белку. Препарат не лишен и других побочных эффектов: повышения температуры тела, аллергизация организма: от появления сыпи до развития тяжелого состояния и анафилактического шока.

Препараты иммуноглобулинов, полученные генно-инженерными методами, лишены некоторых этих недостатков. Так, на животных показана эффективность моноклональных одноцепочечных антител (scFv), полученных против белка-токсина сибирской язвы [Mabry R., Infect Immun. 2005; 73: 8362-8368.]. Однако при этом используются экстремально высокие дозы белка, что является существенным ограничением. Гуманизированные одноцепочечные однодоменные мини-антитела не отторгаются организмом человека и не вызывают аллергической реакции. Однако данный тип антител имеет ряд недостатков: высокие затраты на их производство и ограниченность генно-инженерных манипуляций.

В настоящее время разработана технология получения с помощью методов генной инженерии еще одного типа антител - рекомбинантных однодоменных мини-антител заданной специфичности. В ее основе лежит получение нуклеотидных последовательностей генов неканонических антител животных семейства верблюдовых (Camelidae). Эти антитела представляют собой димер только одной укороченной (первый константный район СН1 отсутствует) тяжелой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен этого антитела.

Полным эквивалентом термина «однодоменное мини-антитело» для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX (NANOBODY™), а также «наноантитело» и «однодоменное наноантитело».

Полученные по этой технологии однодоменные мини-антитела обладают следующими свойствами [Тиллиб С.В. «Верблюжьи мини-антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45 (1): 77-85.]:

1) Высокая растворимость и стабильность (в широком диапазоне температур и кислотности среды).

2) Улучшенная проницаемость в клетки за счет малого размера (~2×4 нм, 13-15 кДа).

3) Способность образовывать необычные для классических антител паратипы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков.

4) Наличие отработанного способа получения и селекции однодоменных мини-антител.

5) Возможность экономичной наработки в больших количествах. Однодоменные мини-антитела можно нарабатывать в периплазме бактерий Е.coli.

6) Возможность генно-инженерных модификаций для поливалентных однодоменных мини-антител.

7) Низкая иммуногенность.

Еще одним положительным свойством этих антител является возможность их «гуманизации» без заметной потери их специфической активности путем проведения небольшого числа точечных замен аминокислот [Vincke С., Loris R., Saerens D., et al. // J. Biol. Chem. 2009. V.284. №5. P.3273-3284]. Это открывает потенциальную возможность широкого использования однодоменных мини-антител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174].

Так, было показано (WO 2007/052242; Prendergast Patrick; Composition and method for the treatment of viral infection using camelid heavy chain antibodies), что антитела, полученные против вируса гриппа и отобранные по специфичности к нейраминидазе, способны защищать птиц от развития заболеваний, вызываемых вирусами гриппа различных штаммов. Это техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества фармацевтической композиции и способу введения его в организм выбрано авторами настоящего за прототип.

Недостатками прототипа являются:

1) Антитела к нейраминидазе вируса гриппа обладают слабой нейтрализующей вирус активностью. Эффективная нейтрализация вируса таким препаратом может обеспечиваться лишь в случае его длительной циркуляции в организме. Это приводит к необходимости введения в организм больших доз препаратов для достижения положительного эффекта, а также к необходимости повторного введения препарата.

2) Для предотвращения возникновения различных иммунных реакций на чужеродный белок (антитело), вводимый в большом количестве вследствие его слабой нейтрализующей вирус активности, используется схема введения, согласно которой препарат вводится дважды, причем второй раз совместно с препаратом, ингибирующим ФНО-α. При этом зачастую повторное введение является затруднительным для пациентов.

Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке фармацевтической композиции для профилактики и терапии гриппа на основе специфических (рекомбинантных) антител, характеризующихся высокой нейтрализующей вирус активностью, которые должны продолжительное время поддерживаться/воспроизводиться в организме, что обеспечило бы достаточность однократного введения композиции.

Задачей настоящего изобретения явилось создание:

1) модифицированного однодоменного мини-антитела, которое характеризуется высокой нейтрализующей вирус активностью и за счет этого может эффективно связывать определенный эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и тем самым блокировать развитие инфекции вируса гриппа в организме.

2) вектора, обеспечивающего доставку и продолжительную экспрессию в организме гена однодоменного мини-антитела, которое может эффективно связывать определенный эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и характеризуется высокой нейтрализующей вирус активностью, что при однократном введении может эффективно блокировать развитие инфекции вируса гриппа в организме.

3) композиции, состоящей из однодоменного мини-антитела и аденовирусного вектора, обеспечивающего доставку и продолжительную экспрессию в организме гена однодоменного мини-антитела, которое может эффективно связывать определенный эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и характеризуется высокой нейтрализующей вирус активностью, что при однократном введении может блокировать развитие инфекции вируса гриппа в организме.

Раскрытие настоящего изобретения

Указанная выше задача настоящего изобретения решена тем, что разработка препарата проведена с использованием специально полученных однодоменных мини-антител, связывающих поверхностный белок гемагглютинин вируса гриппа таким образом, что при этом нарушается (блокируется и нейтрализуется) инфекционная активность вируса гриппа А.

Более конкретно, поставленная задача решается настоящим изобретением за счет создания однодоменного мини-антитела против вируса гриппа, специфически связывающегося с определенным эпитопом гемагглютинина вируса гриппа типа A и подавляющего инфекцию вируса гриппа типа А. Также создан вирусный вектор, экспрессирующий однодоменное мини-антитело против вируса гриппа, которое может эффективно связывать определенный эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и тем самым блокировать развитие инфекции вируса гриппа в организме. При этом вирусный вектор может быть аденовирусным вектором, экспрессирующим однодоменное мини-антитело против вируса гриппа, которое способно эффективно связывать определенный эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и тем самым блокировать развитие инфекции вируса гриппа в организме. Также предлагается композиция, состоящая из эффективного количества однодоменного мини-антитела против вируса гриппа и вирусного вектора, экспрессирующего однодоменное мини-антитело против вируса гриппа, способного эффективно связывать гемагглютинин вируса гриппа и тем самым блокировать развитие инфекции вируса гриппа в организме.

В качестве способов применения для действующего вещества (антитела) были выбраны следующие: использование однодоменных мини-антител в виде суспензии в фармацевтически приемлемом растворителе; использование в качестве носителя для действующего вещества рекомбинантного вирусного вектора на основе аденовируса, экспрессирующего ген однодоменного мини-антитела, способного связывать и/или нейтрализовывать вирус гриппа; использование композиций, содержащих как вирусный вектор с геном однодоменного мини-антитела, так и однодоменное мини-антитело (в виде белка).

Выбор путей реализации с целью получения фармацевтической композиции с заявляемыми свойствами обусловлен следующими факторами:

Настоящее изобретение предусматривает использование в качестве действующего вещества фармацевтической композиции особого однодоменного мини-антитела, способного эффективно связываться с поверхностным белком гемоглютинином вируса гриппа таким образом, что при этом нарушается (блокируется, нейтрализуется) инфекционная активность вируса. Большинство используемых в настоящее время нейтрализующих вирус антител (классических антител, состоящих из 4-х иммуноглобулиновых цепей) имеют сродство именно к белку гемоглютинину вируса гриппа. Антитела против гемагглютинина способны предотвращать проникновение вируса в клетку и таким образом предотвращать развитие инфекции. В отличие от них действие антител против нейраминидазы осуществляется на уровне выхода зрелых частиц вируса из клетки и поэтому способны лишь сократить период заболевания и его интенсивность. Ввиду того что именно антитела к гемагглютинину могут обладать выраженной нейтрализующей вирус активностью и оказывают свое действие против вируса гриппа сразу после попадания его в организм, то есть способны предотвратить развитие инфекции, однодоменные мини-антитела, отобранные против гемагглютинина вируса гриппа и обладающие при этом нейтрализующей вирус активностью, были использованы в качестве действующего вещества для создания фармацевтической композиции, предназначенной для профилактики и терапии гриппа.

Настоящее изобретение относится к способу использования однодоменного мини-антитела, предусматривающему применение вирусных векторов в качестве носителя для действующего вещества. Вирусные векторы представляют собой рекомбинантные вирусы, в геном которых включен целевой ген (ген однодоменного мини-антитела) с набором регуляторных элементов. В качестве вирусных векторов наиболее часто применяют следующие рекомбинантные вирусы: аденовирусы [Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю. и др. Индукция протективного иммунного ответа у мышей, вакцинированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, экспрессирующим гликопротеин G вируса бешенства. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии 2006; 4: 69-71; Тутыхина И.Л., Шульпин М.И., Чвала И.А. и др. Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа А птиц, и изучение возможности их использования в качестве вакцин для защиты от вируса гриппа А птиц H5N1 и H7N1. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2011.; Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю. и др. Конструирование и перспективы использования в медицине рекомбинантных аденовирусных наноструктур. Российские нанотехнологии. 2009; 4 (11-12): 82-92; Liu М.А. Immunologic basis of vaccine vectors. Immunity. 2010; 33 (4): 504-15; Lasaro M.O., Ertl H.C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Mol Ther. 2009; 17 (8): 1333-9], ретровирусы [Liu M.A. Immunologic basis of vaccine vectors. Immunity. 2010; 33 (4): 504-15; Pincha M., Sundarasetty B.S., Stripecke R.. Lentiviral vectors for immunization: an inflammatory field. Expert Rev Vaccines. 2010; 9 (3): 309-321; Negri D.R., Michelini Z., Cara A. Toward integrase defective lentiviral vectors for genetic immunization. Curr HIV Res. 2010; 8 (4): 274-281.], аденоассоциированные вирусы [Sun J.Y., Anand-Jawa V., Chatterjee S., Wong K.K. Immune responses to adeno-associated virus and its recombinant vectors. Gene Ther. 2003; 10 (11): 964-76]. Среди существующих систем доставки антигенов вирусные векторы занимают особое место, поскольку обладают следующими свойствами:

- имеют естественный механизм взаимодействия с клеткой и проникновения в клетку;

- транспортируют чужеродный генетический материал в ядро клетки;

- способны обеспечивать длительную экспрессию антигена;

- вирусная оболочка выполняет защитную функцию для генетического материала, кодирующего антиген.

При введении в организм вирусные векторы проникают в различные типы клеток, где осуществляют экспрессию встроенных в ДНК генов. В этой связи вирусные векторы являются широко используемым инструментом для доставки генов в клетки человека и животных [R. Harrop, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, V.58, I.8, 2006, P.931-947].

Наряду с вышеперечисленным вирусные векторы отличаются высокой эффективностью экспрессии целевого гена в различных типах клеток, безопасностью для человека и животных.

Таким образом, использование вирусных векторов в качестве носителя для действующего вещества заявляемой композиции позволяет доставлять в организм гены целевых белков, что, в свою очередь, обеспечивает продление периода циркуляции продукта целевого гена в организме.

В качестве носителя используют вирусные векторы, полученные на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа. Известно, что аденовирусные векторы используются на практике наиболее часто. В настоящее время на основе аденовирусных векторов разрабатываются вакцины против различных бактериальных (туляремия, туберкулез, бруцеллез и др.) и вирусных (вирус иммунодефицита человека, папилломавирус человека, вирус бешенства, вирус Эбола и др.) патогенов человека [Wang J, Thorson L, Stokes RW, Santosuosso M, Huygen K, Zganiacz A, Hitt M, Xing Z. Single mucosal, but not parenteral, immunization with recombinant adenoviral-based vaccine provides potent protection from pulmonary tuberculosis. J Immunol. 2004 Nov 15; 173 (10): 6357-65; Richardson JS, Yao MK, Tran KN, Croyle MA, Strong JE, Feldmann H, Kobinger GP. Enhanced protection against Ebola virus mediated by an improved adenovirus-based vaccine. PLoS One. 2009; 4(4): e5308. Epub 2009 Apr 23; Li WH, Zhang Y, Wang SH, Liu L, Yang F. Recombinant replication-defective adenovirus based rabies vaccine. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2003 Dec; 25 (6): 650-4; Lees CY, Briggs DJ, Wu X, Davis RD, Moore SM, Gordon C, Xiang Z, Ertl HC, Tang DC, Fu ZF. Induction of protective immunity by topic application of a recombinant adenovirus expressing rabies virus glycoprotein. Vet Microbiol. 2002 Apr 2; 85 (4): 295-303]. Так, были получены аденовирусные векторы, содержащие нуклеотидную последовательность гемагглютинина вируса гриппа человека, для дальнейшего использования в качестве вакцины для человека и животных против патогенного штамма вируса гриппа (Van Kampen KR, Shi Z, Gao P, Zhang J, Foster KW, Chen DT, Marks D, Elmets CA, Tang DC. Vaccine. 2005, V 23, p.1029-1036). Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 включали в ДНК рекомбинантной псевдоаденовирусной наночастицы (РПАН) на основе аденовируса человека 5-го серотипа также с целью использования полученного продукта как вакцины для человека, млекопитающих животных и птиц (Toro Н, Tang DC, Suarez DL, Sylte MJ, Pfeiffer J, Van Kampen KR. Vaccine 2007; Gao W, Soloff AC, Lu X, Montecalvo A, Nguyen DC, Matsuoka Y, Robbins PD, Swayne DE, Donis RO, Katz JM, Barratt-Boyes SM, Gambotto A. J. of Virology, 2006, V.80, №4, p.1959-1964). Также аденовирусные векторы использовали для генной терапии опухолей в случае, когда в их ДНК был клонирован ген опухолевого супрессора р53 (US 7033750). Кроме того, два препарата, представляющих собой аденовирусные векторы на основе аденовируса человека 5-го серотипа, разрешены к применению в онкологии.

Также применение вирусных векторов в качестве носителей наделяет фармацевтическую композицию следующими преимуществами:

- С помощью вирусных векторов может быть решена проблема нестабильности препаратов антител (вводимых в организм в виде белков).

- Вирусные векторы стабильны, могут быть лиофилизованы, могут храниться при 4°C длительное время без потери активности.

- Технологии получения вирусных векторов в промышленных масштабах являются экономически оправданными и позволяют получать препараты с высоким титром. Процесс получения нового вида вирусного вектора занимает несколько недель, что может позволить быстро реагировать на меняющуюся эпидемиологическую обстановку в максимально сжатые сроки [R. Harrop, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, V.58, I.8, 2006, Р.931-947].

- Использование вирусных векторов позволяет обеспечивать наработку протективного уровня антител уже через 96 часов после введения. Более того, протективный уровень антител поддерживается в организме не менее 2-х недель [Kasuya K., Mol Ther. 2005 Feb; 11 (2): 237-44; Sofer-Podesta С., Infect Immun. 2009 Apr; 77 (4): 1561-8; Chiuchiolo M.J., J Infect Dis. 2006 Nov 1; 194 (9): 1249-57] в случае аденовирусных векторов.

Использование препаратов, представляющих собой вирусный вектор, несущий в составе ДНК ген однодоменного мини-антитела, способного нейтрализовать вируса гриппа типа актуального штамма, позволяет обеспечить уже через 48-96 часов защиту организма от циркулирующего на данный момент штамма вируса гриппа. Более того, использование фармацевтической композиции, состоящей из вирусного вектора одного типа, несущего ген однодоменного мини-антитела, и белковых препаратов соответствующего однодоменного мини-антитела позволяет обеспечить защиту организма в период непосредственно после введения препарата, длящуюся как минимум 3-4 недели.

Таким образом, целесообразным является использование комплексного препарата, имеющего две составляющие: однодоменных мини-антител против вируса гриппа типа А и рекомбинантного вирусного вектора, экспрессирующего ген однодоменных мини-антител против вируса гриппа типа А.

Такой препарат будет обладать следующими преимущественными характеристиками:

1) Основой препарата являются антитела - наиболее эффективные природные противовирусные вещества.

2) Кратковременный курс приема (1 раз), что снижает риск развития побочных эффектов и непереносимости.

3) Эффективность действия на различных стадиях развития инфекционного процесса.

4) Возможность использования в качестве дополнения к поздней вакцинации лиц из групп риска в первые 2 недели после вакцинации (на период выработки антител).

5) Возможность использования для лиц с иммунодефицитом, которые на вакцинацию могут дать недостаточный иммунный ответ.

6) Возможность использования для пожилых лиц, для которых эффективность вакцинации снижается и достигает 50-70%, как дополнение к вакцинации.

7) Возможность использования для невакцинированных лиц, находящихся в контакте с заболевшими родственниками и соседями.

8) Возможность использования для тех, кто по каким-либо причинам не был вакцинирован вовремя.

9) Стоимость курса применения подобного препарата сравнима со стоимостью одной дозы вакцины.

Настоящее изобретение объединяет преимущества различных упомянутых подходов и относится к однодоменным мини-антителам, связывающимся/нейтрализующим вирус гриппа, а также к способу применения таких антител как путем использования в качестве носителя действующего вещества (антитела) рекомбинантного вирусного вектора, несущего экспрессирующую кассету, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует однодоменное мини-антитело, связывающееся с вирусом гриппа, так и путем создания фармацевтической композиции, состоящей из однодоменного мини-антитела против вируса гриппа и рекомбинантного вирусного вектора, экспрессирующего данное однодоменное мини-антитело.

Итак, настоящее изобретение относится к однодоменному мини-антителу, характеризующемуся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, специфически связывающемуся с гемагглютинином вируса гриппа типа A (H5N2) и подавляющему инфекцию вируса гриппа типа A (H5N2), и его функционально активным вариантам. Однодоменное мини-антитело, характеризующееся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, в настоящей заявке иногда именуется своим торговым наименованием «Неогриппаб».

Также настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей однодоменное мини-антитело, характеризующееся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, и его функционально активные варианты. Частные случаи такой последовательности включают без ограничения SEQ ID NO: 1 и ее генетически вырожденные варианты.

Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусному вектору, содержащему такую нуклеотидную последовательность и экспрессирующему однодоменное мини-антитело, характеризующееся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, или его функционально активные варианты. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления этого аспекта вирусный вектор является аденовирусным вектором. Однако среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что в качестве вирусных векторов могут быть использованы и некоторые другие вирусы, такие как аденоассоциированные вирусы, лентивирусы.

Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для подавления развития инфекции вируса гриппа A (H5N2), содержащей эффективное количество раскрытого выше однодоменного мини-антитела и/или вирусного вектора, экспрессирующего такое однодоменное мини-антитело. Среднему специалисту в настоящей области техники будет очевидно, что для разных целей (терапевтических, профилактических, комбинированных) может быть предпочтительно использование фармацевтических композиций, содержащих однодоменное антитело или кодирующий его вирусный вектор как по отдельности, так и в сочетании. Настоящее изобретение охватывает каждый такой вариант.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или терапии гриппа, представляющей собой суспензию раскрытых выше рекомбинантных вирусных векторов и/или раскрытых выше однодоменных мини-антител в фармацевтически приемлемом растворителе или наполнителе. Такие фармацевтически приемлемые растворители и наполнители хорошо известны из предшествующего уровня техники (Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., MackPublishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).

Применение такой фармацевтической композиции позволяет добиться транзиторной экспрессии у пациента однодоменных мини-антител, которые за счет своих уникальных свойств, подробно описанных выше, способны обеспечивать достаточно надежную иммунную защиту против вируса гриппа. Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что применение такой фармацевтической композиции эффективно в основном для профилактики, но также и для терапии инфекции.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или терапии гриппа, представляющей собой суспензию раскрытого выше рекомбинантного вирусного вектора и однодоменных мини-антител, связывающихся с вирусом гриппа того же типа и антигенной формулы, что и однодоменное мини-антитело, кодируемое экспрессирующей кассетой, содержащейся в указанном рекомбинантном вирусном векторе, в фармацевтически приемлемом растворителе или наполнителе.

Применение такой фармацевтической композиции позволяет обеспечить достаточно надежную иммунную защиту против вируса гриппа не только в порядке профилактики, но и после инфицирования пациента вирусом гриппа. Разумеется, чем на более ранней стадии инфекции будет применена фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, тем более эффективным окажется такое лечение.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу профилактики или терапии гриппа, предусматривающему введение нуждающемуся в этом пациенту профилактически или терапевтически эффективного количества одной из раскрытых выше фармацевтических композиций.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию вводят интраназально.

В соответствии с более конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения интраназальное введение осуществляют в форме капель или в форме спрея (аэрозоля).

Авторы настоящего изобретения исходят из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных мини-антител, могут служить исходными модулями более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных мини-антител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные мини-антитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных мини-антител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов [Conrath KE, Lauwereys М, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stijlemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor. Nat Med. 2006 May; 12 (5): 580-4; Coppieters K, Dreier T, Silence K, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66]; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы [Harbury Р.В., Zhang T., Kim P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science, 1993, 262: 1401-1407; Shirashi Т., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; Chenchik A., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides. 2010. US Patent Application 20100305002], последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы [Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Plückthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. Nat Biotechnol. 2003, 21 (12): 1486-92.].

Для модулирования свойств препарата однодоменного мини-антитела, например увеличения времени жизни in vivo (в крови пациента), в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности, последовательности белков (таких, например, как сывороточный альбумин) или другое однодоменное мини-антитело, специфически связывающееся с мажорным и долгоживущим белком в крови человека (например, альбумином или иммуноглобулином) [Gibbs WW. Nanobodies. Sci Am. 2005 Aug; 293 (2): 78-83; Harmsen MM, Van Solt CB, Fijten HP, Van Setten MC. Prolonged in vivo residence times of llama single-domain antibody fragments in pigs by binding to porcine immunoglobulins. Vaccine. 2005 Sep 30; 23 (41): 4926-34; Coppieters K, Dreier T, Silence K, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66].

Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных мини-антител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином "однодоменные мини-антитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности однодоменных мини-антител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптации или «форматирования» и их варианты.

Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного однодоменного мини-антитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно от 1 до 15, и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного мини-антитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного мини-антитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная а