Способы получения гибридных/химерных клеток и их применение

Способы получения гибридных/химерных клеток и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к гибридным клеткам и способам получения гибридных клеток. В частности, изобретение относится к гибридным клеткам, полученным гибридизацией по меньшей мере трех клеток, где по меньшей мере две клетки происходят из различных ростков. Кроме того, изобретение относится к применению гибридных клеток для экспрессии белков, пригодных для ряда диагностических, профилактических, терапевтических и/или исследовательских применений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Никакое обсуждение уровня техники на протяжении описания не следует считать допущением того, что такой уровень техники широко известен или составляет часть общей информации в данной области.

В настоящее время для экспрессии белков, которые имеют коммерческое значение в ряде диагностических, профилактических, терапевтических и/или исследовательских применений используют различные типы клеток. На сегодняшний день продукцию таких белков обычно проводят в клетках, таких как клетки бактерий, дрожжей, грибов, клетки насекомых и клетки не являющихся человеком млекопитающих.

Клетки часто модифицируют белки путем множества посттрансляционных модификаций, включая, но, не ограничиваясь ими, гликозилирование, ацилирование, фосфорилирование, метилирование, сульфатацию, пренилирование и липидацию. Эти модификации являются видоспецифическими и, по существу, клетки, используемые в настоящее время для продукции имеющих коммерческое значение белков, обладают посттрансляционными модификациями, которые отличаются от посттрансляционных модификаций, наблюдаемых на белках, экспрессируемых из клеток человека или встречающихся в естественных условиях в организме человека. Например, многие типы клеток не млекопитающих, используемых для продукции имеющих коммерческое значение белков, либо лишены способности гликозилировать белки, либо проявляют паттерны гликозилирования, которые отличаются от паттернов гликозилирования, проявляемых белками, экспрессируемыми в клетках человека.

Даже в экспрессирующих системах, не являющихся человеком млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO), выявлены существенные отличия в паттернах гликозилирования от паттернов гликозилирования клеток человека. Например, клеточные линии CHO, используемые для рекомбинантной экспрессии белков, лишены функционального фермента (α 2,6) сиалилтрансферазы для синтеза (α 2,6)-связанных концевых сиаловых кислот, которые присутствуют в клетках человека. Более того, мотивы сиаловых кислот, которые присутствуют на экспрессируемых клетками CHO гликопротеинах, подвержены деградации эндогенной сиалидазой клеток CHO (Gramer et al. Biotechnology 13 (7):692-&, 1995).

В результате отличающихся репертуаров посттрансляционной модификации в экспрессирующих системах, не являющихся человеческими, белки, экспрессируемые из них, могут проявлять физикохимические и фармакологические характеристики, такие как время полужизни, иммуногенность, стабильность и функциональная эффективность, которые отличаются от этих характеристик у белков, происходящих из клеток человека. Это может существенно влиять на клиническую применимость этих белков.

Также накапливаются данные, что в дополнение к их видозависимой природе, посттрансляционные модификации также могут быть тканеспецифичными и даже специфичными к типу клеток в одном и том же виде. Это, в частности, имеет отношение к тканеспецифичной и специфичной к типу клеток экспрессии белков, проявляющих концевое гликозилирование (Feizi Nature 314: 53-54, 1985; Rademacher et al., Annu Rev Biochem 57:785-838, 1988). В частности, было показано, что три сиалилтрансферазы, которые присоединяют концевые сиаловые кислоты к цепям сахаров гликопротеина, проявляют поразительно отличающуюся экспрессию в семи тканях крысы (Paulson et al., J. Biol. Chem. 264:10931-10934, 1989). Это подтверждает тканеспецифичное гликозилирование одного и того же белка. Более того, исследования с двумя изоформами высоко фосфорилированного гликопротеина (остеопонтина мыши), экспрессированного фибробластами мыши и остеобластами мыши из костного мозга, показали значительные отличия в их степени фосфорилирования, которая коррелировала с отличиями в биологической активности. Эти результаты указывают на то, что функция остеопонтина, продуцируемого различными типами клеток, отличается (Christensen et al., J Biol. Chem. 282(27):19463-19472).

Эффективные клеточные системы, пригодные для продукции биологических веществ, проявляющих полностью человеческие характеристики, в идеальном случае должны удовлетворять ряду критериев, включая, но не ограничиваясь ими, следующие:

a) происхождение из ткани человека;

b) рост в культуре с высокой плотностью;

c) проявляют рентабельные выходы белка;

d) позволяют стабильное встраивание чужеродных генов;

e) допускают способы амплификации генов;

f) позволяют применение родительской клетки для продукции моноклональных антител как в гибридомах человек-человек;

g) проявляют стабильную длительную экспрессию белка;

h) способность расти в бессывороточной и не содержащей глутамина среде;

i) лишены активности эндопептидазы, что, таким образом, снижает деградацию белка,

j) свободны от патогенных агентов, включающих вирусную ДНК и микоплазму;

k) продуцируют белки, которые проявляют посттрансляционные модификации, которые функционально сходны с, или являются такими же, как и посттрансляционные модификации, которые встречаются на природных белках, предпочтительно тканеспецифичные и клеточноспецифичные. Эти посттрансляционные модификации могут включать, но не ограничиваться ими, углеводные части на гликопротеинах.

Хотя существует ряд клеток-хозяев человека или гетерогибридом для экспрессии белков человека, ни одна из них не удовлетворяет успешно всем из критериев, приведенных выше. Особенно следует отметить, что попытки экспрессии и выделения белков из существующих клеточных экспрессирующих систем человека с клинически полезными выходами привели к ограниченному успеху.

Экспрессия белка в эукариотических клетках контролируется на различных стадиях, включая: (a) влияние регуляторных факторов на гены в хроматине; (b) регуляцию инициации транскрипции; и (c) посттрансляционную модификацию. Полагают, что эти различные стадии являются специфичными к стадии развития и/или тканеспецифичными. Таким образом, когда в клетку вводят экзогенный ген, кодирующий желаемой белок, экспрессия желаемого белка может быть менее чем оптимальной. В результате этого могут возникнуть проблемы, такие как отсутствие стабильной экспрессии (Li et al., Proc Natl Acad Sci. USA 95:3650-3654, 1998; Miyaji et al., Cytotechnology, 3:133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4:173-180, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4:39-43, 1990; Satoh et al., Cytotechnology 13:79-88, 1993), низкие выходы экспрессии (Airoldi et al., Cancer Research 61:1285-1290, 2001; Hosoi et al. Cytotechnology 7:25-32, 1991) и неоптимальные посттрансляционные модификации (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003). Все эти факторы могут влиять на потенциальную коммерческую применимость белка.

В качестве одного примера, сублинию клеток Namalwa (B-лимфобластоидные клетки человека, выращенные в суспензионных культурах и адаптированные к бессывороточной и не содержащей альбумина среде), Namalwa KJM-1, использовали для крупномасштабной продукции альфа-интерферона, который представляет собой эндогенный белок для клеток лимфомы Беркитта. Однако, когда в качестве целевого белка для трансфекции путем электропорации использовали белок G-CSF, чужеродный для клеток лимфомы Беркитта, но эндогенный для B-клеток (Airoldi et al., Cancer Research 61:1285-1290, 2001), уровни экспрессии G-CSF варьировали среди множества устойчивых к метотрексату (MTX) клонов, и клон с наиболее высокой продукцией G-CSF имел удельную продуктивность только 2,4 мкг/мл/сутки после адаптации к бессывороточным условиям.

Кроме того, удельная продуктивность снижалась в культуре с высокой плотностью, когда число клеток составляло выше 7×10⁵ клеток/мл (Hosoi et al. Cytotechnology 7:25-32, 1991). Даже несмотря на то, что описанная максимальная концентрация G-CSF была значительно увеличена и достигала 41 мкг/мл, для достижения этого требовалось тщательное и трудоемкое манипулирование условиями культивирования клеток с очень строгим контролем pH. Также было показано, что среда, использованная для оптимального роста, отличалась от среды, которую использовали для оптимальной продукции, что, таким образом, создавало существенное противоречие между желаемой высокой плотностью и высокой скоростью продукции, и приводило к промышленно нецелесообразной системе.

Поскольку экспрессия генов в эукариотах контролируется на нескольких уровнях, которые включают: (a) доступность и достигаемость регулирующих факторов для генов в хроматине; (b) модулирование на доступных промоторах уровня специфической инициации транскрипции; и (c) последующие посттрансляционные события на различных стадиях, присутствие тканеспецифичных и специфичных к стадии развития факторов транскрипции имеет большое влияние на экспрессию генов. Кроме того, регуляция генов конкретного типа клеток требует кооперации нескольких цис-регуляторных последовательностей ДНК, которые представляют собой участки связывания для белков, которые передают молекулярные сигналы генам (Blackwood et al., Science 281:60-63, 1998). Эти последовательности связывают регуляторные белки с образованием комплексов, известных как энхансеосомы (Marika et al., Curr Opin Genet Dev 11(2):205-208, 2001). Таким образом, чем больше отличается клеточное окружение гена-мишени от его обычного клеточного окружения при введении клеток-хозяев человека определенного ростка, тем больше снижается стабильная экспрессия и продукция желаемого белка на высоких уровнях. Когда клетки Namalwa KJM-1 трансфицировали генами чужеродных белков, не являющихся белками, специфичными к ростку лимфобластоидных клеточных линий, таких как бета-интерферон (Miyaji et al., Cytotechnology, 3:133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4:173-180, 1990) или лимфотоксин человека (Miyaji et al., Cytotechnology 4:39-43, 1990) или проурокиназа (Satoh et al., Cytotechnology 13:79-88, 1993), было выявлено, что скорость трансфекции и продуктивность клеток являются еще более низкими.

Эффективная экспрессия чужеродных генов в специфичных клеточных линиях определенного ростка человека также требует тщательного, и иногда трудоемкого отбора пригодного энхансера/промотора, которые могут содержать участки связывания для ядерных факторов, доступных в человеческих клетках-хозяевах. Нахождение такого энхансера/промотора может, тем не менее, приводить к ограниченной пригодности такого промотора. Например, когда несколько энхансеров/промоторов, таких как ранний промотор генов вируса обезьян 40 (SV40), главный предранний промотор генов цитомегаловируса человека (hCMV), промотор вирус лейкоза мышей Молони (Mo-MuLV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV) и промотор β-актина курицы, исследовали в отношении более эффективной экспрессии чужеродного гена в клетках Namalwa KJM-1, было выявлено, что промотор Mo-MuLV является приблизительно в 10 раз более сильным, чем традиционный ранний промотор SV40 и клоны с высокой продуктивностью достигали продуктивности 30-40 мкг/10⁶ клеток/сутки (Satoh et al., Cytotechnology 18:162-172, 1996). Однако проблема применения ретровирусных векторов, таких как Mo-MuLV, состоит в том, что их трудно использовать для трансфекции генов с инвертированными последовательностями (интронами) вследствие их удаления аппаратом ядерного сплайсинга (Li et al., Proc Ntl Acad Sci., USA 95:3650-3654, 1998).

Несоответствие между клеточным и ядерным окружением еще более усиливается в случае белков, кодируемых двумя генами, такими как антитела. Кроме того, хотя клетки Namalwa KJM-1 использовали для получения гибридом человек-человек, выходы антител привели к непригодности этой клеточной линии для промышленной продукции.

В качестве другого примера, было показано, что клеточная линия почки эмбриона человека 293 очень легко трансфицируется генами чужеродного происхождения с высокой степенью стабильности. Однако белки, происходящие из трансфектантов 293, имеют ограниченное применение и обычно пригодны только для целей исследования, поскольку клетки 293 включают ДНК аденовируса Ad5 человека (клетки HEK 293). Однако наибольшее ограничение при использовании клеток 293 в коммерческих условиях состоит в их прикрепляющемся характере. Был предпринят ряд попыток для адаптации клеток 293 к эффективной трансфекции в суспензии с использованием экономически целесообразных носителей, таких как полиэтиленимин (Durocher et al., Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Schlaeger et al., Cytotechnology 30:71-83, 1999) или фосфат кальция (Girard et al, Cytotechnology 38:15-21, 2002; Jordan et al., Cytotechnology 26:39-47, 1998; Meissner et al., Biotechnol Bioeng 75(2):197-203, 2001). Однако эти носители приводят только к временной экспрессии рекомбинантных белков, что означает, что трансфекцию необходимо повторять для каждой новой партии посеянной культуры. Для достижения роста в суспензии и высокой экспрессии белка, когда oriP EBV присутствует в остове вектора, клетки 293 необходимо генетически модифицировать для стабильной экспрессии белка EBNA1 вируса Эпштейна-Барр (293E) (Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30(2):e9, 2002; Parham et al., Cytotechnology 35:181-187, 2001; Schlaeger et al., Cytotechnology 30:71-83, 1999). Даже после трансфекции посредством EBNA1, клетки 293E, при выращивании в бессывороточной среде (HEK293 EBNA1), (необходимое условие для крупномасштабной продукции) проявляют очень низкую скорость трансфекции, наиболее вероятно, вследствие присутствия полианионов (гепарин, сульфат декстрана), которые добавляют для предупреждения агрегации клеток. Были предприняты попытки решения этой проблемы путем дополнения среды пептонами, полученными ферментативным гидролизом животных источников, таких как мясо, желатин и казеин (Pham et al., Biotechnol Bioeng 84(3):332-42, 2003). Когда клеточную линию HEK293 EBNA1 использовали для продукции Tie-2 (рецепторная тирозинкиназа для ангиопоэтиновых факторов роста) и Нейропилина-1 ED (рецептор, который опосредует регуляцию нейрональных клеток), экспрессия белка была ограничена низкой плотностью клеток полученных культур по сравнению с нетрансфицированными культурами. Также чистота >95% полученного белка пригодна только для продуктов исследовательской категории. Кроме того, клетки HEK293 EBNA1 не пригодны для продукции моноклональных антител (mAb).

Современные стратегии продукции терапевтических mAb включают применение клеточных систем млекопитающих (т.е. трансфектом CHO или NSO) для рекомбинантной продукции mAb, получаемых путем иммунизации трансгенных мышей, несущих гены Ig человека (ксеномыши), гуманизации mAb грызунов или путем скрининга библиотек mAb человека (van Dijk et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). В то время, как с точки зрения их последовательности, недавно терапевтические mAb стали преобразовывать в химерные (вариабельные области грызуна и константные области человека), гуманизированные (последовательность человека, за исключением определяющих комплементарность областей грызунов) и полностью человеческие антитела (Ab человека) для минимизации аллергического ответа, важным аспектом терапевтического mAb является его способность индуцировать иммунные эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность, которая нарушается, если mAb продуцируется в клетках-хозяевах не млекопитающих, которые изменяют его нативный паттерн гликозилирования (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003). В виду этих факторов, идеальный сценарий состоит в том, чтобы терапевтические антитела продуцировались клетками человека. В этом случае, полностью человеческие mAb могут быть способны осуществлять эффекторные функции человека и имеют очень ограниченную иммуногенность, вследствие их нативной для человека структуры.

Описано получение гибридом или трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (EBV) лимфобластоидных клеточных линий, происходящих из B-клеток человека (Kirman et al., Hybrid. Hybridomics 21: 405-414, 2002; Boerner et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991; Zafiropoulos et al., J. Immunol. Methods 200:181-190, 1997). Однако ограничена информация об охарактеризации этих mAb и клеточных линий в отношении их длительной стабильности и пригодности для процессов производства, особенно в отношении уровней продукции и стабильности секреции Ig на протяжении производства всей партии. Хотя были описаны клеточные линии, продуцирующие mAb человека против GM-CSF человека с совокупным титром 1,2 г/литр в течение 4-суток, эти клеточные линии были получены гибридизацией (слиянием) соматических клеток между первичными B-клетками человека и клетками гетеромиелолимфомы K6H6/B5 (т.е. клеточной линией мыши-человека, полученной гибридизацией B-клеточной лимфомы человека и клетки миеломы мыши (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 103(10):3557-3562, 2006).

В случае трансформации EBV, трудность состояла в установлении полностью иммортализованной B-клеточной линии человека при сохранении стабильной продукции антител. Это является следствием низкой эффективности иммортализации, остановки роста клеток и доминантной иммортализации продуцирующих IgM клеток. Кроме того, в недавних сообщениях было показано, что большинство трансформированных EBV B-клеток имеют укороченные теломеры и ограниченную продолжительность жизни, по большей части на уровнях менее 160 удвоений популяций (Sugimoto et al., J Virol 73:9690-9691, 1999; Toda et al., J Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787:197-206, 2003). Для преодоления этой проблемы были предприняты попытки гибридизации (или слияния) трансформированных EBV B-клеток с пригодной клеточной линией-партнером (экспрессирующей системой), однако в действительности эти клеточные линии-партнеры представляли собой различные комбинации гетерогибридов, такие как триома, происходящая из гетерогибридомы мыши-человека с B-клетками человека (Ainai et al., Hum Antibodies 15:139-154, 2006; Kalantarov et al., Hum Antibodies 11:85-96, 2002; Karpas et. al., Proc Natl Acad Sci USA 98:1799-1804, 2001). Когда такую триому подвергали слиянию с первичными трансформированными EBV B-клетками, продуцирующими антитело к столбнячному токсину (TT), это приводило к тетроме, имеющей на одну четверть компонент мыши. Хотя стабильная продукция mAb к TT была возможна после трехкратного последовательного клонирования тетром, такие повторяющиеся стадии клонирования клеток являются трудоемкими и требующими времени. Кроме того, хотя количества mAb, продуцируемых тетромами, были достаточными для экспериментальных целей, уровни были недостаточными для крупномасштабной продукции mAb в качестве фармацевтических средств. Все еще вызывает сомнение, может ли иммортализация в присутствии поликлонального активатора CpG 2006 или лигирования вместе CD19 или BCR приводить к полной системе для эффективной продукции специфических mAb в подходящих объемах для терапевтического применения (Hartman et al., J Immunol 164:944-953, 2000; Hur et al., Cell Prolif 38:35-45, 2005; Traggiai et al., Nat Med 10:871-875, 2004).

Был испробован ряд подходов для применения клеток человека для продукции биологических веществ, таких как факторы роста, антитела и растворимые белки.

Задачей настоящего изобретения является преодоление или уменьшение по меньшей мере одного из недостатков уровня техники, или предоставление пригодной альтернативы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Главным образом, считают, что многократно слитые клетки являются нестабильными, и что чем больше клеток вовлечено в слияние, тем большей является нестабильность полученной гибридной клетки. Неожиданно, в настоящем изобретении гибридные клетки, полученные слиянием нескольких клеток, например трех клеток, проявляют функциональную стабильность. В частности, было открыто, что клетки, происходящие из различных ростков, можно подвергать соматическому слиянию или гибридизовать с образованием по существу стабильных химерных/гибридных клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к химерным/гибридным клеткам перекрестного происхождения, полученным гибридизацией по меньшей мере трех родительских клеток, приводящей к тройному гибриду, где по меньшей мере две родительские клетки происходят из различных ростков, и где в гибридизацию не включена клетка миеломы.

Также неожиданно было открыто, что стабильные химерные/гибридные клетки по изобретению применимы, например, для продукции белков, которые проявляют желаемые посттрансляционные модификации, такие как, но не ограничиваясь ими, паттерны гликозилирования человека.

Также было неожиданно открыто, что уровни экспрессии желаемого белка из стабильных химерных/гибридных клеток по изобретению могут увеличиваться, когда из химерных/гибридных клеток по изобретению одновременно экспрессируется второй желаемый белок. Более того, уровни экспрессии двух белков-мишеней могут увеличиваться при одновременной экспрессии третьего желаемого белка из химерных/гибридных клеток по изобретению.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает существенные преимущества над ранее известными системами с точки зрения универсальности и стабильности гибридных клеток. В одном варианте осуществления гибридные клетки по изобретению получают слиянием двух идентичных клеток или двух клеток одного ростка и клетки другого ростка. Такой гибрид склонен к фенотипу, направленному в сторону большинства типов клеток, использованных для гибридизации. Эти гибридные клетки можно использовать, в частности, для экспрессии белков, в которых, как известно, тканеспецифические посттрансляционные модификации являются важными для функциональности белка. Например, цитокин, известный тем, что он имеет определенную функциональную посттрансляционную модификацию при экспрессии из B-клетки, может более эффективно экспрессироваться из гибридной клетки, которая включает по меньшей мере две клетки, происходящие из B-клеточного ростка, таким образом, обеспечивая функциональную посттрансляционную модификацию.

Поскольку посттрансляционная модификация белков может быть тканеспецифичной или специфичной к типу клетки, специалисту в данной области будет очевидно, что гибридные клетки по изобретению также можно обогащать конкретным типом клеток или фенотипом (на что указывает присутствие конкретных CD-маркеров) для обеспечения экспрессии белка, проявляющего желаемую посттрансляционную модификацию или желаемую функциональность, ассоциированную с конкретным типом клеток или фенотипом.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гибридным клеткам, вовлекающим применение по меньшей мере одной иммортализованной клетки. Однако специалисту в данной области будет очевидно, что настоящее изобретение также относится к слиянию неиммортализованных клеток, которые впоследствии могут быть иммортализованы способом трансформации in vitro, таким как встраивание вирусных генов, например, генов вируса Эпштейна-Барр (EBV), гена T-антигена вируса 40 обезьян (SV40), E1A и E1B аденовируса, и E6 и E7 папилломавируса человека (HPV). Альтернативно неиммортализованные клетки можно иммортализовать путем экспрессии белка теломеразной обратной транскриптазы (TERT). Иммортализованные клетки также могут происходить из клеток, в которых модифицирована экспрессия онкогена. Иммортализованные клетки, кроме того, могут быть получены любым действием, которое индуцирует способность к неограниченному росту, включая, но не ограничиваясь ими, воздействие УФ или спонтанную трансформацию, при которой механизм бессмертия неизвестен.

Будет понятно, что настоящее изобретение относится, в одном варианте осуществления, к слиянию трех отдельных клеток. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к слиянию трех популяций клеток, где каждая популяция включает множество идентичных типов клеток. Специалисту в данной области будет понятно, что слияние популяций клеток можно проводить в смешанных клеточных культурах. Затем желаемые гибридизованные клетки можно идентифицировать, и выделять способами, хорошо известными в данной области, например с помощью селективной среды, такой как среда с гипоксантин-аминоптерин-тимидином (HAT). Альтернативно слитые клетки можно идентифицировать, и выделять путем идентификации конкретных клеточных маркеров, таких как маркеры CD.

Будет очевидно, что выделение клеток на основе экспрессии ими маркеров, таких как маркеры CD, а также обогащение клетки конкретным типом клетки или фенотипом, можно проводить способами, хорошо известными в данной области, такими как, способы активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS).

Также будет очевидно, что клетки по настоящему изобретению можно стабильно или временно трансфицировать ДНК, кодирующей желаемый белок. Эти стабильно или временно трансфицированные клетки можно идентифицировать способами, хорошо известными в данной области, например, путем включения селективного репортерного гена в ДНК, используемую для трансфекции. Такие репортерные гены могут включать гены, которые обеспечивают рост трансфицированных клеток в среде с дефицитом соединения, например ген дигидрофолатредуктазы (dhFr). Репортеры также могут включать гены, которые обеспечивают визуальную идентификацию трансфицированных клеток, например, ген люциферазы или ген зеленого флуоресцентного белка (gfp). Альтернативно репортерный ген может обеспечить устойчивость к конкретному соединению, например G418. Такие репортерные гены хорошо известны в данной области.

В одном предпочтительном варианте осуществления гибридные клетки по изобретению можно использовать для экспрессии моноклональных антител. Традиционно, продукцию моноклональных антител проводят путем слияния клетки миеломы и B-клетки, происходящей из селезенки иммунизированного животного, такого как мышь. Однако нестабильность клеток миеломы и, в частности, геномная нестабильность, может приводить к менее чем, удовлетворительной экспрессии желаемого антитела. Кроме того, поскольку для продукции гибридом используют клетки животных, продуцированные антитела обладают не являющимися человеческими посттрансляционными модификациями. Антитела с не являющимися человеческими посттрансляцинными модификациями могут приводить к существенным проблемам, когда антитела используют в качестве лекарственных средств у человека. Эти проблемы могут включать сниженную эффекторную функцию антитела, а также иммуногенность, приводящие к неудовлетворительному времени полужизни in vivo и, таким образом, сниженной эффективности in vivo. Также существуют данные, указывающие на то, что гибриды не могут успешно продуцироваться в отсутствие миеломной клетки. Гибридные клетки по изобретению неожиданно продемонстрировали, что стабильные гибриды можно продуцировать в отсутствие миеломной клетки. Более того, антитела, экспрессируемые с гибридных клеток по изобретению, решают проблемы, ассоциированные с применением моноклональных антител, продуцируемых гибридомами. Эти антитела проявляют гуманизированные посттрансляцонные модификации и экспрессируются из клеток, которые обладают функциональной стабильностью.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится гибридной клетке, полученной гибридизацией: первой клетки, где указанная первая клетка представляет собой стволовую клетку или клетку, происходящую из некоммитированной клетки-предшественника; второй клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника; и третьей клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, и где указанная первая клетка не является миеломной клеткой.

В одном варианте осуществления указанная вторая клетка представляет собой клетку, происходящую из B-лимфоидного ростка, и указанная третья клетка представляет собой клетку, происходящую из B-лимфоидного ростка.

В другом варианте осуществления указанная вторая клетка представляет собой клетку, происходящую из T-лимфоидного ростка, и указанная третья клетка происходит из T-лимфоидного ростка.

В другом варианте осуществления указанная вторая клетка представляет собой клетку, происходящую из B-лимфоидного ростка, и указанная третья клетка представляет собой клетку, происходящую из T-лимфоидного ростка.

Предпочтительно, указанная первая клетка представляет собой клетку, происходящую из общей миелоидной клетки-предшественника. По существу, очевидно, что изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

Предпочтительно, указанная клетка, происходящая из общей миелоидной клетки-предшественника, представляет собой миеломоноцитарного предшественника, моноцит, макрофаг, эозинофил, нейтрофил, дендритную клетку или базофил. По существу, очевидно, что изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией миеломоноцитарного предшественника, моноцита, макрофага, эозинофила, нейтрофила, дендритной клетки или базофила и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Изобретение также относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией миеломоноцитарного предшественника, моноцита, макрофага, эозинофила, нейтрофила, дендритной клетки или базофила, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

Предпочтительно, указанная клетка, происходящая из общей миелоидной клетки-предшественника, экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD16, CD15 или CD14. По существу, очевидно, что изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника, которая экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD16, CD15 или CD14, и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией гибридной клетки, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника, которая экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD16, CD15 или CD14, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

В одном варианте осуществления указанная клетка, происходящая из общей миелоидной клетки-предшественника, представляет собой моноцит. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией моноцита и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией моноцита, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

В другом варианте осуществления указанная клетка, происходящая из общей миелоидной клетки-предшественника, представляет собой первичного миеломоноцитарного предшественника. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией первичного миеломоноцитарного предшественника и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией первичного миеломоноцитарного предшественника, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

В одном варианте осуществления указанная клетка, происходящая из общей миелоидной клетки-предшественника, представляет собой иммортализованную клетку. По существу, очевидно, что изобретение относится к гибридной клетке, полученной путем гибридизации иммортализованной клетки, выбранной из миеломоноцитарного предшественника, моноцита, макрофага, эозинофила, нейтрофила, дендритной клетки или базофила и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией иммортализованной клетки, выбранной из миеломоноцитарного предшественника, моноцита, макрофага, эозинофила, нейтрофила, дендритной клетки или базофила, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

В другом варианте осуществления указанная клетка, происходящая из общей миелоидной клетки-предшественника, происходит из селезенки, периферической крови, пуповинной крови или костного мозга. По существу, очевидно, что изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника, происходящей из селезенки, периферической крови, пуповинной крови или костного мозга, и двух B-лимфоидных клеток или двух T-лимфоидных клеток. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника, происходящей из селезенки, периферической крови, пуповинной крови или костного мозга, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки.

В другом варианте осуществления указанная клетка, происходящая из B-лимфоидного ростка, представляет собой пре-B-клетку, незрелую B-клетку, наивную B-клетку, активированную B-клетку или эффекторную B-клетку. По существу, очевидно, что изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки и двух B-лимфоидных клеток, выбранных из пре-B-клетки, незрелой B-клетки, наивной B-клетки, активированной B-клетки или эффекторной B-клетки. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, B-лимфоидной клетки, выбранной из пре-B-клетки, незрелой B-клетки, наивной B-клетки, активированной B-клетки или эффекторной B-клетки и T-лимфоидной клетки.

В одном варианте осуществления указанная эффекторная B-клетка представляет собой обученную антигеном B-клетку или плазматическую клетку. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки и двух B-лимфоидных клеток, выбранных из обученной антигеном B-клетки или плазматической клетки. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, обученной антигеном B-клетки или плазматической клетки и T-лимфоидной клетки.

В одном варианте осуществления, указанная клетка, происходящая из B-лимфоидного ростка, экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD19, CD20, CD72 или CD5. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки и двух B-лимфоидных клеток, которые экспонируют по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD19, CD20, CD72 или CD5. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, B-лимфоидной клетки, которая экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD19, CD20, CD72 или CD5, и T-лимфоидной клетки.

В одном варианте осуществления, указанная клетка, происходящая из T-лимфоидного ростка, представляет собой пре-T-клетку, незрелую T-клетку, наивную T-клетку, активированную T-клетку или эффекторную T-клетку. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, получаемой гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки, выбранной из пре-T-клетки, незрелой T-клетки, наивной T-клетки, активированной T-клетки или эффекторной T-клетки. Также изобретение относится к гибридной клетке, получаемой гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки и двух T-лимфоидных клеток, выбранных из пре-T-клетки, незрелой T-клетки, наивной T-клетки, активированной T-клетки или эффекторной T-клетки.

В одном варианте осуществления указанная клетка, происходящая из T-лимфоидного ростка, экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD3, CD4, CD5 или CD8. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, B-лимфоидной клетки и T-лимфоидной клетки, которая экспонирует по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD3, CD4, CD5 или CD8. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки и двух T-лимфоидных клеток, выбранных из T-клеток, которые экспонируют по меньшей мере один из следующих антигенов CD: CD3, CD4, CD5 или CD8.

В одном варианте осуществления указанная клетка, происходящая из B-лимфоидного ростка, представляет собой иммортализованную клетку. По существу, изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки и двух B-лимфоидных клеток, по меньшей мере одна из которых может быть бессмертной клеткой. Также изобретение относится к гибридной клетке, полученной гибридизацией общей миелоидной клетки-предшественника или стволовой клетки, бессмертной B-ли