Иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus

Иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №61/219134, поданной 22 июня 2009 года, все содержание которой тем самым включено сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим полипептиды и капсульные полисахариды, выделенные из Staphylococcus aureus. Кроме того, изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа у субъектов против Staphylococcus aureus с использованием иммуногенных композиций полипептидов Staphylococcus aureus и капсульных полисахаридов. Образующиеся в результате антитела также можно использовать для лечения или предупреждения инфекции Staphylococcus aureus посредством пассивной иммунотерапии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Люди являются природным резервуаром для Staphylococcus aureus (S. aureus). Здоровые индивидуумы могут быть колонизированы S. aureus на коже, в ноздрях и в горле постоянно (10-35%), периодически (20-75%) или находиться в состоянии неносительства (5-70%) без ассоциированного заболевания. Смотрите Vandenbergh et al., J. Clin. Micro. 37:3133-3140 (1999). Впоследствии заболевание случается, когда у индивидуумов ослабевает иммунитет вследствие нарушений в иммунных барьерах, как, например, во время хирургического вмешательства, установки постоянных катетеров или других устройств, травмы или ран. Возникающая в результате инфекция S. aureus может вызывать широкий спектр разных заболеваний, которые варьируют от легких инфекций кожи до эндокартита, остеомиелита, бактериемии, сепсиса и других форм заболевания с сопровождающим высоким процентом смертности. Большой человеческий резервуар увеличивает возможность для эволюции и распространения адаптированных патогенных типов клонов.

Инвазивные стафилококковые инфекции от грамположительных кокков S. aureus и S. epidermidis вызывают особую озабоченность из-за того, что они представляют собой возрастающую проблему для здравоохранения во всем мире. В особенности, S. aureus отвечает за большинство внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций, и его распространенность среди внебольничных (community onset) инфекциях возрастает. Например, заболеваемость инвазивным, устойчивым к метициллину S. aureus (MRSA) была оценена как 31,8 на 100000 человек, включая 18650 смертельных случаев в Соединенных Штатах в 2005 году. Смотрите Klevens R.M. et al., JAMA, 298:1763-71 (2007).

За последние 20 лет стафилококковые заболевания претерпели резкий подъем, причем этот подъем идет параллельно с применением внутрисосудистых устройств и инвазивных процедур. Данное увеличение частоты заболевания вызывает все большую озабоченность из-за параллельного увеличения устойчивости к антибиотикам, следовательно, существует срочная потребность в иммуногенных композициях для применения в вакцинах или для индукции поликлональных или моноклональных антител для придания пассивного иммунитета в качестве средства для предупреждения или лечения стафилококковой инфекции и ассоциированных заболеваний.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на многоантигенную или многокомпонентную иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере три антигена, выделенных из бактерии-стафилококка. Антигены, которые представляют собой полипептиды и полисахариды, могут быть получены, среди прочего, непосредственно из бактерии с использованием методик выделения, известных специалистам в данной области, или они могут быть продуцированы с использованием протоколов синтеза, или они могут быть продуцированы рекомбинантно с использованием методик генной инженерии, также известных специалистам в данной области, или посредством комбинации любого из вышеупомянутого. В определенных воплощениях иммуногенная композиция по изобретению содержит три или более чем три антигена, выбранных из выделенного полипептида фактора слипания A S. aureus (ClfA), выделенного полипептида фактора слипания В S. aureus (ClfB), выделенного капсульного полисахарида типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированного с белком-носителем, выделенного капсульного полисахарида типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированного с белком-носителем, и выделенного белка MntC S. aureus. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены способы индуцирования иммунного ответа против бактерии-стафилококка, способы предупреждения, уменьшения тяжести или задержки начала заболевания, вызываемого бактерией-стафилококком, и способы предупреждения, уменьшения тяжести или задержки начала по меньшей мере одного симптома заболевания, вызванного инфекцией бактерией-стафилококком.

Соответственно, в одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания А S. aureus (ClfA), выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания А S. aureus (ClfA), выделенный фактор слипания В S. aureus (ClfB), выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания А S. aureus (ClfA), выделенный полипептид фактора слипания В S. aureus (ClfB), выделенный белок MntC S. aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания А S. aureus (ClfA), выделенный белок MntC S. aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания В S. aureus (ClfB), выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания В (ClfB) S. aureus, выделенный белок MntC S. aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный полипептид фактора слипания A (ClfA) S. aureus, выделенный полипептид фактора слипания В (ClfB) S. aureus и выделенный белок MntC S. aureus.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая выделенный белок MntC S. aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированный с белком-носителем.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит выделенный фрагмент полипептида ClfA, где фрагмент полипептида ClfA содержит фибриногенсвязывающий домен ClfA. В одном воплощении фрагмент полипептида ClfA содержит фибриногенсвязывающий домен, содержащий домены N1, N2 и N3 ClfA. В одном воплощении фрагмент полипептида ClfA содержит фибриногенсвязывающий домен, содержащий домены N2 и N3 ClfA. В одном воплощении композиции, содержащие фибриногенсвязывающий домен ClfA, демонстрируют ослабленное связывание с фибриногеном. В одном воплощении фибриногенсвязывающий домен ClfA связывается с фибриногеном в меньшей степени по сравнению со связыванием с фибриногеном, наблюдаемым для нативного фибриногенсвязывающего домена ClfA. В одном воплощении композиции, содержащие фибриногенсвязывающий домен ClfA, демонстрируют ослабленное связывание с фибриногеном и имеют аминокислотную замену по одному или более чем одному из Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 и Ile 387 полноразмерного белка, содержащего сигнальную последовательность. В одном воплощении композиции, содержащие фибриногенсвязывающий домен ClfA, демонстрируют аминокислотную замену по одному или более чем одному из Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 и Ile 387, где аминокислота в любом одном или более чем одном из этих положений заменена на Ala или Ser. В одном воплощении композиция содержит фибриногенсвязывающий домен ClfA, где Tyr в положении 338 заменен на Ala.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит выделенный фрагмент полипептида ClfB, где фрагмент полипептида ClfB содержит фибриногенсвязывающий домен ClfB. В одном воплощении фрагмент полипептида ClfB содержит фибриногенсвязывающий домен, содержащий домены N1, N2 и N3 ClfB. В одном воплощении фрагмент полипептида ClfB содержит фибриногенсвязывающий домен, содержащий домены N2 и N3 ClfB. В одном воплощении композиции, содержащие фибриногенсвязывающий домен ClfB, демонстрируют ослабленное связывание с фибриногеном. В одном воплощении фибриногенсвязывающий домен ClfB связывается с фибриногеном в меньшей степени по сравнению со связыванием с фибриногеном, наблюдаемым для нативного фибриногенсвязывающего домена ClfB.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S. aureus, который представляет собой высокомолекулярный полисахарид с молекулярной массой от 20 до 1000 кДа. В одном воплощении высокомолекулярный полисахарид типа 5 имеет молекулярную массу от 50 до 300 кДа. В одном воплощении высокомолекулярный полисахарид типа 5 имеет молекулярную массу от 70 до 150 кДа.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 5 S. aureus, который O-ацетилирован на 10%-100%. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 5 S. aureus, который O-ацетилирован на 50%-100%. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 5 S. aureus, который O-ацетилирован на 75%-100%.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 8 S. aureus, который представляет собой высокомолекулярный полисахарид с молекулярной массой от 20 до 1000 кДа. В одном воплощении высокомолекулярный полисахарид типа 8 имеет молекулярную массу от 50 до 300 кДа. В одном воплощении высокомолекулярный полисахарид типа 8 имеет молекулярную массу от 70 до 150 кДа.

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 8 S. aureus, который O-ацетилирован на 10%-100%. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 8 S. aureus, который O-ацетилирован на 50%-100%. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид типа 8 S. aureus, который O-ацетилирован на 75%-100%.

В одном воплощении капсульный полисахарид 5 и/или 8, присутствующий в иммуногенной композиции, конъюгирован с белком-носителем. В одном воплощении белок-носитель представляет собой анатоксин CRM₁₉₇ Corynebacterium diphtheriae (С. diphtheriae).

В одном воплощении иммуногенная композиция содержит MntC S. aureus, который представляет собой липидированный белок. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит MntC S. aureus, который не является липидированным белком.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, как здесь описано, дополнительно содержащая по меньшей мере один белок из семейства белков с серин-аспартатными повторами (Sdr), выбранный из группы, состоящей из SdrC, SdrD и SdrE.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, как здесь описано, дополнительно содержащая белок с поверхностной детерминантой В железа (IsdB).

В каждом из описанных здесь воплощений, в которых иммуногенная композиция содержит три или более чем три из перечисленных антигенов, данная композиция может дополнительно содержать другие иммуногенные и/или неиммуногенные вещества. В определенных воплощениях каждая иммуногенная композиция может, в качестве альтернативы, «состоять по существу из» или «состоять из» трех или более чем трех перечисленных антигенов и дополнительно содержать одно или более чем одно неиммуногенное вещество, как здесь описано более подробно.

В одном воплощении согласно изобретению предложена иммуногенная композиция, как здесь описано, дополнительно содержащая любой из следующих антигенов: Орр3а, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi FmtB, альфа-гемолизин (hla), бета-гемолизин, фибронектинсвязывающий белок A (fnbA), фибронектинсвязывающий белок В (fnbB), коагулаза, Fig, map, лейкоцидин Пантона-Валентина (pvl), альфа-токсин и его варианты, гамма-токсин (hlg) и варианты, ica, иммунодоминантный ABC транспортер, Mg²⁺ транспортер, Ni ABC транспортер, RAP, автолизин, рецепторы ламинина, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, ЕВР, сиалосвязывающий белок II кости, предшественник ауреолизина (AUR)/Sepp1, Cna, и их фрагментов, таких как М55, TSST-1, mecA, экзополисахарид поли-N-ацетилглюкозамин (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, витронектинсвязывающий белок, HarA, EsxA, EsxB, энтеротоксин А, энтеротоксин В, энтеротоксин С1 и новый автолизин. В определенных воплощениях изобретения, когда иммуногенная композиция содержит определенные формы СР5 и/или СР8, она может дополнительно не содержать PNAG.

В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В одном воплощении иммуногенную композицию используют для приготовления вакцины в виде препарата. В одном воплощении вакцину используют для индукции иммунного ответа против S. aureus у субъекта. В одном воплощении иммуногенную композицию используют для получения композиции антител для придания субъекту пассивного иммунитета.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ индукции иммунного ответа против S. aureus, включающий введение субъекту иммуногенного количества любой из описанных здесь иммуногенных композиций и фармацевтически приемлемого носителя.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ предупреждения или уменьшения инфекции S. aureus или способ предупреждения или уменьшения тяжести по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной S. aureus, причем данные способы включают введение субъекту иммуногенного количества любой из описанных здесь иммуногенных композиций и фармацевтически приемлемого носителя.

В одном воплощении способы индукции иммунного ответа против S. aureus включают доставку иммуногенных композиций с адъювантом. В одном воплощении предложены способы индукции иммунного ответа против S. aureus для доставки иммуногенных композиций с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном воплощении иммунный ответ, индуцированный описанными здесь иммуногенными композициями, предупреждает или ослабляет заболевание или состояние, ассоциированное со стафилококковым организмом у субъекта, или предупреждает или ослабляет один или более чем один симптом, ассоциированный со стафилококковым организмом у субъекта. В одном воплощении заболевание выбрано из группы, состоящей из инвазивного заболевания, вызванного S. aureus, сепсиса и носительства.

В одном воплощении индуцированный иммунный ответ включает генерирование антител, имеющих опсонофагоцитирующую активность (ОРА) против S. aureus. В одном воплощении индуцированный иммунный ответ включает генерирование более высоких титров опсонофагоцитирующих антител специфичных в отношении S. aureus, по сравнению с титром, наблюдаемым у неиммунизированных субъектов. В одном воплощении опсонофагоцитарный титр составляет по меньшей мере 1:20.

В одном воплощении S. aureus, против которого индуцируется иммунный ответ, представляет собой MRSA. В одном воплощении S. aureus, против которого индуцируется иммунный ответ, представляет собой MSSA (чувствительный к метициллину S. aureus). В одном воплощении S. aureus, против которого индуцируется иммунный ответ, представляет собой VRSA (устойчивый к ванкомицину S. aureus). В одном воплощении S. aureus, против которого индуцируется иммунный ответ, представляет собой VISA (S. aureus, обладающий промежуточной устойчивостью к ванкомицину).

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ предупреждения стафилококковой инфекции у субъекта, подвергающегося хирургической процедуре, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества любой из иммуногенных композиций, как здесь описано, до хирургической процедуры. Хирургическая процедура может быть плановой (elective) хирургической процедурой или внеплановой (non-elective) хирургической процедурой. В одном воплощении хирургическая процедура представляет собой кардиоторакальную хирургическую процедуру. В одном воплощении субъект представляет собой человека, домашнее (veterinary) животное или домашний скот.

В одном воплощении согласно изобретению предложен способ придания субъекту пассивного иммунитета, включающий стадии (1) получения препарата антител с использованием иммуногенных композиций по изобретению и (2) введения препарата антител субъекту для придания пассивного иммунитета.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 показаны разные формы рекомбинантного ClfA и раскрыты SEQ ID NO:125 и 127-129, соответственно, в порядке появления.

На Фиг.2 показаны стадии клонирования, использованные для конструирования pLP1179 для экспрессии ClfA. bp - пар(а) оснований.

На Фиг.3 показан экспрессионный вектор T7ClfA_(N123)Y338A, pLP1179.

На Фиг.4 показана повторяющаяся структура полисахаридов СР5 и СР8.

На Фиг.5А и 5Б показаны профили молекулярной массы СР5 (А) и СР8 (Б), продуцированных при различных рН жидкой питательной среды.

На Фиг.6А и 6Б показаны профили молекулярной массы СР5 (А) и СР8 (Б), продуцированных при различных температурах.

На Фиг.7 продемонстрирована корреляция молекулярной массы очищенных СР5 и СР8 со временем обработки для мягкого кислотного гидролиза.

На Фиг.8А-8Д показано выравнивание ClfA между разными штаммами S. aureus (SEQ ID NO:62, 64, 68, 84, 70, 104, 66, 78, 86, 88, 90, 72, 74, 76, 80, 94, 82, 92, 96, 98, 100, 102, 106 и 108, соответственно, в порядке появления).

На Фиг.9 показано филогенетическое древо ClfA.

На Фиг.10А-10Д показано выравнивание ClfB между разными штаммами S. aureus (SEQ ID NO:26, 28, 32, 18, 54, 34, 36, 30, 16, 20, 22, 24, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58 и 60, соответственно, в порядке появления).

На Фиг.11 показано филогенетическое древо ClfB.

На Фиг.12 показано выравнивание MntC между разными штаммами S. aureus (SEQ ID NO:2, 8, 10, 4, 6, 14 и 12, соответственно, в порядке появления).

На Фиг.13 продемонстрировано то, что поликлональные кроличьи антитела против ClfA уменьшают число колоний S. aureus 659-018 в мышиной модели сепсиса.

На Фиг.14 продемонстрировано то, что активная иммунизация ClfA уменьшает колонизацию сердца S. aureus PFESA0003 в кроличьей модели инфекционного эндокардита.

На Фиг.15А и 15Б продемонстрировано то, что иммунизация MntC уменьшает уровень S. aureus в крови. А: штамм PFESA0237 S. aureus; Б: штамм PFESA0266 S. aureus.

На Фиг.16 продемонстрировано то, что иммуногенная композиция на основе конъюгата СР5- S. aureus-CRM₁₉₇ стабильно демонстрирует защиту в мышиной модели пиелонефрита.

На Фиг.17 продемонстрировано то, что вакцинация иммуногенной композицией на основе конъюгата СР8- CRM₁₉₇ уменьшает смертность в модели сепсиса.

На Фиг.18 показаны колониеобразующие единицы (КОЕ), выделенные из почек после заражения S. aureus PFESA0266, у мышей, вакцинированных CP5-CRM с высокой молекулярной массой (HMW), CP5-CRM с низкой молекулярной массой (LMW) или контрольным PP5-CRM.

На Фиг.19 показано сравнение титров ОРА (опсоническая активность) (среднее геометрическое (geomean)) из сыворотки, полученной от мышей, вакцинированных разными композициями конъюгата полисахарида (CP5-CRM с высокой молекулярной массой (HMW), CP5-CRM с низкой молекулярной массой (LMW)). Группы состояли из 5-9 мышей.

На Фиг.20 продемонстрирован титр ОРА для сыворотки примата, не являющегося человеком, до (нед. 0, незакрашенные символы) и через 2 недели (нед. 2, закрашенные символы) после вакцинации разными комбинациями антигенов S. aureus. 3-антигенная вакцина (3Ag) состояла из трех антигенов, и 4-антигенная вакцина (4Ag) состояла из четырех антигенов. Каждая композиция имеет два конъюгата СР и либо 1, либо 2 пептида.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем будут раскрыты настоящие способы и методологии лечения, следует понимать то, что данное изобретение не ограничивается конкретными способами, и описанные экспериментальные условия, такие как способы и условия, могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и не подразумевается, что она является ограничивающей.

Хотя в воплощении на практике или тестировании изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь способам и материалам, сейчас описаны предпочтительные способы и материалы. Все упомянутые здесь публикации включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Используемые здесь термины имеют значения, признанные и известные специалистам в данной области, однако, для удобства и полноты, конкретные термины и их значения изложены ниже.

При использовании здесь формы единственного числа включают в себя отсылки к множественному числу, если контекст ясно не диктует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или более чем один способ и/или стадии описанного здесь типа, и/или которые станут очевидными специалистам в данной области после прочтения данного описания, и так далее.

Термин «примерно» или «приблизительно» означает в пределах статистически значимого интервала величины. Такой интервал может находиться в пределах порядка величины, типично в пределах 20%, однако более типично в пределах 10% и даже более типично в пределах 5% данной величины или интервала. Допустимая вариация, охватываемая термином «примерно» или «приблизительно», зависит от конкретной исследуемой системы, и может быть легко оценена специалистом обычной квалификации в данной области. Всякий раз, когда в пределах данной заявки перечислен интервал, каждое целое число в пределах интервала также рассматривается как воплощение изобретения.

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную к специфичному связыванию с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., через по меньшей мере один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Подразумевается, что данный термин в том виде, как он здесь используется, если контекст на указывает на иное, охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также сконструированные антитела (например, химерные, гуманизированные и/или дериватизированные для изменения эффекторных функций, стабильности и других биологических активностей) и их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (ScFv) и однодоменные антитела, включая антитела акулы и верблюдовых), и слитые белки, содержащие часть, представляющую собой антитело, мультивалентные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, до тех пор, пока они демонстрируют желательную биологическую активность) и фрагменты антител, как здесь описано, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласс), и нет необходимости в том, чтобы антитело принадлежало к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно приписать к разным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2 у человека. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Фрагменты антитела» содержат только часть интактного антитела, где данная часть предпочтительно сохраняет по меньшей мере одну из функций, обычно ассоциированных с данной частью, когда она находится в интактном антителе, предпочтительно большинство из этих функций или все эти функции.

Термин «антиген» обычно относится к биологической молекуле, обычно к белку, пептиду, полисахариду, липиду или конъюгату, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, с которым может селективно связываться когнатное антитело; или, в некоторых случаях, к иммуногенной субстанции, которое может стимулировать продукцию антител или ответы Т-клеток, или и то, и другое, в животном, включая композиции, которые инъецируют животному или которые животное абсорбирует. Может быть генерирован иммунный ответ на целую молекулу или на одну или более чем одну из разных частей молекулы (например, эпитоп или гаптен). Данный термин можно использовать для отнесения к индивидуальной молекуле или к гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген распознается антителами, рецепторами Т-клеток или другими элементами специфичного гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин «антиген» включает все родственные антигенные эпитопы. Эпитопы данного антигена можно идентифицировать с использованием любого числа методик картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. Смотрите, например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Например, линейные эпитопы могут быть определены путем, например, параллельного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и проведением реакции пептидов с антителами, в то время, как пептиды все еще присоединены к подложкам. Такие методики известны в данной области и описаны, например, в патенте США №4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, которые все включены сюда посредством ссылки во всей их полноте. Сходным образом, конформационные эпитопы могут быть идентифицированы путем определения пространственной конформации аминокислот, как, например, путем рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Смотрите, например, Epitope Mapping Protocols, выше. Кроме того, для целей настоящего изобретения, термин «антиген» также может быть использован в отношении белка, который включает модификации, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе, но они могут быть неконсервативными), нативной последовательности, до тех пор, пока белок сохраняет способность вызывать иммунный ответ. Данные модификации могут быть преднамеренными, такими как полученные посредством сайт-направленного мутагенеза, или посредством конкретных синтетических процедур, или посредством подхода генной инженерии, или могут быть случайными, такими как при мутациях у хозяина, который продуцируют антигены. Кроме того, антиген может быть извлечен, получен или выделен из микроба, например, бактерии, или может представлять собой целый организм. Сходным образом, олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген, как, например, в приложениях по иммунизации нуклеиновыми кислотами, также включен в данное определение. Также включены синтетические антигены, например полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие антигены, полученные рекомбинантным путем или путем синтеза (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402 408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 - Jul. 3, 1998).

Термин «адъювант» относится к соединению или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген, как описано далее и проиллюстрировано примерами здесь.

«Бактериемия» представляет собой временное присутствие бактерий в крови. Бактериемия может развиваться в септицемию или сепсис, который будет рассматриваться как инфекция и представляет собой постоянное присутствие бактерий в крови с ассоциированными клиническими признаками/симптомами. Не все бактерии способны выживать в крови. Лишь те, которые действительно имеют специальные генетические признаки, которые обеспечивают эту способность. Также важную роль играют факторы хозяина.

Термин «капсульный полисахарид» или «полисахарид капсулы» относится к полисахаридной капсуле, которая находится снаружи от клеточной стенки большинства изолятов стафилококков. Например, S. aureus включает компонент клеточной стенки, состоящий из пептидогликанового комплекса, который делает возможным выживание организма при неблагоприятных осмотических условиях и также включает уникальную тейхоевую кислоту, связанную с пептидогликаном. Находящаяся снаружи от клеточной стенки тонкая полисахаридная капсула покрывает большинство изолятов S. aureus. Эту серологически особую капсулу можно использовать для серотипирования различных изолятов S. aureus. Было показано, что многие из клинически значимых изолятов включают два типа капсулы: серотип 5 (СР5) и серотип 8 (СР8). Структуры СР5 и СР8 схематически показаны на Фиг.4.

Термин «конъюгаты» в том виде, как он здесь используется, включает капсульный полисахарид, обычно с желательным интервалом молекулярной массы, и белок-носитель, где капсульный полисахарид конъюгирован с белком-носителем. Конъюгаты могут содержать или могут не содержать некоторое количество свободного капсульного полисахарида. Фраза «свободный капсульный полисахарид» в том виде, как она здесь используется, относится к капсульному полисахариду, который является нековалентно ассоциированным с (т.е. нековалентно связанным с, адсорбированным на или захваченным в или с) конъюгированным капсульным полисахаридом-белком-носителем. Термины «свободный капсульный полисахарид», «свободный полисахарид» и «свободный сахарид» могут быть использованы взаимозаменяемо и предназначены для передачи того же самого значения. Независимо от природы молекулы-носителя, она может быть конъюгирована с капсульным полисахаридом либо непосредственно, либо через линкер. Термины «конъюгировать», «конъюгированный» и «конъюгирование» в том виде, как они здесь используются, относятся к способу, посредством которого бактериальный капсульный полисахарид ковалентно присоединяется к молекуле-носителю. Конъюгирование усиливает иммуногенность бактериального капсульного полисахарида. Конъюгирование можно проводить согласно способам, описанным ниже, или способами, известными в данной области.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим капсульные полисахариды серотипа 5 (СР5) S. aureus, конъюгированные с белками-носителями, и конъюгатам, содержащим капсульные полисахариды серотипа 8 (СР8) S. aureus, конъюгированные с белками-носителями. Согласно одному воплощению изобретения предложены конъюгаты, содержащие капсульный полисахарид серотипа 5 S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, и капсульный полисахарид серотипа 8 S. aureus, конъюгированный с белком-носителем, где: капсульный полисахарид типа 5 имеет молекулярную массу от 50 кДа до 800 кДа; капсульный полисахарид типа 8 имеет молекулярную массу от 50 до 700 кДа; иммуногенные конъюгаты имеют молекулярные массы от примерно 1000 кДа до примерно 5000 кДа; и конъюгаты содержат меньше, чем примерно 30% свободного полисахарида по отношению к общему полисахариду. В одном воплощении конъюгаты содержат меньше, чем примерно 25%, примерно 20%, примерно 15%, примерно 10% или примерно 5% свободного полисахарида по отношению к общему полисахариду. В одном воплощении полисахарид типа 5 или 8 имеет молекулярную массу от 20 кДа до 1000 кДа.

В одном воплощении конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 50 кДа до примерно 5000 кДа. В одном воплощении конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 200 кДа до примерно 5000 кДа. В одном воплощении иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 400 кДа до примерно 2500 кДа. В одном воплощении иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 500 кДа до примерно 2500 кДа. В одном воплощении иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 600 кДа до примерно 2800 кДа. В одном воплощении иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 700 кДа до примерно 2700 кДа. В одном воплощении иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу от примерно 1000 кДа до примерно 2000 кДа; от примерно 1800 кДа до примерно 2500 кДа; от примерно 1100 кДа до примерно 2200 кДа; от примерно 1900 кДа до примерно 2700 кДа; от примерно 1200 кДа до примерно 2400 кДа; от примерно 1700 кДа до примерно 2600 кДа; от примерно 1300 кДа до примерно 2600 кДа; от примерно 1600 кДа до примерно 3000 кДа.

Соответственно, в одном воплощении белок-носитель в иммуногеном конъюгате по изобретению представляет собой CRM₁₉₇, и CRM₁₉₇ ковалентно связан с капсульным полисахаридом через карбаматную связь, амидную связь или обе связи. Число остатков лизина в белке-носителе, которые становятся конъюгированными с капсульным полисахаридом, можно охарактеризовать как интервал конъюгированных лизинов. Например, в данной иммуногенной композиции CRM₁₉₇ может содержать от 5 до 15 лизинов из 39 ковалентно связанных с капсульным полисахаридом. Другим способом выражения этого параметра является то, что от 12% до 40% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с капсульным полисахаридом. В некоторых воплощениях часть CRM₁₉₇ полисахарида, ковалентно связанная с CRM₁₉₇, содержит от 5 до 22 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В некоторых воплощениях часть CRM₁₉₇ полисахарида, ковалентно связанная с CRM₁₉₇, содержит от 5 до 23 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В некоторых воплощениях часть CRM₁₉₇ полисахарида, ковалентно связанная с белком-носителем, содержит от 8 до 15 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В некоторых воплощениях часть CRM₁₉₇ полисахарида, ковалентно связанная с белком-носителем, содержит от 8 до 12 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. Например, в данной иммуногенной композиции CRM₁₉₇ может содержать от 18 до 22 лизинов из 39 ковалентно связанных с капсульным полисахаридом. Другим способом выражения этого параметра является то, что от 40% до 60% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с капсульным полисахаридом. В некоторых воплощениях CRM₁₉₇ содержит от 5 до 15 лизинов из 39 ковалентно связанных с СР8. Другим способом выражения этого параметра является то, что от 12% до 40% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с СР8. В некоторых воплощениях CRM₁₉₇ содержит от 18 до 22 лизинов из 39 ковалентно связанных с СР5. Другим способом выражения этого параметра является то, что от 40% до 60% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с СР5.

Как обсуждалось выше, число остатков лизина в белке-носителе, конъюгированном с капсульным полисахаридом, можно охарактеризовать интервалом конъюгированных лизинов, который можно выразить как молярное отношение. Например, молярное отношение конъюгированных лизинов к CRM₁₉₇ в иммуногеном конъюгате СР8 может составлять от примерно 18:1 до примерно 22:1. В одном воплощении интервал молярного отношения конъюгированных лизинов к CRM₁₉₇ в иммуногеном конъюгате СР8 может составлять от примерно 15:1 до примерно 25:1. В некоторых воплощениях интервал молярного отношения конъюгированных лизинов к CRM₁₉₇ в иммуногеном конъюгате СР8 может составлять от примерно 14:1 до примерно 20:1; от примерно 12:1 до примерно 18:1; от примерно 10:1 до примерно 16:1; от примерно 8:1 до примерно 14:1; от примерно 6:1 до примерно 12:1; от примерно 4:1 до примерно 10:1; от примерно 20:1 до примерно 26:1; от примерно 22:1 до примерно 28:1; от примерно 24:1 до примерно 30:1; от примерно 26:1 до примерно 32:1; от примерно 28:1 до примерно 34:1; от примерно 30:1 до примерно 36:1; от примерно 5:1 до примерно 10:1; от примерно 5:1 до примерно 20:1; от примерно 10:1 до примерно 20:1 или от примерно 10:1 до примерно 30:1. Также молярное отношение конъюгированных лизинов к CRM₁₉₇ в иммуногеном конъюгате СР5 может составлять примерно от 3:1 до 25:1. В одном воплощении интервал молярного отношения конъюгированных лизинов к CRM₁₉₇ в иммуногеном конъюгате СР5 может составлять от пример