Лечение диабета и метаболического синдрома

Лечение диабета и метаболического синдрома

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается материалов и способов для лечения диабета (типа 1 и типа 2) и метаболического синдрома.

Уровень техники

Во всем мире примерно 250 миллионов человек больны диабетом и это количество по прогнозам удвоится в ближайшие два десятилетия. Более 90% из этих людей страдают от сахарного диабета 2 типа (T2DM). По оценкам в настоящее время диагноз поставлен только 50-60% человек, которые болеют T2DM или находятся на стадии, предшествующей открытому проявлению T2DM.

T2DM представляет собой гетерогенное заболевание, которое характеризуется нарушениями в метаболизме углеводов и жиров. Причины возникновения T2DM являются многофакторными и включают как генетические, так и связанные с окружающей средой элементы, нарушающие функцию β-клеток и чувствительность к инсулину в тканях, таких как мышцы, печень, поджелудочная железа и жировая ткань. Как следствие, наблюдается пониженная секреция инсулина, которая происходит параллельно с прогрессирующим снижением функции β-клеток и хронической резистентностью к инсулину. Неспособность эндокринных клеток поджелудочной железы компенсировать периферическую резистентность к инсулину приводит к гипергликемии и началу развития клинических проявлений диабета. Резистентность тканей к опосредованному инсулином поглощению глюкозы в настоящее время считается основным патофизиологическим фактором в развитии T2DM.

Критерием успеха для оптимального лечения T2DM является снижение уровней глюкозы в крови, которое может представлять собой как хроническое снижение уровней глюкозы в крови, так и повышение способности переносить высокие уровни глюкозы после приема пищи, что описывается как снижение пиковых уровней глюкозы и более быстрый клиренс. Обе эти ситуации обеспечивают меньшую нагрузку на продукцию инсулина β-клетками и их функционирование.

Одним из подходов к контролю T2DM является применение инкретиновых гормонов - глюкагон-подобного пептида 1 (GLP-1) и зависимого от глюкозы инсулинотропного полипептида (GIP), которые продуцируются эндокринными клетками кишечника после приема пищи и стимулируют продукцию инсулина. GLP-1 является неэффективным в клиническом применении для лечения диабета, поскольку он имеет очень короткое время полужизни in vivo. Фармацевтическими синтетическими примерами инкретинов являются Экзенатид (Exenatide) и Лираглютид (Liraglutide), которые обладают биологическими свойствами, сходными с GLP-1 человека, но имеют более длительное время полужизни. Однако эти аналоги GLP-1 имеют некоторые побочные эффекты, такие как редкие, но опасные случаи панкреатита и воздействие на сердечно-сосудистую систему.

ЕР 0309100, зарегистрированный в 1988 году, показывает, что амилин может секретироваться вместе с инсулином, и в силу этого предлагает парентеральную композицию для лечения диабета типа 1, включающую агонист амилина, такой как, амилин сам по себе и инсулин. Предполагаемая роль амилина закючается в предотвращении гипогликемии, наблюдаемой при лечении инсулином. Указывается, что амилин снижает скорость синтеза гликогена.

Gomez-Foix et al.. сообщали, что амилин и CGRP проявляют антиинсулиновые эффекты на изолированных гепатоцитах крысы, дополняя более ранние сообщения о том, что амилин и CGRP ингибируют секрецию инсулина.

WO 89/06135 сообщает, что соединения, блокирующие действие амилина (антагонисты амилина), являются пригодными для лечения диабета 2 типа. Соединения, которые могут применяться в качестве антагонистов амилина, представляют собой поперечно сшитые варианты агонистов амилина. Указывается, что амилин обладает эффектами, приводящими к меньшему высвобождению инсулина р-клетками поджелудочной железы и вызывающими также значительное снижение как базального, так и инсулин-стимулируемого синтеза гликогена в скелетных мышцах, обеспечивая игнорирование мышечными клетками инсулинового сигнала.

WO 93/10146 раскрывает некоторые агонисты амилина в качестве парентеральных агентов для лечения диабета типа 1 и для лечения гипогликемии. Указывается, что при диабете типа 1 уровни амилина резко понижены или амилин отсутствует. Также предполагается, что агонисты амилина будут предотвращать низкий уровень глюкозы в крови, вызванный лечением инсулином.

EP 0717635B1/WO 95/07098 подтверждает, что амилин обладает гипергликемическим действием, но указывает, что он также может снижать моторику желудка и замедлять освобождение желудка, таким образом, скорее снижая, чем повышая уровни глюкозы в плазме после приема пищи. В соответствии с этим, данный документ рассматривает применение агонистов амилина для этой цели, но специально исключает кальцитонины.

US 7399744 раскрывает применение амилина или агонистов амилина для регуляции жировой массы тела. В экспериментах амилин, который вводился крысам с помощью осмотического насоса, вызывал снижение роста массы тела у крыс, находящихся на диете с высоким содержанием жиров. Кальцитонины, включая кальцитонины костных рыб, даются в качестве примера пригодного агониста, но не приводится данных, относящихся к их применению.

Таким образом, амилин для инъекций сейчас рассматривается в качестве жизненно важного подхода для гликемического контроля при T2DM, поскольку он мощно ингибирует секрецию глюкагона после приема пищи и освобождение желудка, снижает потребление пищи и, следовательно, физиологически регулирует поглощение углеводов. Один из аналогов амилина, Pramlintide (или Symlin), разрешен к применению для лечения пациентов с диабетом типа 1 и типа 2, которые также принимают инсулин. Лечение аналогом Pramlintide снижает средний уровень сахаров в крови и значительно снижает патологическое увеличение уровня сахара в крови у диабетиков после приема пищи. Лечение с применением Pramlintide также приводит к снижению веса и позволяет пациентам вводить меньше инсулина. US 2009/0018053 кратко предлагает композиции с покрытием, рассасывающимся в кишечнике, содержащие Pramlintide, для его высвобождения в желудочно-кишечном тракте для лечения диабета.

Амилин является одним из представителей семейства кальцитонина, состоящего из кальцитонина, пептида, относящегося к гену α-кальцитонина (αCGRP), βCGRP, адреномодуллина и амилина. Эта уникальная группа пептидов имеет консервативную третичную структуру с образованным дисульфидной связью кольцом на N-конце [Hay 2003 Br J Pharmacol]. У млекопитающих эти пептиды действуют через два близкородственных типа рецепторов II GPCRs (Calcitonin Receptor and Calcitonin Receptor-like Receptor) и через три уникальных белка, модулирующих активность рецепторов (RAMPs) [Hay Regul Pept 2003]. Таким образом, применение любой из этих маленьких сигнальных молекул может вызвать больше плейотропных эффектов во множестве органов вследствие совместного использования рецепторов и дивергентной эволюции.

Кальцитонин (СТ) представляет собой природный пептидный гормон, продуцируемый парафолликулярными клетками (С-клетками) в щитовидной железе и секретируемый в ответ на избыток кальция в сыворотке крови. СТ снижает резорбцию остеокластов за счет прямого связывания с его рецепторами на поверхности клеток остеокластов. СТ разрешен к применению для лечения остеопороза, связанной со злокачественным ростом гиперкальциемии, болезни Паджета (экземоподобного рака молочной железы), поскольку все эти заболевания связаны с ускоренной перестройкой костной ткани. В литературе недавно описана пероральная форма кальцитонина.

Имеются многочисленные сообщения о диабетогенном действии, вызываемом введением кальцитонина, у животных и у человека, за исключением, вероятно, пациентов, страдающих диабетом типа 1.

Анализируя вначале исследования на животных и in vitro, можно отметить, что Lupulescu сообщил в 1974, что высокие дозы (600 MRC U в месяц или 50 MRC U в виде однократной дозы) синтетического кальцитонина лосося при введении кроликам путем инъекций вызывают значительное снижение уровня глюкозы, измеряемого после голодания, при введении либо только однократно, либо три раза в день в течение одного месяца. Механизм этого эффекта не был понят, и не проводилось исследований влияния на уровни глюкозы после теста на толерантность к глюкозе или во время/после нормального кормления. Они подтвердили, что подобные результаты не наблюдались в работе Aldred et al.. 1968, когда кальцитонин свиньи вводился крысам, кроликам или мышам.

Greeley в 1989 сообщил, что введение кальцитонина лосося в желудочки головного мозга крыс увеличивало стимулируемое глюкозой высвобождение инсулина, однако уровни глюкозы в плазме не зависят исключительно от инсулина, и другие исследования (смотри ниже) показывают, что помимо увеличения уровня инсулина, кальцитонин также увеличивает уровни глюкагона, которые превалируют над увеличением уровня инсулина, что приводит к повышенному уровню глюкозы.

Pittner в 1997 сообщил, что наблюдается незначительный эффект при исследовании действия амилина, пептида, связанного с геном кальцитонина, или кальцитонина крысы или лосося на гепатоциты крысы и другие клетки.

Young et al.. в 1995 сообщили, что у крыс и мышей кальцитонин лосося при внутривенной болюсной инъекции вызывает повышение уровня глюкозы в плазме при голодании, кальцитонин крысы обладал менее выраженным эффектом. У гипогликемической крысы кальцитонин обеспечивал более значительное восстановление гликемии, чем глюкагон, и в комбинации с ним синергитично увеличивал восстановление гликемии, вызываемое глюкагоном.

Young в 2005 подробно проанализировал эффекты амилина и в меньшей степени кальцитонина лосося на уровни глюкозы и лактата у животных. Он сообщил, что как амилин, так и кальцитонин лосося при парентеральном введении голодным животным вызывают повышение уровней глюкозы, при этом кальцитонин обеспечивает более сильный эффект на повышение уровня глюкозы, но что эти эффекты у людей были умеренными или отсутствовали. Он также сообщил, что амилин, введенный крысам парентерально незадолго перед проведением теста на толерантность к глюкозе, снижает увеличение уровня глюкозы. Таким образом, в этом отношении ясно, что амилин и кальцитонин лосося у крыс ведут себя по-разному, поскольку твердо установлено, что кальцитонин, введенный парентерально, вызывает увеличение максимального уровня глюкозы при пероральном тесте на толерантность к глюкозе.

Chelikani et al.. в 2007 сообщили, что хроническое введение анорексигенных веществ животным путем инфузии или неоднократных инъекций не оказывает продолжительного влияния на потребление пищи или вес тела. Хотя острое парентеральное введение кальцитонина лосося сильно индуцировало кратковременное снижение потребления пищи у крыс или мышей, эффект сохранялся только в течение 3 дней.

Однако Bello et al.. в 2008 сообщили, что кальцитонин лосося, введенный парентерально, снижает потребление пищи макаками-резусами во время 5-дневного периода введения.

Анализируя далее работы на человеке, можно отметить, что Ziegler et al.. (1972) сообщили, что у здоровых волонтеров инфузия синтетического кальцитонина человека вызывает достоверное ухудшение ассимиляции глюкозы и продукции инсулина.

Blahos et al. в 1976 сообщили, при внутримышечном введении здоровым волонтерам кальцитонин лосося ингибирует снижение уровня глюкозы в крови при утреннем голодании и ухудшает тест на толерантность к глюкозе.

Petralito et al. (1979) сообщили, что в случае латентного диабета у людей инфузия кальцитонина лосося способна достоверно снижать уровень инсулина в сыворотке и увеличивать уровень сахара в крови.

Giugliano et al. 1980 сообщили, что хотя ранее было показано, что острое введение кальцитонина ухудшает толерантность к глюкозе у нормальных, страдающих ожирением и находящихся в пре-диабетическом состоянии людей, кальцитонин лосося, введенный путем внутривенной инфузии инсулинозависимым диабетическим пациентам, устранял повышение уровня глюкозы, обычно наблюдаемое в тесте на толерантность к аргинину, с немедленным восстановлением уровня глюкозы сразу после прекращения инфузии кальцитонина.

Gattereau et al. (1980) сообщили, что инъекция либо кальцитонина лосося, либо кальцитонина человека пациентам страдающим костной формой болезни Паджета, вызывала умеренный немедленный рост уровня глюкозы в сыворотке и небольшое снижение уровня инсулина в сыворотке.

Passariello et al. (1981) сообщили, что внутримышечное введение синтетического кальцитонина лосося людям вызывало ухудшение в ответе в тесте на толерантность к глюкозе у нормальных пациентов и вызывало дополнительное ухудшение в тесте на толерантность к глюкозе у субъектов с IGT. Было обнаружено, что интегрированная площадь под кривой уровня глюкозы в плазме увеличивалась примерно вдвое.

Starke et al. в 1981 сообщили, что у нормальных волонтеров инфузия кальцитонина лосося вызывает снижение уровней циркулирующего глюкагона и снижение уровня инсулина в сыворотке, эффект в целом заключался в ожидаемом снижении уровня глюкозы, так как снижение уровня глюкагона маскировалось эффектом снижения уровня инсулина. Однако у инсулинозависимых диабетиков кальцитонин лосося вызывал снижение уровня глюкозы параллельно со снижением уровня глюкагона.

Giugliano et al. (1982) сообщили о результатах длительного (2 месяца) введения 100 MRC единиц в день кальцитонина лосося пациентам с костной формой болезни Паджета или сильным остеопорозом. При таком лечении толерантность к глюкозе достоверно не ухудшалась (хотя наблюдался недостоверный рост пиковой концентрации глюкозы), но было обнаружено достоверное увеличение базального уровня глюкозы в плазме. В первые десять минут ответ инсулина на введение глюкозы ослаблялся кальцитонином.

Giustina et al. (1985) исследовали эффект кратковременного (15 дней) внутримышечного введения 100 MRC единиц дважды в день кальцитонина лосося пациентам с костной формой болезни Паджета, идиопатическим остеопорозом или остеодистрофией Зудека. Некоторые из пациентов были не инсулинозависимыми диабетиками и также получали антидиабетическую терапию. Было установлено, что кратковременное внутримышечное введение СТ лосося не вызывает значительного изменения в метаболизме углеводов после стимулирования смешанной пищей. У трех диабетических пациентов, участвующих в исследовании, наблюдалось недостоверное снижение уровня глюкозы в ночное время.

Zofkova (1987 - Exp. Clin. Endocrinol.) обнаружила, что 100 U кальцитонина при внутривенном введении в случае OGTT вызывали устойчивость к гипергликемии после начального медленного роста. Это объяснялось влиянием [кальцитонина] на поглощение глюкозы и метаболизм в печени. Также было обнаружено ингибиторное действие кальцитонина на секрецию инсулина.

Zofkova (1987 - Horm. Metabol. Res.) исследовала влияние двух дозировок (50 и 100 U) кальцитонина лосося на уровни глюкозы в крови у здоровых волонтеров и получила результаты, сходные с только что описанными выше при обоих уровнях дозировки.

Mangiafico (1988) обнаружил, что комбинация нифедипина с кальцитонином лосося при введении в дозе 100 U/день вызывает статистически достоверное увеличение уровня сахара в крови у субъектов с гипертензией, или с не инсулинозависимым диабетом, или со сниженной толерантностью к глюкозе постоянно в течение 3-недельного исследования.

Jonderko (1989) обнаружил, что высвобождение инсулина после приема пищи прекращается при введении кальцитонина лосося в дозе 62,26 пмоль/кг у пациентов с язвой двенадцатиперстной кишки, одновременно с параллельным ростом уровня глюкозы в сыворотке во время инфузии кальцитонина.

Young (2005) сообщил, что в плане приема пищи, введение амилина подавляет увеличение уровня глюкозы в плазме крови у крыс, собак и людей, но в отсутствие пищи введение амилина приводит к увеличению уровня глюкозы в плазме у грызунов, но не у людей.

Таким образом, процитированные выше исследования влияния парентерального введения кальцитонина людям, страдающим от не инсулинозависимого диабета или сниженной толерантностью к глюкозе, убедительно показывают, что также введение кальцитонина не приносит терапевтической пользы.

Раскрытие изобретения

Авторы настоящего изобретения провели исследование, может ли введение СТ через кишечник улучшить гипергликемическое состояние и обеспечить улучшенный гликемический контроль. Мы сравнили предполагаемый эффект пероральной композиции СТ лосося с таковым для хорошо охарактеризованного PPAR-γ агониста росиглитазона (rosiglitazone) при индуцированном диетой ожирении (diet induced obese, DIO) у крыс, которые проявляют определенные характеристики T2DM. Наконец мы исследовали влияние кальцитонина на обмен глюкозы у здоровых взрослых крыс. Неожиданно мы обнаружили, что пероральное введение кальцитонина вызывает эффект, в значительной степени противоположный тому, который ранее раскрывался для инъекции или инфузии кальцитонина, как описано и показано ниже. В противоположность этому, инсулин, например, который доступен для перорального введения или для инъекций, обеспечивает один и тот же эффект независимо от пути его введения.

В соответствии с этим настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для введения через кишечник для лечения диабета типа 1, диабета типа 2, или метаболического синдрома, или для ослабления резистентности к инсулину, или для снижения нежелательно высокого уровня глюкозы в сыворотке при голодании, или для снижения нежелательно высокого пикового уровня глюкозы в сыворотке, или для снижения нежелательно высокого пикового уровня инсулина в сыворотке, где композиция включает активное соединение, которое является членом семейства кальцитонина, но не амилином, модифицированным членом семейства кальцитонина, но не модифицированным амилином, или агонистом рецептора кальцитонина. Композиция может также включать носитель, обеспечивающий эффективное введение через кишечник указанного активного соединения.

Предпочтительно указанная композиция готовится для перорального введения через пищеварительный тракт.

Предпочтительно активное соединение представляет собой кальцитонин, наиболее предпочтительно кальцитонин лосося.

Данное активное соединение может представлять собой модифицированный представитель семейства кальцитонина, имеющий, по меньшей мере, 75% аминокислотной гомологии с членом семейства кальцитонина, но не амилином, и который модифицирован по отношению к указанному представителю семейства кальцитонина путем вставки, замены или делеции аминокислот и сохраняет способность к связыванию и к активации рецептора кальцитонина.

Предпочтительно указанный носитель представляет собой 5-CNAC.

Настоящее изобретение включает способ лечения диабета типа 1, диабета типа 2 или метаболического синдрома, включающий введение через кишечник пациенту, который в этом нуждается для лечения указанного состояния, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей активное соединение, которое является членом семейства кальцитонина, но не амилином, модифицированным представителем семейства кальцитонина, но не модифицированным амилином, или агонистом рецептора кальцитонина, и необязательно носитель, обеспечивающий эффективное введение через кишечник указанного активного соединения. Указанный способ может включать предварительную стадию для выяснения того, страдает ли пациент от указанного состояния, и/или последующую стадию для определения, до какой степени указанное лечение является эффективным для облегчения состояния указанного пациента, например, в каждом случае путем проведения перорального теста на толерантность к глюкозе или уровня сахара в крови в покое.

Для улучшенного контролирования веса пациента, чтобы обеспечить снижение веса или избежать увеличения веса, активное соединение предпочтительно вводится, по меньшей мере, дважды в день, например 2-4 раза в день. Композиции активного соединения могут содержать единичные дозировки, пригодные для такой схемы введения. Активные соединения могут вводиться с целью контролирования веса пациента, получающего лечение от диабета или метаболического синдрома.

Пероральные композиции для кишечного введения предназначены для употребления путем пропитывания для последующего высвобождения в тонком кишечнике уже после желудка и, следовательно, доставки через портальную вену в печень, в отличие от композиций, которые рассасываются во рту для обеспечения переноса в кровоток через подъязычные или буккальные пути.

Не будучи связанными теорией, мы предполагаем, что резкое различие в эффекте кальцитонина, связанное с тем, вводится ли он парентерально, или вводится ли он через кишечник, о котором мы здесь сообщаем, может быть связано с тем, что введение через кишечник обеспечивает немедленную доставку кальцитонина в печень через портальную вену после всасывания в кишечнике, в результате чего рецепторы в печени экспонируются в присутствии гораздо более высоких концентраций кальцитонина, чем когда кальцитонин вводится внутривенно или внутримышечно. Прямой путь в печень после введения кальцитонина через кишечник делает возможным достижение антигипергликемического эффекта несмотря на короткое время полужизни кальцитонина (подобное таковому для GLP-1). Механизм, лежащий в основе противоположного эффекта кальцитонина при его введении путем инъекции и при пероральном введении, может заключаться в том, что в достаточно высокой концентрации кальцитонин может выступать как агонист рецепторов, на которые обычно действует амилин, и, вследствие этого, может обеспечивать амилин-подобный эффект, тогда как более низкие концентрации кальцитонина являются эффективными только в отношении других рецепторов, которые обеспечивают гипергликемический эффект. Однако возможны и другие объяснения. Например, может быть при пероральном введении эти агенты действуют непосредственно на рецепторы кальцитонина, отличающиеся от таковых, на которые действует кальцитонин при инъекции, например, на рецепторы самого кишечного тракта.

Кальцитонины являются высококонсервативными у большого числа видов. Последовательности примеров кальцитонинов приведены ниже:

В соответствии с этим, предпочтительное соединение для применения в настоящем изобретении имеет следующую формулу:

CX^lX²LSTCX³LX⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹X^l0X^llX¹²X^l3X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸X¹⁹X²⁰X²¹GX²²X²³X²⁴P

SEQ ID NO:11,

где X¹ представляет собой A, G или S; предпочтительно S;

X² представляет собой N или S; предпочтительно N;

X³ представляет собой М или V; предпочтительно V;

X⁴ представляет собой G или S; предпочтительно G;

X⁵ представляет собой Т, K или А; предпочтительно Т или K; наиболее предпочтительно K;

X⁶ представляет собой L или Y; предпочтительно L;

X⁷ представляет собой Т, S или W; предпочтительно Т или S; наиболее предпочтительно S;

X⁸ представляет собой Q, K или R; предпочтительно Q;

X⁹ представляет собой D, Е или N; предпочтительно D или Е; наиболее предпочтительно Е;

X¹⁰ представляет собой F или L; предпочтительно L;

X¹¹ представляет собой N или Н; предпочтительно Н;

X¹² представляет собой К или N; предпочтительно K;

X¹³ представляет собой F или L; предпочтительно L;

X¹⁴ представляет собой Н или Q; предпочтительно Q;

X¹⁵ представляет собой Т или R; предпочтительно Т;

X¹⁶ представляет собой F или Y; предпочтительно Y;

X¹⁷ представляет собой Р или S; предпочтительно Р;

X¹⁸ представляет собой Q, G или R; предпочтительно Q или R; наиболее предпочтительно R;

X¹⁹ представляет собой Т, I или М; предпочтительно Т;

X²⁰ представляет собой А, N, D, S или G; предпочтительно N;

X²¹ представляет собой I, Т, V или F; предпочтительно Т,

X²² представляет собой V, S, А или Р; предпочтительно V, S, или А; наиболее предпочтительно S;

X²³ представляет собой G или Е, предпочтительно G;

X²⁴ представляет собой А или Т; предпочтительно Т.

В соответствии с этим, предпочтительно, чтобы соединение имело формулу

CSNLSTCVLGX⁵LX⁷QX⁹LHKLQTYPX¹⁸TNTGX²²GTP

SEQ ID NO:12

где X⁵ представляет собой Т или K; более предпочтительно K;

X⁷ представляет собой Т или S; более предпочтительно S;

X⁹ представляет собой D или Е; более предпочтительно Е;

X¹⁸ представляет собой Q или R; более предпочтительно R;

X²² представляет собой V, S или А; более предпочтительно S.

Кальцитонин лосося является наиболее предпочтительным.

Кроме того, кальцитонин является представителем семейства пептидных гормонов, включающего амилин, относящийся к гену кальцитонина пептид, адреномедуллин, интермедии, относящийся к гену кальцитонина пептид II и стимулирующие рецептор кальцитонина пептиды (calcitonin receptor stimulating peptide, CRSP) 1, 2, 3, 4 и 5. Среди них CRSP-1 является предпочтительным для применения в настоящем изобретении среди других пептидов, стимулирующих рецептор кальцитонина.

Эти представители семейства кальцитонина имеют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, а также структурное сходство. Это сходство включает образованную дисульфидным мостиком петлю из 6 или 7 аминокислот на N-конце, амидированный по С-концу ароматический остаток, находящийся на С-конце, и участок с предсказанной амфипатической α-спиральной структурой из остатков 8-18 или 8-22.

Аминокислотные последовательности других представителей семейства кальцитонина из различных видов показаны ниже:

АМИЛИН

ПЕТИД, ОТНОСЯЩИЙСЯ К ГЕНУ КАЛЬЦИТОНИНА

АДРЕНОМЕДУЛЛИН

ИНТЕРМЕДИН

ПЕПТИД II, ОТНОСЯЩИЙСЯ К ГЕНУ КАЛЬЦИТОНИНА

ПЕПТИД-1, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИТОНИНА

ПЕПТИД-2, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИТОНИНА

ПЕПТИД-3, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИТОНИНА

ПЕПТИД-4, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИТОНИНА

ПЕПТИД-5, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИТОНИНА

Можно отметить, что хотя они экспрессируются разными генами и образуются из разных пептидов-предшественников, зрелые пептиды CRSP-2, -3 и -4 у собаки являются одинаковыми.

Последовательности некоторых представителей семейства кальцитонина также показаны на фигурах 6 и 7. На фигуре 6 пустые места указывают, что соответствующая аминокислота является такой же, как показано в последовательности амилина крысы, напечатанный однобуквенный код аминокислоты указывает, что последовательность содержит данную аминокислоту в указанном положении, и заштрихованный квадрат указывает, что кальцитонины не содержат аминокислот, соответствующих остаткам 23-27 в амилине. На фигуре 7 участки в рамке являются полностью гомологичными (за исключением делеций) и заштрихованные области указывают, что в этих положениях в данных последовательностях аминокислоты отсутствуют.

Разные представители семейства способны в значительной степени связываться и активировать те же самые рецепторы, которые активирует кальцитонин, то есть способны действовать как агонисты рецептора кальцитонина (СТ-рецептора). В отличие от большинства рецепторов, сопряженных с G-белками, СТ-рецептор может модифицироваться при связывании одного из трех белков, модифицирующих активность рецептора (receptor activity modifying proteins, RAMPs), которые пронизывают мембрану один раз.

В настоящем изобретении термин «агонист СТ рецептора» обозначает любое соединение, но особенно пептид, способный связываться и активировать СТ рецептор способом, который может быть продемонстрирован с помощью, по меньшей мере, одного из «протоколов исследования», как показано ниже.

Термин «представитель семейства кальцитонина» обозначает любой один из кальцитонина, амилина, относящегося к гену кальцитонина пептида, адреномедуллина, интермедина, относящегося к гену кальцитонина пептида II и стимулирующего рецептор кальцитонина пептида-1, которые встречаются в природе у любых видов.

Термин «модифицированный представитель семейства кальцитонина» обозначает соединение, имеющее аминокислотную последовательность любого представителя семейства кальцитонина, о котором идет речь, модифицированную по сравнению с нативной последовательностью, но таким образом, чтобы данное соединение представляло собой агонист СТ рецептора. Модификация может быть проведена для разных целей, включая увеличение эффекта данного соединения как агониста СТ рецептора, для увеличения биологического времени полужизни данного соединения, или для того, чтобы обеспечить для композиции с данным соединением, приготовленной для фармацевтического применения, увеличения его стабильности при хранении.

Названия индивидуальных представителей семейства кальцитонина, например «кальцитонин», относятся к любому встречающемуся в природе такому представителю семейства из любого вида, включая каждый из видов, для которых последовательности кальцитонина приведены выше, если не указано иначе.

Термин «модифицированный», стоящий перед названием индивидуального представителя семейства кальцитонина, обозначает соединение, имеющее аминокислотную последовательность представителя семейства кальцитонина, о котором идет речь, модифицированную по сравнению с нативной последовательностью, но таким образом, чтобы соединение, о котором идет речь, представляло собой агонист СТ рецептора.

Модифицированные представители семейства кальцитонина для применения согласно настоящему изобретению не модифицированного включают амилина и, следовательно, не должны иметь более чем 50% гомологии с амилином, предпочтительно не более чем 30%. Из фигуры 5 можно видеть, что кальцитонин лосося содержит только 10 из 37 аминокислот амилина в своей последовательности из 32 аминокислот, и таким образом имеет 10/32*100% гомологию с амилином, то есть 27%. Модификации кальцитонина до такой степени, что они делают его «слишком похожим на амилин», исключаются.

Способом модификаций указанных выше аминокислотных последовательностей в модифицированных представителях семейства кальцитонина может быть вставка, деления или замена на природные или не встречающиеся в природе аминокислоты. Предпочтительно модифицированная последовательность является, по меньшей мере, на 75% гомологичной, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% гомологичной нативной последовательности представителя семейства кальцитонина, о котором идет речь.

В соответствии с этим настоящее изобретение включает композицию, в которой активное соединение представляет собой модифицированный представитель семейства кальцитонина, имеющий, по меньшей мере, 75% аминокислотной гомологии с представителем семейства кальцитонина, но не амилином, и который модифицирован по отношению к указанному представителю семейства кальцитонина путем вставки, замены или делеции аминокислот и сохраняет способность связываться и активировать рецептор кальцитонина.

Среди видов, порядок предпочтения для представителей семейства кальцитонина для применения согласно настоящему изобретению таков: костные рыбы > птицы > млекопитающие, но не человек > человек.

Представитель семейства кальцитонина, если встречается в природе, может быть натуральным или может быть синтезированным (включая рекомбинантные), и если не встречается в природе, может быть синтезированным.

Среди встречающихся в природе кальцитонинов кальцитонин лосося является особенно предпочтительным.

Протоколы испытаний

Для выяснения того, является ли соединение-кандидат агонистом рецептора кальцитонина, было разработано четыре протокола испытаний.

Клетки COS-7 выращивали до 80% конфлуентности в колбах на 75 см². Для трансфекции клеток последовательностями, кодирующими рецептор, использовали pcDNA3.1(+) от Invitrogen. Клетки трансфицировали, используя 300 нг конструкции pcDNA-CTR самой по себе (Протокол испытаний 1), или ко-трансфицировали, используя 300 нг конструкции pcDNA-CTR и 1 мкг pcDNA-RAMP-1 (Протокол испытаний 2), или pcDNA-RAMP-2 (Протокол испытаний 3), или pcDNA-RAMP-3 (Протокол испытаний 4), с использованием 7,8 мкл реагента FuGene 6.

Последовательность, включенная в конструкцию pcDNA-CTR, является такой, которая дана для cDNA рецептора кальцитонина человека в банке генов под номером CALCR: NM_001742. Последовательности RAMP I DNA, RAMP 2 DNA и RAMP 3 DNA, включенные в конструкции pcDNA-RAMP, представляют собой последовательности RAMP человека, представленные в банке генов под следующими специфическими номерами:

RAMPL NM_005855

RAMP2: NM 005854

RAMP3: NM 005856

Через 48 часов клетки снимали обработкой трипсином, центрифугировали при 500 × g и ресуспендировали в циклазном буфере (DMEM, содержащий 0,1% (вес/объем) БСА и 1 мМ IBMX). Аликвоты клеток (5×10⁵) вносили в 1,5 мл пробирки Eppendorf и преинкубировали в течение 20 мин при 37°С. Далее клетки инкубировали в течение 18 мин в отсутствие (базальный уровень) или в присутствии возрастающих концентраций агонистов: 100 микромолярная, 1 микромолярная, 0,01 микромолярная. В качестве положительного контроля для этой системы проводили инкубацию в присутствии 1 мМ форсколина для определения максимального накопления цАМФ.

После инкубации в реакционных средах количественно измеряли внутриклеточный вторичный мессенджер цАМФ согласно инструкции к набору cAMP-EIA (Amersham Biosciences, US).

Исследуемое соединение рассматривалось в качестве агониста CTR, если оно в концентрации 10 мкМ индуцировало образование на 50% больше цАМФ в любом одном из четырех протоколов испытаний, чем носитель, используемый как контроль (DMEM, содержащий 0,1% (вес/объем) БСА и 1 мМ изобутилметилксантин (IBMX)). sCT обеспечивает (по меньшей мере, в протоколе испытаний 1) более чем 10-кратную индукцию по сравнению с отрицательным контролем, даже при использовании в концентрации 1 мкМ. Таким образом, предпочтительно, чтобы соединение для применения согласно настоящему изобретению обеспечивало, по меньшей мере, 100% (то есть 2-кратную) индукцию, по меньшей мере, в одном из протоколов испытаний, предпочтительно, по меньшей мере, 5-кратную индукцию. Альтернативно этому, соединение для применения согласно настоящему изобретению обеспечивает, по меньшей мере, 25% от индукции, обеспечиваемой sCT, по меньшей мере, в одном из указанных протоколов испытания, предпочтительно, по меньшей мере, 50% от индукции, обеспечиваемой sCT.

Предпочтительные агонисты CTR дают положительный результат, по меньшей мере, в двух из указанных протоколов (предпочтительно в протоколах испытаний 1 и 2 или 1 и 4), предпочтительно в трех протоколах испытаний (предпочтительно в 1, 2 и 4) и наиболее предпочтительно во все четырех протоколах испытаний. Альтернативно этому, предпочтительно, чтобы ответ, обеспечиваемый тестируемым соединением в протоколе испытаний 1, был, по меньшей мере, на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 100% больше, чем ответ, обеспечиваемый тестируемым соединением в любом из протоколов испытаний 2-4.

Примеры модифицированных кальцитонинов, которые могут применяться в настоящем изобретении, можно найти в US 5536812. Таким образом, С-концевой пролинамид кальцитонина может быть замещен (заменен) на гомосеринамид (Hse-NH^).

Модифицированные таким образом кальцитонины лосося или угря являются наиболее предпочтительными.

Кальцитонины или другие представители семейства кальцитонина могут быть модифицированы так, как указано в GB 1590645, путем замены кольцевого элемента Cys-Cys на более стабильную структуру, такую, которая обеспечивается путем замены первого и второго из этих остатков Cys (обычно первой и седьмой аминокислот) на аминосуберинов