Агенты против клетки-мишени, нацеленные на cd138, и их применение

Агенты против клетки-мишени, нацеленные на cd138, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США 61/016630, поданной 26 декабря 2007 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения ссылкой.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к улучшенным агентам против антигена CD138, а также к композициям, включающим агент против антигена, и способам их применения.

Уровень техники

CD138, действующий в качестве рецептора внеклеточного матрикса, сверхэкспрессирован на клетках множественной миеломы (ММ) и, как было установлено, влияет на развитие и/или пролиферацию клеток ММ. CD138 экспрессирован также на клетках карциномы яичника, карциномы почки, карциномы желчного пузыря, карциномы молочной железы, рака предстательной железы, рака легкого, карциномы ободочной кишки, лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, хронического лимфолейкоза (CLL) и многих других.

Публикации и другие материалы, включая патенты, использованные в настоящем описании изобретения для иллюстрации изобретения и, в частности, для более подробного описания возможностей осуществления настоящего изобретения, включены в качестве ссылки. Публикации, приведенные в нижеследующем описании изобретения только с указанием автора и даты публикации, перечислены в алфавитном порядке по имени автора в прилагаемом библиографическом разделе.

Тассон и др. (2004) сообщили в превосходном связывании антитела В-В4 IgG1 мыши с антигеном CD138, экспрессированным на поверхности клеток ММ. Тассон также отметил высокую цитотоксическую активность иммуноконъюгата В-В4-DM1, включающего митанзиноид DM1 в качестве эффекторной молекулы, против клеток множественной миеломы (см. также публикацию патента США 20070183971).

Существует потребность в агенте против клетки-мишени, в частности в антителе против клетки-мишени, созданном на основе антитела В-В4, у которого отсутствуют определенные свойства и/или функции, характерные для антитела В-В4. Такое антитело против клетки-мишени может включать одну или несколько областей человеческого антитела. В частности, существует потребность в химерном антителе, созданном на основе антитела В-В4, которое связывается с CD138 так же эффективно, как В-В4, но может быть введено человеку без возникновения значительных побочных эффектов. Кроме того, существует потребность в агенте против клетки-мишени, обладающем сродством связывания, которое выше сродства связывания антитела В-В4. Существует также потребность в агенте против клетки-мишени, созданном на основе антитела В-В4, который обладает одним или несколькими благоприятными свойствами по сравнению с мышиным антителом. Такие свойства включают лучшее связывание с антигеном, в частности с CD138-экспрессирующими опухолевыми клетками и А-клетками, или более гомогенное связывание.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу гомогенного связывания с CD138, который включает

получение генетически созданного антитела против клетки-мишени, включающего

антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого, и

дополнительную область антитела, по крайней мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

введение указанного генетически созданного антитела против CD138-экспрессирующих клеток, которое гомогенно связывается с CD138, экспрессированным на указанных CD138-экспрессирующих клетках.

Настоящее изобретение относится также к выделенному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:1, при этом агент против клетки-мишени, включающий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть, направленно воздействует на CD138.

Последовательность указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентична остаткам 31-35, остаткам 51-68 и остаткам 99-111 SEQ ID NO:1, и указанный агент против клетки-мишени может быть генетически созданным антителом против клетки-мишени.

Константная область указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части может быть константной областью изотипа IgG4.

Указанный агент против клетки-мишени может быть химерным антителом ”мышь-человек”.

Указанный агент против клетки-мишени или генетически созданное антитело против клетки-мишени может быть гуманизированным антителом.

Выделенный полипептид может далее включать аминокислотную последовательность легкой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:2.

Выделенный полипептид может далее включать аминокислотную последовательность легкой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична остаткам 24-34, остаткам 50-56 и остаткам 89-97 SEQ ID NO:2.

Указанная тяжелая цепь иммуноглобулина может быть идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Указанная легкая цепь иммуноглобулина может быть идентична последовательности SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение относится также к генетически созданному антителу против клетки-мишени, узнающему CD138, которое включает

антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого, и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из антитела, отличного от человеческого, при этом указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени

(а) связывается с CD138 со сродством связывания, которое выше сродства связывания указанного антитела, отличного от человеческого; и/или

(b) обеспечивает гомогенное связывание с CD138 на CD138-экспрессирующих клетках.

Указанная дополнительная область антитела может быть по меньшей мере одной константной областью, включающей константную область тяжелой цепи или ее части, выделенную из человеческого антитела, при этом указанное генетически созданное антитело относится к изотипу IgG4.

Указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени может быть химерным антителом, и указанное антитело, отличное от человеческого, может быть антителом В-В4.

Указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени может быть гуманизированным антителом, и указанное антитело, отличное от человеческого, может быть антителом В-В4.

Последовательность указанной тяжелой цепи может быть по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:1.

Указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени может включать по меньшей мере одну легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:2.

Последовательность указанной тяжелой цепи может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 100% идентична остаткам 31-35, остаткам 51-68 и/или остаткам 99-111 SEQ ID NO:1. Последовательность указанной тяжелой цепи может быть по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или 100% идентичная остаткам 24-34, остаткам 50-56 и/или остаткам 89-97 SEQ ID NO:2.

Дополнительная область антитела может включать

(а) аминокислотные остатки 123-448 SEQ ID NO:1 и/или

(b) аминокислотные остатки 108-214 SEQ ID NO:2 и их мутации, которые сохраняют или снижают антителозависимую цитотоксичность и/или комплементзависимую цитотоксичность генетически созданного антитела против клетки-мишени и/или стабилизируют генетически созданное антитело против клетки-мишени.

Указанная дополнительная область антитела может быть константной областью тяжелой цепи человеческого антитела.

Указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени может связываться с CD138 с изменчивостью направленного воздействия менее 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% или 50%.

Последовательность указанной тяжелой цепи может быть по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:1.

Указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени может включать по меньшей мере одну легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:2.

Последовательность указанной тяжелой цепи может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентична остаткам 31-35, остаткам 51-68 и остаткам 99-111 SEQ ID NO:1.

Последовательность указанной тяжелой цепи может быть по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична остаткам 24-34, остаткам 50-56 и остаткам 89-97 SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей или по существу состоящей из генетически созданного антитела против клетки-мишени и фармацевтически приемлемого носителя.

Гибридома, продуцирующая генетически созданное антитело против клетки-мишени, также входит в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к анализу на основе антитела, который включает генетически созданное антитело против клетки-мишени.

Настоящее изобретение относится к генетически созданному антителу против клетки-мишени по настоящему изобретению, предназначенному для использования в медицине. В частности, указанное генетически созданное антитело против клетки-мишени включает

антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого, и

дополнительную область антитела, по крайней мере часть которой выделена из человеческого антитела.

Генетически созданное антитело против клетки-мишени, в частности, предназначено для использования при лечении, направленно воздействующем на опухолевые клетки.

Настоящее изобретение относится также к применению генетически созданного антитела против клетки-мишени по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для направленного воздействия на опухолевые клетки. В частности, генетически созданное антитело против клетки-мишени включает

антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого, и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела.

В соответствии с медицинскими примениями по настоящему изобретению генетически созданное антитело против клетки-мишени вводят субъекту, в организме которого имеются CD138-экспрессирующие клетки. Кроме того, генетически созданное антитело против клетки-мишени может гомогенно связываться с CD138, экспрессированным на указанных CD138-экспрессирующих клетках.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 схематически изображено антитело nBT062 с присоединенными эффекторными молекулами.

На фиг. 2 показана химическая структура ВТ062.

На фиг. 3 показано превращение ансамитоцина Р-3 в майтанзинол (стереохимия опущена для простоты восприятия).

На фиг. 4 показана типичная схема синтеза DM4.

На фиг. 5 схематически изображена конъюгация антитела (nBT062 с DM4).

На фиг. 6 показан анализ связывания nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DМ1 и антитела nBT062 с клетками ОРМ-2. Клетки подвергали воздействию антитела nBT062 и конъюгатов в разных концентрациях и измеряли среднее значение флуоресценции при помощи анализа методом FACS.

На фиг. 7(А)-(D) показана цитотоксичность in vitro конъюгатов nBT062-DMx в отношении клеток MOLP-8 (CD138⁺) и BJAB (CD138^-). Клетки культивировали на плоскодонных планшетах и инкубировали с иммуноконъюгатами в указанных концентрациях в течение 5 дней. Реагент WST добавляли в течение дополнительных 3 часов для оценки жизнеспособности клеток. На фиг. 7(D) показан анализ цитотоксической активности иммуноконъюгата nBT062-SPDB-DM4 в присутствии или в отсутствие блокирующего антитела (1 мкМ nBT062).

На фиг. 8 показаны объемы опухолей у отдельных мышей, которым вводили (А) PBS, (В) антитело nBT062, (С) свободный DM4 или (D) конъюгат huC242-DM4 ненаправленного действия, образовавшихся в течение определенного периода времени (дни) после инокуляции опухолевыми клетками MOLP-8.

На фиг. 9 показаны объемы опухолей у отдельных мышей, которым вводили (А) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 или (D) nBT062-SPP-DM1, образовавшихся в течение определенного периода времени (дни) после инокуляции опухолевыми клетками MOLP-8.

На фиг. 10 показан средний объем опухоли (± стандартное отклонение) ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP-8 у мышей SCID CB.17, образовавшейся в течение определенного периода времени (дни) после инокуляции.

На фиг. 11А и В показана противоопухолевая активность nBT062-DMx в отношении CD138⁺ опухолевых клеток MOLP-8 в объемной модели опухоли MOLP-8 у мышей SCID. Объем опухоли выражен в виде среднего значения (± стандартное отклонение) для каждой группы.

Подробное описание разных и предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к агентам против клетки-мишени, в частности, к антителам против антигена CD138, более конкретно, к генетически созданным антителам против CD138. Иммуноконъюгаты, включающие указанные агенты против клетки-мишени, обеспечивают доставку эффекторных молекул к сайтам-мишеням и сайт-специфическое высвобождение эффекторных молекул в клетках-мишенях, тканях и органах или рядом с ними. Эффекторные молекулы могут быть активированы отщеплением/диссоциацией от агента против клетки-мишени иммуноконъюгата на сайте-мишени.

Антитела по настоящему изобретению и/или иммуноконъюгаты, включающие указанные антитела, можно вводить субъекту, нуждающемуся в терапевтическом лечении, или в клетки, выделенные у такого субъекта, нуждающегося в терапевтическом лечении. Одна или несколько эффекторных молекул могут высвобождаться из иммуноконъюгата в результате отщепления/диссоциации в клетке-мишени, ткани или органе или рядом с ними.

В качестве одного примера можно привести использование антитела nBT062 в хроматографическом анализе. Ткань субъекта фиксируют в формалине и заливают парафином. Антитело nBT062 добавляют в качестве первичного антитела, и экспрессированный на поверхности CD138 ткани связывается с указанным антителом. Добавляют детектирующее антитело, которое связывается с nBT062. На конечной стадии определяют связывание детектирующего антитела, содержащего хромоген. Антитело nBT062 используют для идентификации плазмоцитов человека в гемопоэтических клетках и, таким образом, для диагностики разных злокачественных новообразований кроветворной системы. Указанный метод позволяет также следить за развитием определенных карцином. При использовании антитела nBT062 в отличие от мышиного антитела уменьшается неспецифическое обнаружение вследствие меньшего перекрестного взаимодействия с Fc-рецепторами.

В качестве второго примера можно привести использование антитела nBT062 и иммуноконъюгата, включающего антитело nBT062 и по меньшей мере одно высокотоксичное лекарственное средство или иммунотоксин в качестве эффекторной молекулы, для введения субъекту, страдающему раком. В данном примере антитело nBT062, используемое в эффективном количестве, защищает CD138-экспрессирующие неопухолевые клетки от воздействия иммуноконъюгата, вводимого субъекту позднее внутривенно в терапевтически эффективном количестве, который концентрируется в раковых клетках. Одна или несколько эффекторных молекул высвобождаются из антитела против клетки-мишени под воздействием внешних факторов и индуцируют гибель клетки или остановку непрерывного клеточного цикла раковых клеток.

CD138 или синдекан-1 (определяемый также как SYND1, СИНДЕКАН, SDC, SCD1, АНТИГЕН CD138, номер доступа SwissProt: Р18827 человека) является мембранным гликопротеином, который, как первоначально было указано, присутствует на клетках эпителиального происхождения и затем был обнаружен на гемопоэтических клетках (Sanderson, 1989). CD138 имеет длинный внеклеточный домен, который связывается с растворимыми молекулами (например, факторами роста EGF, FGF, HGF) и нерастворимыми молекулами (например, с компонентами внеклеточного матрикса коллагеном и фибронектином) при помощи цепей сульфата гепарина (Langford, 1998; Yang, 2007) и действует в качестве рецептора внеклеточного матрикса. CD138 также опосредует межклеточную адгезию при помощи гепаринсвязывающих молекул, экспрессируемых смежными клетками. Установлено, что CD138 является корецептором факторов роста миеломных клеток (Bisping, 2006). Исследования дифференцировки плазмоцитов показали, что CD138 следует также считать дифференцировочным антигеном (Bataille, 2006).

В случае злокачественного гемопоэза антиген CD138 высоко экспрессирован на большинстве клеток ММ, клетках карциномы яичника, карциномы почки, карциномы желчного пузыря, карциномы молочной железы, рака предстательной железы, рака легкого, карциномы ободочной кишки, клетках лммфомы Ходжкина и неходжскинской лимфомы, хронического лимфолейкоза (CLL) (Horvathova, 1995), острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелобластного лейкоза (AML) (Seftalioglu, 2003 (a); Deftalioglu, 2003 (b)), клетках солидных тканевых сарком, карциномы ободочной кишки и других гематологических злокачественных новообразований и солидных опухолей, экспрессирующих CD138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al., 2004; Orosz and Kopper, 2001).

Другими видами рака, которые, как было установлено, экспрессируют CD138, являются многие аденокарциномы яичника, переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря, светлоклеточная карцинома почки, плоскоклеточная карцинома легкого, карцинома молочной железы и рак матки (см., например, публикации Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).

В нормальном гематопоэтическом компартменте человека экспрессия CD138 ограниченеа плазмоцитами (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999), и CD138 не экспрессирован на лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах и эритроцитах периферической крови. В частности, CD34⁺ стволовые клетки и клетки-предшественники не экспрессируют CD138, и моноклональные антитела против CD138 не воздействуют на ряд колониеобразующих единиц в культурах гемопоэтических стволовых клеток (Wijdenes, 1996). В негемопоэтических компартментах CD138 в основном экспрессирован на простом и многослойном эпителии в легком, печени, коже, почке и кишечнике. На эндотелиальных клетках было обнаружено только слабое окрашивание (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). В научной литературе было отмечено, что CD138 существует в полиморфных формах в клетках лимфомы человека (Gattei, 1999).

Моноклональные антитела В-В4, ВС/В-В4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в частности, В-В4, как было указано в научной литературе, являются специфичными к CD138. Из вышеуказанных моноклональных антител В-В4, 1D4 и MI15 узнают как интактную молекулу, так и центральный белок антигена CD138, и могут узнавать одинаковые или близкородственные эпитопы (Gattei, 1999). Предшествующие исследования показали, что В-В4 не узнает растворимый CD138 и узнает только CD138 в мембраносвязанной форме (Wijdenes, 2002).

В-В4, моноклональное антитело IgG1 мыши, связывается с линейным эпитопом между остатками 90-95 центрального белка на синдекане-1 человека (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). Было установлено, что в соответствии с паттерном экспрессии CD138 антитело В-В4 активно взаимодействует с линией плазмоцитов RPMI8226, но не взаимодействует с эндотелиальными клетками. Также в соответствии с паттерном экспрессии CD138 антитело В-В4 взаимодействует с линиями эпителиальных клеток А431 (выделенными из кератиноцитов) и HepG2 (выделенными из гепатоцитов). Иммунотоксин В-В4-сапорин также являлся высокотоксичным для линии плазмоцитов RPMI8226, фактически более токсичным, чем свободный сапорин. Однако при исследовании двух линий эпителиальных клеток В-В4-сапорин был токсичен только для линии клеток А431, хотя при выполнении клоногенного анализа В-В4-сапорин не оказывал ингибирующего воздействия на рост клеток А431 (Vooijs, 1996). Другие исследователи сообщали об отсутствии специфичности ММ-ассоциированных антигенов в отношении опухолей (Couturier, 1999).

Термин ”антитело, по существу состоящее из” определенных компонентов в контексте настоящего изобретения означает, что данное антитело состоит из точно определенных компонентов и любых дополнительных веществ или компонентов, которые не влияют на основные характеристики антитела.

В настоящем изобретении использован термин ”опухолевая клетка”, который означает раковые клетки, а также предраковые клетки, которые могут образовывать или не образовывать часть солидной опухоли.

“Агент против клетки-мишени” по настоящему изобретению может связываться с молекулой, экспрессированной клеткой-мишенью, и включает пептиды и непептиды. В частности, агенты против клетки-мишени по настоящему изобретению являются антителами против клетки-мишени и молекулами против клетки-мишени, отличными от иммуноглобулина, которые могут быть созданы на основе белков, отличных от иммуноглобулина, и включают, не ограничиваясь ими, молекулы AFFILIN®, ANTICALINS® и AFFIBODIES®. Молекулы против клетки-мишени, отличные от иммуноглобулина, включают также непептидные молекулы против клетки-мишени, такие как олигонуклеотиды ДНК и РНК против клетки-мишени (аптамеры), а также физиологические лиганды, в частности, лиганды рассматриваемого антигена, такого как CD138.

“Антитело против клетки-мишени” по настоящему изобретению является природным антителом или антителом, созданным на его основе, синтезированным или генетически созданным антителом и связывается с антигеном на представляющей интерес клетке или клетках (клетках-мишенях). Антитело против клетки-мишени по настоящему изобретению включает моноклональное антитело, поликлональное антитело, полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело) или фрагмент антитела. Антитело против клетки-мишени может быть создано, например, для улучшения сродства к клеткам-мишеням (Ross, 2003) или уменьшения иммуногенности. Антитело против клетки-мишени может быть присоединено к липосомному препарату, включающему эффекторные молекулы (Carter, 2003). Фрагмент антитела включает часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител по настоящему изобретению включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты, а также диатела; доменспецифические антитела (dAb) (Ward, 1989; патент США № 6005079); линейные антитела; одноцепочечные антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В антителе, включающем одноцепочечный фрагмент (scFv) вариабельной области, тяжелая и легкая цепи (VH и VL) могут быть связаны коротким аминокислотным линкером, например, последовательностью (глицин₄серин)_n, которая обладает достаточной гибкостью, чтобы собрать из двух доменов функциональный антигенсвязывающий карман. Добавление разных сигнальных последовательностей может обеспечить более точную направленную доставку антитела против клетки-мишени. Добавление константной области легкой цепи (CL) обеспечивает димеризацию при помощи дисульфидных связей, в результате чего достигается более высокая устойчивость и авидность. Вариабельные области для создания scFv, если имеется моноклональное антитело против представляющей интерес мишени, могут быть получены методом ПЦР с обратной транскрипцией, который позволяет клонировать вариабельные области из мРНК, экстрагированной из родительской гибридомы. Альтернативно, scFv может быть создан de novo методом фагового дисплея (Smith, 2001). В использованном здесь значении термин “функциональный фрагмент” применительно к антителу против клетки-мишени означает часть антитела против клетки-мишени, которая может специфически связываться с антигеном, с которым специфически связывается указанное антитело. Биспецифическое антитело по настоящему изобретению может, например, иметь по меньшей мере одно плечо, которое взаимодействует с тканью-мишенью, и одно плечо, которое взаимодействует с линкером (публикация патента США 20020006379). Биспецифическое антитело по настоящему изобретению может также связываться с несколькими антигенами на клетке-мишени (Carter, 2003). Антитело по настоящему изобретению может быть модифицировано, например, путем введения остатков цистеина для введения тиоловых групп (Olafsen, 2004).

В соответствии с настоящим изобретением антитело против клетки-мишени может быть выделено из любого источника и может быть, не ограничиваясь ими, верблюжьим антителом, мышиным антителом, химерным антителом ”мышь-человек” или химерным антителом ”обезьяна-человек”, в частности химерным антителом ”мышь-человек”, таким как nBT062.

Гуманизированные антитела являются антителами, которые содержат последовательности, выделенные из человеческого антитела и антитела, отличного от человеческого, и также входят в объем настоящего изобретения. Приемлемые методы гуманизации антител включают трансплантацию CDR-области (трансплантация области, определяющей комплементарность) (ЕР 0239400; WO 91/09967; патенты США № 5530101 и 5585089), маскировку или облицовку (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Padlan, 199; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), перестановку цепи (патент США № 5565332) и Delmmunosation™ (Biovation, LTD). В соответствии с методом трансплантации CDR-области определяющие комплементарность области (CDR) мыши, например из моноклонального антитела В-В4, трансплантируют в остовные области вариабельных областей человека, которые затем соединяют с константными областями человека с созданием человеческого антитела В-В4 (hB-B4). В настоящее время в клинической практике используют несколько антител, гуманизированных методом трансплантации CDR-области, включая МИЛОТАРГ (Sievers et al., 2001) и ГЕЦЕПТИН (Pegram et al., 1998).

Метод маскировки предполагает использование комбинации молекулярного моделирования, статистического анализа и мутагенеза для изменения не являющихся CDR-областями поверхностей вариабельных областей антитела с целью имитации поверхностей известных антител хозяина-мишени. Стратегии и методы маскировки антител и другие методы уменьшения иммуногенности антител в другом хозяине описаны, например, в патенте США № 5639641. Человеческие антитела могут быть получены разными методами, известными в данной области, включая методы фагового дисплея. См. также патенты США № 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318 и публикации международных заявок на патент WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.

Антитела против клетки-мишени, которые были подвергнуты любым неприродным модификациям, такие как химерные антитела ”мышь-человек” или химерные антитела ”обезьяна-человек”, гуманизированные антитела или антитела, которые были созданы, например, для улучшения их сродства к клеткам-мишеням или уменьшения иммуногенности, а также фрагменты антител, в частности, функциональные фрагменты таких антител против клетки-мишени, которые были подвергнуты любым неприродным модификациям, диатела, доменспецифические антитела, линейные антитела, одноцепочечные антитела и полиспецифические антитела, определяются в настоящем описании изобретения как генетически созданные антитела против клетки-мишени.

Химерные антитела сохраняют область связывания (ABR или Fab-область) антитела, отличного от человеческого, например, мышиного антитела, на основе которого они созданы, в то время как любые константные области могут быть выделены, например, из человеческого антитела. Как правило, химеризация и/или замена константных областей антитела не влияет на сродство антитела, так как области антитела, участвующие в связывании антигена, не затрагиваются такой заменой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения генетически созданное, в частности, химерное антитело по настоящему изобретению, может обладать более высоким сродством связывания (выраженным значениями К_D) по сравнению с соответствующим антителом, отличным от человеческого, на основе которого оно создано. В частности, антитело nBT062 и антитела на его основе могут обладать более высоким сродством связывания, чем мышиное антитело В-В4. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгаты, содержащие указанные генетически созданные/химерные антитела, также характеризуются более высоким сродством связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные иммуноконъюгаты могут также обладать другими полезными свойствами, такими как лучшее уменьшение опухолевой массы, по сравнению с иммуноконъюгатами, содержащими мышиное антитело В-В4. В предпочтительном варианте осуществления изобретения генетически созданные, в частности, химерные антитела против клетки-мишени обладают сродством связывания, которое определяется константами диссоциации К_D (нМ) менее 1,6, менее 1,5 или около или менее 1,4, в то время как мышиные антитела характеризуются константами диссоциации К_D (нМ) около или более 1,6. Иммуноконъюгаты, включающие агенты против клетки-мишени, такие как антитела против клетки-мишени, могут характеризоваться константами диссоциации К_D (нМ) менее 2,6, менее 2,5, менее 2,4, менее 2,3, менее 2,2, менее 2,1, менее 2,0, менее или около 1,9, в то время как иммуноконъюгаты, включающие мышиные антитела, могут характеризоваться константами диссоциации К_D (нМ) около или более 2,6 (ср. данные, приведенные в таблице 3 раздела ”Вещества и методы”).

Могут быть также использованы полностью человеческие антитела. Указанные антитела могут быть отобраны методом фагового дисплея, при осуществлении которого используют CD138 или его антигенную детерминанту для селективного связывания с фагом, экспрессирующим, например, вариабельные области антитела В-В4 (см. публикацию Krebs, 2001). Данный метод успешно сочетается с методом созревания аффинности для улучшения сродства антитела. Все антитела, рассмотренные в настоящем описании изобретения, являются выделенными антителами.

В одном варианте осуществления изобретения антитело против клетки-мишени является в неконъюгированном виде умеренно или плохо интернализированным. Умеренная интернализация предполагает интернализацию антитела от около 30% до около 75%, плохая интернализация предполагает интернализацию от около 0,01% до около 30% после инкубации в течение 3 часов при 37°С. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело против клетки-мишени связывается с антигеном CD138; такими антителами являются, например, антитела В-В4, ВС/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в частности, В-В4. Клетки гибридомы, полученные путем гибридизации миеломных клеток SP02/0 с клетками селезенки мышей Balb/c, депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig 11 декабря 2007 г. Указанные клетки гибридомы, экспрессирующие В-В4, имеют идентифицирующий номер DSM ACC2874. В другом варианте осуществления изобретения антитело против клетки-мишени по существу не связывается с CD138, экспрессированным не на поверхности клетки. Название конкретного антитела, определяемое в контексте настоящего изобретения термином ”антитело против клетки-мишени”, таким как ”антитело против клетки-мишени nBT062”, означает, что данное антитело против клетки-мишени обладает специфичностью связывания антитела nBT062. Указание на то, что антитело против клетки-мишени создано ”на основе” конкретного антитела, означает, что данное антитело против клетки-мишени обладает специфичностью связывания указанного антитела, но может принимать любую форму, сопоставимую с приведенным выше описанием антитела против клетки-мишени. Название конкретного антитела, объединенное в контексте настоящего изобретения с термином ”антитело против клетки-мишени”, таким как ”антитело против CD138”, означает, что антитело против клетки-мишени обладает специфичностью связывания с CD138. Указание в контексте настоящего изобретения на то, что антитело против клетки-мишени делает что-то ”селективно”, например, ”селективно воздействует на экспрессированный на поверхности клетки CD138”, или является ”селективным” в отношении чего-то, означает, что для данного антитела характерна значительная селективность (то есть более высокое сродство к CD138-положительным клеткам по сравнению с CD138-отрицательными клетками), например, в данном примере, к экспрессированному на поверхности клетки CD138 по сравнению с любыми другими антигенами. Благодаря такой селективности значительно уменьшаются или даже полностью устраняются вредные побочные эффекты в данной среде.

Термин ”молекулы против клетки-мишени, отличные от иммуноглобулина” по настоящему изобретению означают молекулы против клетки-мишени, выделенные из белков, отличных от иммуноглобулина, а также непептидные молекулы против клетки-мишени. Мелкие белки, отличные от иммуноглобулина, входящие в данное определение, обладают специфическим сродством, например, в отношении экспрессированного на поверхности CD138. Указанные мелкие белки, отличные от иммуноглобулина, включают молекулы, созданные на основе каркаса, такие как молекулы AFFILIN®, которые имеют относительно небольшую молекулярную массу, например, в пределах от 10 кДа до 20 кДа. Соответствующий каркас включает, например, кристаллическую гамма-структуру. Указанные молекулы в естественном состоянии не обладают специфической активностью связывания в отношении молекул-мишеней. Благодаря созданию белковых поверхностей путем локальной рандомизации аминокислот, подвергаемых воздействию растворителя, могут быть созданы совершенно новые сайты связывания. Таким образом, исходные не связывающиеся белки превращаются в специфически связывающиеся белки. Такие молекулы могут быть специально созданы для связывания с мишенью, такой как CD138 и могут обеспечивать специфическую доставку одной или нескольких эффекторных молекул (см. scil Proteins GmbH на сайте www.scilproteins.com, 2004). Молекулы против клетки-мишени, отличные от иммуноглобулина, другого типа, получаемые из липокалинов, включают, например, ANTICALINS®, которые имеют структуру, подобную в некоторой степени иммуноглобулинам. Однако липокалины состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 160-180 аминокислотных остатков. Связывающий карман липокалинов может быть изменен для узнавания представляющей интерес молекулы с высоким сродством и специфичностью (см., например, публикацию Beste et al., 1999). В объем настоящего изобретения входят также искусственные бактериальные рецепторы, такие как продаваемые на рынке под торговым названием AFFIBODIES® (аффибоди АВ). Указанные молекулы искусственных бактериальных рецепторов являются мелкими простыми белками и могут состоять из трех спиралей, полученных на каркасе из одного из IgG-связывающих доменов белка А (Staphylococcus aureus). Свойства связывания указанных молекул подобны многим иммуноглобулинам, но такие молекулы значительно меньше и имеют молекулярную массу, которая часто не превышает 10 кДа, и являются также сравнительно устойчивыми. Приемлемые молекулы искусственных бактериальных рецепторов описаны, например, в патентах США № 5831012, 6534628 и 6740734.

“Эффекторная молекула” по настоящему изобретению является молекулой, ее производным или аналогом, которая присоединена к агенту против клетки-мишени, в частности, к антителу против клетки-мишени и/или генетически созданному антителу против клетки-мишени, и оказывает требуемое действие, например, вызывает апоптоз или гибель клетки другого типа, остановку непрерывного клеточного цикла в одной или нескольких клетках-мишенях. Эффекторные молекулы по настоящему изобретению являются молекулами, которые могут оказывать требуемое действие в клетке-мишени и включают, не ограничиваясь ими, токсины, лекарственные средства, в частности низкомолекулярные цитотоксические лекарственные средства, радиоактивные изотопы, модификаторы биологических реакций, порообразующие агенты, рибонуклеазы, белки сигнальных путей активации апоптоза, способные индуцировать апоптоз, цитотоксические ферменты, ферменты, активирующие пролекарства, антисмысловые олигонуклеотиды, антитела или цитокины, а также их функциональные производные или аналоги/фраг