Штамм бактерий bacillus subtilis б 93 визр для защиты картофеля от болезней при хранении

Штамм бактерий bacillus subtilis б 93 визр для защиты картофеля от болезней при хранении

Реферат

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой штамм, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, обладающих фунгицидным и бактерицидным действием, может использоваться для получения биопрепарата против грибных и бактериальных болезней картофеля при хранении.

Картофель относится к числу наиболее ценных сельскохозяйственных культур. Однако его сохранение в свежем виде от урожая до урожая связано с определенными трудностями, связанными с поражением клубней фитопатогенными микроорганизмами, вызывающими значительные поражения картофеля даже при холодильном хранении.

В настоящее время ведущее место в защите плодов и овощей от фитопатогенов при выращивании и хранении занимает химический метод. Однако глобальное использование химических средств защиты приводит к ряду отрицательных последствий - нарушениям структуры биоценозов, снижению их способности к саморегуляции, накоплению пестицидов в почве, воде и продуктах питания. Кроме того, возрастает устойчивость к ним в популяциях вредителей и возбудителей болезней, снижающих эффективность их применения.

Анализ отечественной и зарубежной научно-технической литературы показал, что биологический контроль может успешно конкурировать с химическими средствами защиты, не обладая в то же время их недостатками. Микробиометод также обладает значительными преимуществами в плане экономии материалов, энергии и использования возобновляемых ресурсов. Сравнительно новое направление в развитии биоконтроля - применение биопрепаратов на основе активных штаммов антагонистов при хранении продукции растениеводства.

Известны штаммы Bacillus subtilis - продуценты ряда биологических фунгицидов - Алирина-Б, Гамаира, Бактофита, Альбита и т.д. («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2013). Однако они обладают низкой биологической эффективностью в условиях овощехранилищ и не обеспечивают эффективной защиты растениеводческой продукции от болезней при хранении. В «Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ» отсутствуют биопрепараты, рекомендованные для защиты картофеля от болезней в условиях хранилища.

Научно обосновано применение Bacillus subtilis штамм 413 для снижения потерь моркови от инфекционных заболеваний и улучшения показателей качества продукции при длительном холодильном хранении (Самусенко, 2001).

Наиболее близкий предлагаемому - В. subtilis штамм В-10 ВИЗР - продуцент препарата Алирин-Б для защиты сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2013). Но этот штамм имеет более узкий спектр действия и недостаточную биологическую эффективность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий в условиях низкой температуры при длительном хранении растениеводческой продукции. Алирин-Б рекомендован к применению на картофеле только в период вегетации против «черной ножки», ризоктониоза, фитофтороза и альтернариоза.

Задача изобретения - создание штамма, обладающего широким спектром действия и высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля и перспективного для защиты клубней от болезней при хранении.

Задача была выполнена путем отбора штамма Bacillus subtilis И5-12/23, продуцирующего комплекс биологически активных веществ, обладающего высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля при хранении. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей ГНУ ВИЗР под № Б-93 ВИЗР. Штамм выделен из почв Индии (Дели) по признакам антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Идентификация штамма проведена по определителю бактерий Берджи (Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство «Мир». 1997).

ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ

1. Морфология: Прямые палочки с закругленными концами, часто образуют цепочки.

2. Размер: 0,8-0,9×2,5-3,5 мкм.

3. Клеточная стенка и окраска по Граму: грамположительные, клеточная стенка толстая грамположительного типа (метод анализа - окраска генциановым красителем и йодистым раствором по Граму). Капсулы не образует.

4. Спорообразование: эндоспоры овальные, с центральным положением, термоустойчивые, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным условиям окружающей среды. В клетке образуется не более одной споры. Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Околоспоральных включений не обнаружено. Спорообразование не подавляется на воздухе.

5. Тип деления: поперечное бинарное.

6. Простеки: отсутствуют.

7. Подвижность: подвижные.

8. Жгутикование: перитрихиальные жгутики.

9. Пигментация колоний: колонии кремовые, матовые, плоские, с неровным краем, быстро распространяющиеся по поверхности питательной среды, в дальнейшем колонии уплотняются, становятся блестящими и приобретают коричневато-бежевый оттенок.

10. Пигмент в среду не выделяется.

11. Селективных сред нет.

12. Оксидаза: положителен.

13. Каталаза: положителен.

14. Отношение к кислороду: аэроб. В анаэробном агаре не растет.

15. Хемоорганотроф, метаболизм дыхательного типа. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, сахароза, маннит, мальтоза и лактоза. При использовании глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннита образует кислоту и ацетоин, газа не образует. Образует гидролазы. Гидролизует крахмал и казеин. Восстанавливает нитрат до нитритов.

16. В аэробных условиях на сорбите и инозите не растет.

17. Неорганические субстраты не окисляет.

18-20. В анаэробных условиях не растет.

21. Отношение к рН: штамм растет в диапазоне рН от 4,5 до 8,5. Оптимальный рН 6,5-7,5.

23. Отношение к NaCl: культура не растет при 10% NaCl.

24. Отношение к температуре: максимальная температура роста - 45-50°С, минимальная - 2-4°С, оптимальная - 22-26°С.

25. Отношение к антибиотикам: образует полипептидные и полиеновые антибиотики.

26. Цитохромы: не определяли.

27. Менахиноны: не определяли.

28. % ГЦ: не определяли.

29. Потребность в факторах роста или специальных добавках: не требуются.

30. Дополнительные сведения: штамм-продуцент биопрепарата для защиты клубней картофеля от фитопатогенных грибов и бактерий - возбудителей болезней при длительном хранении. Способ определения активности продукта: биологический по подавлению роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий.

31. Способ хранения штамма:

а) косяки со средой СПА или МПА,

б) в лиофилизированном состоянии.

32. Сроки хранения: пересевы через 6 месяцев.

33. Отношение к фагам: фаг не выделяли.

34. Генетические особенности: проведено генотипирование штамма методом ДРИМ (двойное расщепление, избирательное мечение).

Антимикробный спектр: подавляет рост фитопатогенных грибов и бактерий.

Зоны задержки роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий (радиус в мм):

Alternaria brassicicola - 20.0

Colletotrichum atrawenta - 15.0

Verticillium dahliae - 24.5

Sclerotinia sclerotiorum - 22.0

Phoma exigua -20.5

Fusarium oxysporum - 20.5

Bipolaris sorokiniana - 19.0

Helmintosporium solani - 25.0

Pythium debarianum - 15.0

Ascochyta melonis - 14.0

Septoria nodorum - 20.5

Rhizoctonia solani - 25.0

Phytophthora infestans - 20.5

Clavibacter. michiganensis var. sepedonicum - 22.0

По сравнению с прототипом предложенный штамм обладает не только более широким спектром действия в отношении возбудителей грибных заболеваний, но и высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий (табл.1).

Методы использования штамма описаны в примерах, а результаты представлены в таблицах.

Пример 1. Культивирование штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР проводили в глубинных условиях в колбах Эрленмейера в течение 72 часов на круговой качалке при 28°С до завершения фазы споруляции.

Состав жидкой питательной среды (г/л) (практикум по микробиологии под ред. Егорова Н.С., 1976):

Панкреатический гидролизат кильки - 10,05

Натрия хлорид - 4,95

Глюкоза - 10,0

Вода - до 1 литра

рН 7,1±0,2

0,5/30 мин

Определение антагонистической активности 3-суточной культуральной жидкости, полученной при глубинном выращивании штамма, проводили стандартным микробиологическим методом лунок (Практикум по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1976; Руководство к практическим занятиям по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1995). Диаметр зоны задержки роста измеряли через 3-5 суток в зависимости от скорости роста тест-культуры. Эффективность в отношении фитопатогенных грибов и спектр действия по сравнению с прототипом представлены в табл.1.

Таблица 1
Сравнительная характеристика спектра антагонистической активности штаммов В. subtilis В-10 ВИЗР и В. subtilis Б 93 ВИЗР (культуральная жидкость)
№	Виды фитопатогенных микроорганизмов	Диаметр зоны лизиса тест-культуры, мм
		В. subtilis Б 93 ВИЗР	В. subtilis В-10 (прототип)
1	Clavibacter michiganense subsp. michiganense	24	0
2	Clavibacter.michiganensis var. sepedonicum	22	0
3	Xanthomonas campestris pv. vesicatoria	18	0
4	Pseudomonas corrugata	24	0
5	P. syringae pv. tomato	30	0
6	Erwinia carotovora subsp. carotovora	24	0
7	Alternaria solani	20	18
8	Alternaria brassicicola	22	10-15
9	Fusarium graminearum	34	25-30
10	Fusarium oxysporum	20	20-30
11	Ascochyta fabae	18	18
12	Colletotrichum lagenarium	24	20
13	Rhizoctonia solani	24	18
14	Bipolaris sorokiniana	24	5-7
15	Sclerotinia libertiana	24	5-7
16	Septoria nodorum	15-20	18-20
17	Phytophthora infestans	10-20	20-21
18	Phoma exigua	14-21	20-22
19	Helmintosporium solani	15-20	25-28

Как видно из таблицы 1, штамм В. subtilis Б 39 ВИЗР, в отличие от прототипа, обладает не только антигрибной, но и высокой антибактериальной активностью. Существенно выше у предлагаемого штамма антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов Colletotrichum lagenarium, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana и Sclerotinia libertiana.

Пример 2. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР получали так же, как в примере 1. Изучение биологической эффективности в модельных опытах и в картофелехранилище осуществляли в соответствии со стандартными методиками, изложенными в следующих пособиях: «Методика исследований по культуре картофеля», М., 1967; «Методика полевого опыта», М., 1985; «Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур», М., 1965; «Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету», М., 1995; «Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве», Санкт-Петербург, 2009.

Лабораторные опыты были заложены с учетом динамики развития заболеваний в насыпи клубней в картофелехранилище в основной период хранения. Для проведения опытов были отобраны по 10 клубней на повторность с признаками болезней. Клубни были обработаны соответственно схеме опыта и заложены во влажные камеры.

В лабораторных опытах для определения влияния штамма на развитие спороношения серебристой парши клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости с титром жизнеспособных клеток 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. После обработки клубни были заложены во влажные камеры. По истечении 2-7 дней были проведены учеты интенсивности спороношения гриба, вызывающего серебристую паршу картофеля (Helmintosporium solani Dur.ex.Mont).

Экспериментальные данные статистически обработаны посредством дисперсионного анализа.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования отобранного штамма для снижения пораженности картофеля болезнями при хранении (таблица 2).

В борьбе с паршой серебристой (табл.2) штамм показал более высокую биологическую активность в сравнении с прототипом и стандартом. При проведении 1-го учета ни в одном из вариантов опыта спороношения Helmintosporium solani Dur.ex.Mont отмечено не было. Результаты второго учета показали, что развитие болезни при использовании штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР при обеих концентрациях рабочего раствора было в 2 раза ниже по сравнению со штаммом В. subtilis В-10 (прототип) и в 4,5 раз - по сравнению с контролем. Биологическая эффективность в этих вариантах опыта достигла 77.8%, показатель биологической эффективности превышал эффективность химического стандарта.

Таблица 2
Биологическая эффективность штамма B. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении спороношения серебристой парши на клубнях картофеля
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл	Второй учет (28.12.2012)	Биологическая эффективность, %
количество клубней со спороношением, Р,%	развитие болезни, R,%	Р, %	R, %
Контроль, вода	90.0	36.0	0	0
В. subtilis В-10, 109 (прототип)	70.0	16.0	22.2	55.6
В. subtilis Б 93 ВИЗР 109	40.0	8.0	55.6	77.8
B. subtilis Б 93 ВИЗР, 108	40.0	8.0	55.6	77.8
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т	60.0	12.0	33.3	67.7
НСР0,5	8.0	2.2

Пример 3. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР получали так же, как в примере 1 и 2. Закладка образцов клубней картофеля на длительное хранение с целью оценки биологической эффективности штамма в отношении комплекса болезней была проведена в картофелехранилище ГНУ ВНИИКХ (Московская область, Люберецкий район, п. Красково, микрорайон Коренево).

В опыте использовали клубни сорта Сантэ (среднеранний, универсального использования). Урожайность высокая. Сорт устойчив к раку картофеля (возбудитель Synchytrium endobioticum), золотистой картофельной цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis), вирусным болезням, восприимчив по ботве к фитофторозу. Среднеустойчив к обыкновенной парше, восприимчив к ризоктониозу и фомозу. Набор материала для проведения опытов был произведен через 3 дня после уборки урожая. Перед обработкой и закладкой на хранение проводили клубневой анализ с целью определения фитопатологического состояния картофеля. Перед закладкой на хранение клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости штамма с титром жизнеспособных клеток 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. Расход рабочей жидкости - 3 л/т. Масса образца клубней картофеля составляла 5 кг. Повторность опыта - 10-кратная. Общая масса клубней каждого варианта - 50 кг. Место размещения образцов: в насыпи картофеля на глубине 20-30 от поверхности.

Анализ результатов опыта, проведенного в условиях картофелехранилища ГНУ ВНИИКХ, подтвердили данные лабораторных опытов об эффективности отобранного штамма для защиты клубней картофеля. По окончании периода хранения в марте 2013 года был проведен клубневой анализ и определены пораженность болезнями и потери массы картофеля при хранении (таблицы 3-5).

Таблица 3
Влияние штаммов бацилл на поражение клубней картофеля болезнями в период хранения (06.09.2012-26.03.2013)
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл	Количество клубней, %
здоровых	пораженных возбудителями
	всего	в том числе
		парши обыкновенной (S. scabies)	кольцевой гнили (C. michiganensis var. sepedonicum)	фитофтороза (P. infestans)	сухой гнили (Phomaexigua)
Контроль, вода	13.3	86.7	52.3	7.4	11.8	15.2
В. subtilis В-10 ВИЗР, 109 (прототип)	30.4	69.6	47.3	4.8	8.5	9.0
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 109	32.4	67.6	53.8	2.6	8.2	3.0
B.subtilis Б 93 ВИЗР, 108	35.5	64.5	55.7	2.9	4.4	1.5
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т	30.0	70.0	54.1	3.5	8.3	4.1
НСР0,5	2.3	5.4	6.6	0.4	1.4	0.2

Отмечено существенное снижение развития болезней на клубнях семенного картофеля после обработки штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР и стандартом Максим, КС по сравнению с контролем. Количество здоровых клубней после применения штамма достигало 32.4-35.5%, в то время как в прототипе этот показатель составлял 30.4%, в контроле не превышал 13.3%. Таким образом, по сравнению с контролем выход здоровой продукции увеличился в 2.7 раза. Обработка штаммом эффективно снижала пораженность клубней всеми проявившимися заболеваниями, за исключением парши обыкновенной. Наибольший эффект штамм проявил в отношении возбудителей кольцевой и сухой гнилей картофеля. В варианте с применением штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР распространенность кольцевой гнили составила 2.6-2.9%, сухой гнили - 1.5-3.0%, что значительно ниже этих показателей у штамма В. subtilis В-10 (прототип) и стандарта фунгицида Максим, КС (4.8 и 3.5%; 9.0 и 4.1% соответственно).

Таким образом, анализ результатов опыта показал, что обработка клубней штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР перед закладкой на хранение в картофелехранилище уменьшало количество больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышало выход здорового картофеля в 2.6-2.7 раза. Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза достигала 80-90% и была существенно выше эффективности прототипа (28.0-40.8%) и стандартного фунгицида Максим, КС (29.7-73.0%) (табл.4).

Таблица 4
Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении возбудителей болезней клубней картофеля в период хранения (06.09.2012-26.03.2013)
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл	Биологическая эффективность (%) в отношении возбудителей
	кольцевой гнили (Clavibacter michiganensis var. sepedonicum)	фитофтороза (Phytophthora infestans)	сухой гнили (Phoma exigua)
Контроль, вода	-	-	-
В. subtilis В-10 ВИЗР, 109 (прототип)	35.1	28.0	40.8
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 109	64.9	30.5	80.3
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 108	60.8	62.7	90.1
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т	52.7	29.7	73.0

Таблица 5
Влияние штаммов бацилл на сохранность клубней картофеля в период хранения (06.09.2012-26.03.2013)
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости, КОЕ/мл	Масса клубней	Хозяйственная эффективность %
здоровых	потери массы, %
кг	%	всего	в том числе
технические отходы	абсолютная гниль	естественная убыль
Контроль, вода	3.66	73.2	26.8	8.0	8.4	10.4	100
В. subtilis В-10, 109 (прототип)	3.04	60.7	39.3	6.2	18.3	14.8	83.1
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 109	3.92	78.5	21.5	7,3	4.2	10.0	107.1
B. subtilis Б 93 ВИЗР, 108	4.06	81.3	18.7	4.6	7.7	6.4	110.9
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т	3.69	73.9	26.1	5.3	7.2	13.6	100
НСР0,5	0.02		1.3	1.1	2.1	0.9

Сохранность клубней после их обработки штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР была существенно выше по сравнению с прототипом и стандартом - фунгицидом Максим, КС (78.5-81.3%, 60.7% и 73.9% соответственно). Хозяйственная эффективность в вариантах с применением штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в обеих концентрациях культуральной жидкости достигала 107.1-110.9%, что существенно превышало этот показатель у прототипа. Эти варианты опыта характеризовались самыми низкими потерями массы клубней в период хранения (18.7-21.5%). В варианте с прототипом потери массы клубней достигли 39.3%. Естественная убыль массы клубней была в 1.5-2.3 раза ниже, чем у прототипа, в 1.4-2 раза ниже, чем в стандарте, и 1.5 раза ниже, чем в контроле (табл.5).

Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность отобранного штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР и перспективность его использования в качестве продуцента биопрепарата для защиты клубней картофеля от комплекса болезней при хранении.

Литература

1. Н.В. Самусенко. Научное обоснование применения бактерий-антагонистов при длительном холодильном хранении корнеплодов моркови. Дис. к.т.н., Санкт-Петербург, 2001.

2. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ, 2013. http://www.mcx.ru.

3. Методика исследований по культуре картофеля. М., ВАСХНИП, НИИКХ, 1967, 189 с.

4. Б.А. Доспехов. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.

5. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М, 1985. 130 с.

6. Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету. М., ВНИИКХ, 1995. - 105 с.

7. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве. - Санкт-Петербург. - 2009. - 377 с.

8. Практикум по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С. - М.: МГУ, 1976. - 308 с.

9. М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова, А.И. Нетрусов, Е.В. Семенова, Н.Н. Колотилова, Л.М. Захарчук, В.В. Зинченко, С.И. Мыльникова, М.В. Нефедова, И.В. Ботвинко. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

10. Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство «Мир». 1997.

Штамм бактерий Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при хранении.