Способ очистки циклопептидных соединений или их солей

Способ очистки циклопептидных соединений или их солей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к области органической химии, в частности к способу очистки соединения циклолипопептида Формулы I или его солей.

Предшествующий уровень техники

Грибковые инфекции стали основной причиной высокой заболеваемости и смертности у пациентов с иммунодефицитом. В течение последних 20 лет заболеваемость микозом значительно возросла. Население, составляющее группу повышенного риска по отношению к грибковой инфекции, включает пациентов, находящихся в критическом состоянии, пациентов, нуждающихся в хирургической помощи, и пациентов с ВИЧ-инфекцией, лейкозом, а также другими опухолями. Кроме того, пациенты с пересаженными органами также являются населением, составляющим группу повышенного риска по отношению к грибковой инфекции.

Эхинокандины представляют собой новые противогрибковые лекарственные средства, которые являются эффективными при лечении кандидоза или аспергиллеза, и примерами которых являются Каспофунгин и Микафунгин. Эхинокандины подавляют грибы, подавляя образование 1,3-β глюкозидной связи, таким образом снижая токсичность по отношению к человеку и уменьшая побочные действия, вместе с тем поддерживая высокую эффективность. Поэтому по сравнению с традиционными противогрибковыми лекарственными средствами эхинокандины являются более надежными, когда их применяют.

FK463 (Микафунгин) представляет собой соединение Формулы III, которое получают путем удаления боковой цепи предшественника, соединения FR901379 Формулы I (М₀), путем ферментативной реакции, с образованием, таким образом, соединения FR179642 (М₁) Формулы II путем химической модификации. Поэтому соединение Формулы I высокой чистоты является очень важным для получения Микафунгина высокой чистоты.

	I (М0)
	II (M1)
	III (Микафунгин)

В EP 0431350 В1 раскрыт способ очистки соединения Формулы I, где способ включает следующие стадии: ферментативную жидкость экстрагируют ацетоном; фильтрат концентрируют для удаления ацетона, промывают этилацетатом и экстрагируют н-бутанолом; фазу н-бутанола концентрируют досуха и соединение Формулы I получают с помощью хроматографии на силикагеле. Для данного способа нужно большое количество органического растворителя, и применяют силикагель, который не будет разрушаться и будет сильно загрязнять окружающую среду, поэтому такой способ будет неблагоприятным для защиты окружающей среды, вредным для физического здоровья операторов и не подойдет для крупномасштабного производства.

Поэтому в данной области является срочным нахождение способа очистки без применения большого количества растворителя или силикагеля, и такой способ может не только преодолевать недостатки предыдущего уровня техники, а также повышать чистоту соединения Формулы I.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление способа очистки соединения Формулы I.

В настоящем изобретении предложен способ очистки соединения Формулы I или его солей, причем указанный способ включает следующие стадии:

(1) смешивание ферментативной жидкости, содержащей соединение Формулы I или его соли, с органическим растворителем для экстракции ферментативной жидкости и получения экстракта 1 путем фильтрации или центрифугирования;

(2) разбавление или концентрирование экстракта 1 в вакууме для снижения содержания органического растворителя с получением, таким образом, экстракта 2;

(3) загрузка экстракта 2 в макропористую адсорбционную смолу;

(4) промывка макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и

(5) элюирование соединения Формулы I из макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента.

В способе очистки, предложенном изобретением, на стадии (3) экстракт 2 пропускают через хроматографическую колонку, наполненную макропористой адсорбционной смолой, или макропористую адсорбционную смолу непосредственно подают в экстракт, содержащий соединение Формулы I, и получающуюся в результате смесь перемешивают в течение 5-120 мин, таким образом, загружая экстракт 2, содержащий соединение Формулы I, в макропористую адсорбционную смолу; и скорость потока составляет 0,1-10 объемов колонки в час.

В способе очистки, предложенном изобретением, ферментативная жидкость на стадии (1) содержит мицелий, полученный из ферментативной жидкости при фильтрации или центрифугировании.

В способе очистки, предложенном изобретением, на стадии (2) содержание органического растворителя составляет 0-40 об.% в расчете на общий объем экстракта 2.

В способе очистки, предложенном данным изобретением, на стадии (3) массовое отношение неочищенного соединения Формулы I к макропористой адсорбционной смоле составляет 0,1-1,0:100 (г/мл).

В способе очистки, предложенном данным изобретением, на стадии (4) содержание органического растворителя составляет 0-40 об.%, предпочтительно 20-40 об.% в расчете на общий объем промывной жидкости.

В способе очистки, предложенном данным изобретением, на стадии (5) содержание органического растворителя составляет 40-90 об.%, предпочтительно 40-60 об.% в расчете на общий объем элюента.

В способе очистки, предложенном данным изобретением, макропористая адсорбционная смола выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола, или метакриловой адсорбционной смолы умеренной полярности с остатками метакрилата в своей структуре.

В другом предпочтительном воплощении адсорбционная смола выбрана из: XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-16, XAD-16HP, НР-10, НР-20, НР-20ss, НР-21, НР-30, НР-40, НР-50, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP-207, SP207ss, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, HP-2MG или их смеси.

В способе очистки, предложенном изобретением, органический растворитель выбран из: метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси.

Таким образом, в данном изобретении предложен способ очистки без применения большого количества растворителя и силикагеля, и такой способ может не только превзойти недостатки предшествующего уровня техники, но и улучшить чистоту соединения Формулы I.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1 показана ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) хроматограмма экстракта, содержащего соединение Формулы I согласно Примеру I.

На Фиг.2 показана ВЭЖХ хроматограмма соединения Формулы I, очищенного в Примере 4.

Подробное описание изобретения

Посредством большого количества экспериментов обнаружили простой способ очистки соединения Формулы I, реализуя, таким образом, настоящее изобретение.

Способ очистки соединения Формулы I, предложенный настоящим изобретением, включает следующие стадии:

(1) добавление органического растворителя в ферментативную жидкость, содержащую соединение Формулы I или его соли, для экстракции ферментативной жидкости и получения экстракта 1 путем фильтрации или центрифугирования;

(2) разбавление или концентрирование экстракта 1 в вакууме для уменьшения содержания органического растворителя, таким образом, получая экстракт 2;

(3) загрузка экстракта 2 в макропористую адсорбционную смолу;

(4) промывка макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и

(5) элюирование соединения Формулы I из макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента.

Стадию (3) можно проводить путем приведения экстракта, содержащего соединение Формулы I, в контакт с макропористой адсорбционной смолой. Приведение в контакт может быть выполнено путем: а) прямой подачи адсорбционной смолы в экстракт, содержащий соединение Формулы I, и перемешивания образующейся в результате смеси в течение 5-120 мин или б) заполнения хроматографического устройства, такого как хроматографическая колонка, адсорбционной смолой, и экстракт, содержащий соединение Формулы I, пропускают через хроматографическую колонку, где скорость потока может составлять 0,1-10 объемов колонки в час.

В одном примере изобретения способ очистки включает следующие стадии:

а) добавление органического растворителя к ферментативной жидкости, содержащей соединение Формулы I или его соли, для экстракции ферментативной жидкости и получения экстракта 1 путем центрифугирования и фильтрации;

б) разбавление или концентрирование экстракта 1 в вакууме для снижения содержания органического растворителя, таким образом, получая экстракт 2;

в) прямая подача адсорбционной смолы в экстракт 2, содержащий соединение Формулы I, и перемешивание образующейся в результате смеси в течение 5-120 мин;

г) отделение экстракта 2, содержащего соединение Формулы I, от смолы;

д) промывка макропористой адсорбционной смолы, полученной на стадии Г, с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и

е) элюирование промытой адсорбционной смолы, полученной на стадии д), при использовании воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента и сбор элюата, содержащего соединение Формулы I, с получением, таким образом, очищенного соединения Формулы I.

На стадии г) отделение включает, например, фильтрацию и центрифугирование для отделения смолы от фазы фильтрата.

В способе очистки, предложенном настоящим изобретением, ферментативную жидкость, содержащую соединение Формулы I или его соли, на стадии (1) можно получить способами, известными в данной области, например (но не ограничиваясь) ферментацией Coleophoma empetri, F-11899 (FERM BP2635), как описано в Примере 1 EP 0431350 В1.

В способе очистки, предложенном настоящим изобретением, термин «экстракция» на стадии (1) означает непосредственное добавление органического растворителя для экстракции ферментативной жидкости или фильтрации ферментативной жидкости для получения мицелия и добавление органического растворителя для экстракции мицелия. Органический растворитель выбран из: метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси; предпочтительно, органический растворитель выбран из метанола, этанола, ацетона или их смеси.

В способе очистки, предложенном настоящим изобретением, на стадии (2) содержание органического растворителя в экстракте 1, полученном на стадии (1), уменьшают путем добавления воды в экстракт 1 или концентрирования экстракта 1 в вакууме, так что содержание органического растворителя в экстракте 2 менее или равно 40%, предпочтительно 20-40% (в расчете на общий объем экстракта 2).

В способе очистки, предложенном настоящим изобретением, органический растворитель, используемый на стадиях (4) и (5), выбран из: C_1-4 спирта, C_1-4 кетона или их смеси; предпочтительно, метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси.

Во всех способах очистки, предложенных изобретением, адсорбционная смола выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола или метакриловой адсорбционной смолы умеренной полярности с остатками метакрилата в своей структуре. Предпочтительно, смола выбрана из: XAD партии адсорбционной смолы (RohmHaas, США), Diaion HP партии адсорбционной смолы (Mitsubishi Chemical Corporation, Япония). Более предпочтительно, смола выбрана из: XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, XAD-16, XAD-16HP, НР-10, НР-20, HP-20ss, НР-21, НР-30, НР-40, НР-50, HP-2MG, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP207, SP207ss или их смеси. Наиболее предпочтительно, смола выбрана из: НР20, XAD-16, XAD-16HP или SP207.

В способе очистки, предложенном настоящим изобретением, на стадии (4) содержание органического растворителя в промывной жидкости менее или равно 40%, предпочтительно 20-40%.

В способе очистки, предложенном настоящим изобретением, на стадии (5) содержание органического растворителя в элюенте составляет 40-90%, предпочтительно 40-60%.

Как используется в данном документе, термины «соединение Формулы I» или «соединение I» можно использовать взаимозаменяемо, причем оба относятся к соединению, имеющему следующую структуру, или его фармацевтически приемлемым солям:

Как используется в данном документе, термин «фармацевтически приемлемая соль» означает соли, образованные из следующих оснований: неорганическое основание, такое как натрий, калий, магний, кальций, алюминий и т.д.; органические основание, такое как метиламин, этиламин, этаноламин, диетаноламин, триэтаноламин, циклогексаноламин, лизин, орнитин и т.д., или другие основания, относящиеся к фармацевтически приемлемым солям.

Как используется в данном документе, выражения «чистота соединения Формулы I», «чистота соединения I» и «ВЭЖХ чистота соединения I» могут быть использованы взаимозаменяемо, причем все относятся к процентному отношению площади пика соединения I к сумме всех площадей пиков, как измерено в условиях детектирования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предложенных данным изобретением.

Как используется в данном документе, термин «загрузка» относится к способу приведения экстракта, содержащего неочищенное соединение I, в контакт с макропористой адсорбционной смолой, так что соединение I адсорбируется на макропористой адсорбционной смоле. Выражение «приведение в контакт» включает непосредственно подачу макропористой адсорбционной смолы в раствор и затем перемешивание, позволяя происходить адсорбции; или загрузку макропористой адсорбционной смолы в хроматографическое устройство, причем раствор пропускают через хроматографическую колонку.

Термин «промывка» макропористой адсорбционной смолы означает, что подходящий буферный раствор пропускают через макропористую адсорбционную смолу или над ней.

Как используется в данном документе, термин «промывной буферный раствор» относится к буферному раствору, используемому для промывки макропористой адсорбционной смолы (главным образом, для удаления органической фазы) перед тем, как целевое соединение I элюируют. В целях удобства, промывной буферный раствор и буферный раствор для загрузки образцов могут, но не обязательно, быть той же самой полярности.

Термин «элюирование» молекул из макропористой адсорбционной смолы означает, что молекулы удаляются из макропористой адсорбционной смолы путем изменения полярности буферного раствора вокруг макропористой адсорбционной смолы. Благодаря полярности буферный раствор может конкурировать с молекулами за центры адсорбции в макропористой адсорбционной смоле.

Как используется в данном документе, «элюирующий буферный раствор» используют для элюирования целевого соединения I из неподвижной фазы. Целевое соединение I можно элюировать из макропористой адсорбционной смолы элюирующим буферным раствором.

Термин «очистка» соединения I из композиции, содержащей целевое соединение I и одно или более чем одно нецелевое соединение, означает, что чистота соединения I в композиции повышается удалением (полностью или частично) по меньшей мере одного нецелевого соединения из композиции.

Все характеристики, упомянутые выше или в примерах изобретения ниже, можно необязательно объединять. Все характеристики, раскрытые в данном описании изобретения, можно применять в любой комбинации. Любая альтернативная характеристика, соответствующая такому же, эквивалентному или похожему назначению, может заменять каждую характеристику, раскрытую в данном описании изобретения. Поэтому если не оговорено особо, раскрытые характеристики представляют собой только общие примеры эквивалентных или похожих характеристик.

Главные преимущества изобретения включают:

1. Предложен новый дешевый способ очистки соединения циклолипопептида, в частности соединений эхинокандинов;

2. Преимущества стадий очистки в способе, предложенном данным изобретением, такие как простота способа, мягкие условия, высокий выход очистки, простота обработок, низкое загрязнение окружающей среды и тому подобное, в значительной степени уменьшают потребность в управлении процессом и оборудовании, тем самым снижая затраты;

3. Стабильные целевые продукты можно получать посредством способа, предложенного изобретением, таким образом облегчая контроль качества готовой продукции и крупномасштабного производства.

4. Целевые продукты, полученные способом, предложенным изобретением, могут удовлетворять требованиям превращения соединения I в соединение II, таким образом облегчая крупномасштабное производство соединения II и конечного продукта, соединения III.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано путем ссылки на следующие конкретные примеры. Следует понимать, что эти примеры только предназначены для того, чтобы иллюстрировать изобретение, а не ограничивать объем изобретения. Для экспериментальных способов в следующих примерах без определенных условий их выполняют в стандартных условиях или по указанию производителя. Если не оговорено особо, все процентные содержания, отношения, размеры или доли представлены по массе.

Единица массового/объемного содержания в процентах в изобретении хорошо известна специалисту в данной области, например масса растворенного вещества в 100 мл раствора.

Если не определено особо, все научные и технические термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, как обычно очевидно специалисту в данной области. Более того, любой способ или вещество, похожие или эквивалентные способу или веществу, описанному в данном документе, можно использовать в способе по настоящему изобретению. Предпочтительные воплощения и вещества, описанные в данном документе, только предложены для иллюстрации.

В следующих примерах соединение I определяют ВЭЖХ.

Анализ проводят на аналитической системе ВЭЖХ Waters. Анализ обращенно-фазовой ВЭЖХ используют для определения FR 901379, Пневмокандина В₀ и других аналогов. Вещество и условия, используемые в обращенно-фазовом анализе, приведены ниже: CALESIL ODS хроматографическая колонка (размер частиц 5 мкм, 4,6 мм внутренний диаметр × 250 мм); температура: 35°C; подвижная фаза: 50% ацетонитрил/ 0,5% однозамещенный фосфорнокислый натрий; скорость потока: 1 мл/мин; детектирование при 210 нм УФ.

Пример 1

2200 л ферментативной жидкости, содержащей соединение I, получали способом, описанным в Примере 1 EP 0431350 В1. В результате фильтрации получали 650 кг влажного мицелия. В 65 г влажного мицелия для экстракции добавляли 100 л этанола, получающуюся в результате смесь фильтровали с помощью рамного фильтр-пресса, осадок на фильтре промывали и получали 160 л экстракта 1, содержащего соединение I. В экстракте 1 содержание соединения I составляло 0,11 г/л, и его ВЭЖХ чистота составляет 74,08% (см. фиг.1 и таблицу 1 для ВЭЖХ хроматограммы.

50 л экстракта 1, содержащего в общей сложности 5,5 г соединения I, разбавляли с помощью чистой воды, так что содержание этанола было снижено до 33%, и получали 100 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 550 мл HP20ss смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 3 объема колонки в час. Затем 33% водн. этанол (2 × объемы колонки) использовали для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1800 мл 60% водн. этанола использовали в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 5,2 г с помощью ВЭЖХ (выход 94,5%), а его чистота составляла 90,3% (см. фиг.2 и таблицу 2 для ВХЖЭ хроматограммы).

Таблица 1
	Время удерживания	Площадь	Высота	% площадь
1	7,380	17747	824	0,63
2	8,196	86433	5744	3,07
3	9,627	11782	965	0,42
4	10,531	28138	2048	1,00
5	11,364	69799	3534	2,48
6	11,020	2087596	117791	74,08
7	12,473	32176	2002	1,14
8	13,444	34705	1437	1,23
9	14,137	316897	16282	11,25
10	15,273	33033	1676	1,17
11	16,332	40054	1779	1,42
12	23,203	59506	2471	2,11

Таблица 2
	Время удерживания	Площадь	Высота	% площадь
1	8,145	4472	428	0,15
2	9,100	57767	4639	1,99
3	10,500	22462	1475	0,77
4	11,732	2617300	169214	90,30
5	13,500	20314	1138	0,71
6	14,121	120749	6234	3,82
7	14,744	14455	855	0,49
8	15,332	40897	1993	1,42

Пример 2

2200 л ферментативной жидкости, содержащей соединение I, получали способом, описанным в Примере 1 EP 0431350 В1. В ферментативную жидкость добавляли тот же объем метанола для экстракции. В результате фильтрации получали экстракт 1, содержащий соединение I, где содержание соединения I составляло 0,051 г/л и ВЭЖХ чистота составляла 74,5%. 100 л экстракта 1, содержащего в общей сложности 5,1 г соединения I, разбавляли с помощью чистой воды, так что содержание метанола было снижено до 40%, и получали 200 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 700 мл XAD-16 смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 1 объем колонки в час. Затем 40% водн. метанол (2 × объемы колонки) использовали для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1800 мл 50% водн. метанола использовали в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I элюате определяли как 4,7 г с помощью ВЭЖХ (выход 92,2%), а его чистота составляла 89,2%.

Пример 3

2200 л ферментативной жидкости, содержащей соединение I, получали способом, описанным в Примере 1 EP 0431350 В1. В ферментативную жидкость добавляли тот же объем ацетона для экстракции. В результате фильтрации получали экстракт 1, содержащий соединение I, где содержание соединения I составляло 0,051 г/л и чистота ВЭЖХ составляла 74,5%. 40 л экстракта 1, содержащего в общей сложности 2,04 г соединения I, разбавляли с помощью чистой воды, так что содержание ацетона было снижено до 20%, и получали 80 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, помещали в 100 л белое пластиковое ведро и добавляли 1000 мл смолы XAD-16HP. Получающуюся в результате смесь перемешивали в течение 120 мин при комнатной температуре и затем фильтровали с помощью воронки Бюхнера, на которую клали кусочек фильтровальной бумаги. Фильтрат отбрасывали и смолу загружали в хроматографическую колонку. 2000 мл 20% водн. ацетона применяли для промывки колонки. Затем смолу элюировали 60% водн. ацетоном. Порции, содержащие соединение I, собирали. Содержание соединения I в элюате определяли как 1,75 г с помощью ВЭЖХ (выход 85,8%), а его чистота составляла 90,0%.

Пример 4

20 л экстракта 1, содержащего 2,2 г соединения I, полученного в Примере 1, концентрировали в вакууме, так что содержание этанола в экстракте 1 было снижено до 20%, получая, таким образом, 8 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 200 мл SP207 смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 3 объема колонки в час.

Затем 20% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1 л 40% водн, этанола использовали в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I элюате определяли как 1,94 г с помощью ВЭЖХ (выход 88,2%), а его чистота составляла 89,5%.

Пример 5

1450 л экстракта 1, содержащего 159,5 г соединения I, полученного в Примере I, разбавляли с использованием чистой воды, так что содержание этанола в экстракте 1 было снижено до 40%, получая, таким образом, 2950 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Неочищенный продукт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 20 л НР20 смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 10 объемов колонки в час. Затем 40% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 60 л 50% водн. этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 145,2 г с помощью ВЭЖХ (выход 91,0%), а его чистота составляла 90,4%.

Пример 6

50 л экстракта 1, содержащего 5,5 г соединения I, полученного в Примере 1, разбавляли с использованием чистой воды, так что содержание этанола в экстракте 1 было снижено до 10%, таким образом, получая экстракт 2, содержащий соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 550 мл НР20 смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 3 объема колонки в час. Затем 10% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1800 мл этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 5,15 г с помощью ВЭЖХ (выход 93,6%), а его чистота составляла 85,4%.

Сравнительный Пример 1

50 л экстракта 1, содержащего 5,5 г соединения I, полученного в Примере 1, разбавляли с использованием чистой воды, так что содержание этанола в экстракте 1 было снижено до 32%, получая, таким образом, 103 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 550 мл НР20 смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 10 объемов колонки в час. Затем 45% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1800 мл 50% этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 2,13 г с помощью ВЭЖХ (выход 38,7%), а его чистота составляла 90,4%.

Сравнительный Эксперимент 2

50 л экстракта 1, содержащего 5,5 г соединения I, полученного в Примере 1, разбавляли с использованием чистой воды, так что содержание этанола в экстракте 1 было снижено до 45%, получая, таким образом, 103 л экстракта 2, содержащего соединение I.

Экстракт 2, содержащий соединение I, полученное на предыдущей стадии, загружали в хроматографическую колонку с 550 мл НР20 смолы, причем скорость потока в течение загрузки составляла 3 объема колонки в час. Затем 33% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1800 мл 60% водн. этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 1,08 г с помощью ВЭЖХ (выход 19,6%), а его чистота составляла 85,4%.

Указанные ранее примеры представляют собой только предпочтительные примеры для настоящего изобретения, и такие примеры не могут быть использованы для того, чтобы ограничивать объем изобретения. Существенному техническому содержанию по настоящему изобретению дано широкое определение в формуле изобретения. И любые понятия или способы, выполняемые другими, следует рассматривать как эквиваленты, и они находятся в пределах объема, как определено формулой изобретения, если указанные понятия или способы являются такими же, как понятия и способы, определенные формулой изобретения.

1. Способ очистки соединения Формулы I или его солей, где указанный способ включает следующие стадии:(1) смешивание ферментативной жидкости, содержащей соединение Формулы I или его соли, с органическим растворителем для экстракции ферментативной жидкости и получения экстракта 1 путем фильтрации или центрифугирования;(2) разбавление или концентрирование экстракта 1 в вакууме для снижения содержания органического растворителя, с получением, таким образом, экстракта 2;(3) загрузку экстракта 2 в макропористую адсорбционную смолу;(4) промывание макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и(5) элюирование соединения Формулы I из макропористой адсорбционной смолы с помощью смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента; где на стадии (2) содержание органического растворителя составляет 0-40 об.% в расчете на общий объем экстракта 2; макропористая адсорбционная смола выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола, или метакриловой адсорбционной смолы умеренной полярности, содержащей остатки метакрилата в своей структуре; органический растворитель выбран из: метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси; на стадии (4) содержание органического растворителя составляет 0-40 об.% в расчете на общий объем промывной жидкости; на стадии (5) содержание органического растворителя составляет 40-90 об.% в расчете на общий объем элюента.

2. Способ по п.1, где на стадии (3) экстракт 2 пропускают через хроматографическую колонку, наполненную макропористой адсорбционной смолой, или макропористую адсорбционную смолу непосредственно подают в экстракт, содержащий соединение Формулы I, и получающуюся в результате смесь перемешивают в течение 5-120 мин, таким образом, загружая экстракт 2, содержащий соединение Формулы I, в макропористую адсорбционную смолу.

3. Способ по п.2, где скорость потока составляет 0,1-10 объемов колонки в час.

4. Способ по п.1, где ферментативная жидкость на стадии (1) содержит мицелий, полученный из ферментативной жидкости при фильтрации или центрифугировании.

5. Способ по п.1, где на стадии (3) массовое отношение неочищенного соединения Формулы I к макропористой адсорбционной смоле составляет 0,1-1,0:100 (г/мл).

6. Способ по п.1, где на стадии (4) содержание органического растворителя составляет 20-40 об.% в расчете на общий объем промывной жидкости.

7. Способ по п.1, где на стадии (5) содержание органического растворителя составляет 40-60 об.% в расчете на общий объем элюента.

8. Способ по п.1, где адсорбционная смола выбрана из: XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-16, XAD-16HP, НР-10, НР-20, HP-20ss, НР-21, НР-30, НР-40, НР-50, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP-207, SP207ss, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, HP-2MG или их смеси.