Способ получения антирабической вакцины

Способ получения антирабической вакцины

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, а именно к культивированию клеток животных и вирусов, и может быть использовано для оптимизации репродукции вирусов в культуре клеток и получения средств специфической иммунизации животных против бешенства.

Известен способ получения антирабической вакцины (патент RU №2134590, 1999), включающий выращивание вируса бешенства в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в течение 96-144 ч, внесение в вируссодержащую суспензию сначала стабилизатора белковых вирусных антигенов (полиакриловая кислота или ее железная соль в концентрации 0,7-1,0%), затем инактиванта вирусного генома (димер этиленимин в концентрации 0,1-0,3%) с дальнейшим инкубированием при 37°C в течение 20-24 ч. Полученный вируссодержащий материал используют в качестве жидкой или сухой вакцины. Однако указанный способ не обеспечивает достаточно выраженный эффект стабилизации протективных вирусных антигенов и требует большой продолжительности производственного цикла (5-7 дней).

Известен способ получения антирабической вакцины (Патент RU №2191600, 2002), включающий репродукцию вируса бешенства в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 на роллерных установках при температуре 37-38°C в течение 140-160 ч. Этот вирусный материал с низкой удельной инфекционной активностью в пределах 0,001-0,0001 ММЛД₅₀/кл используется для заражения производственной роллерной расплодки клеток, которые культивируются в тех же условиях, периодически рассеваются в отношении 1:4 с использованием свежей поддерживающей среды в течение 5-6 суток и при этом трижды производится сбор вируссодержащей культуральной жидкости. Полученный в результате материал пригоден для изготовления сухих и жидких антирабических вакцин с характеристиками иммуногенности по NIH на уровне 2,3-2,5 МЕ/мл.

Недостатком данного способа является то, что его промышленная реализация сопровождается многочисленными трудоемкими операциями, связанными с раздельным получением вирусного и клеточного производственного посевного материала в роллерных бутылях, а также с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и индивидуальной боксовой работы с каждым из них. Кроме того, полученный таким способом вирусный материал содержит недостаточно стабилизированный антиген с деструктурированным гликопротеином, что снижает эффективность вакцины. Данный способ изготовления вакцины приводит к удорожанию конечного продукта и затрудняет производство препарата на должном качественном уровне, в необходимых для ветеринарной практики количествах.

Известен способ получения антирабической вакцины, включающий культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии β-пропиолактоном с последующим получением целевого продукта (Патент RU №2287343, МПК A61K 39/205, опубл. 20.11.2006), причем инфицирование культуры перевиваемых клеток ВНК-21 проводят вирусом бешенства штамм ″Щелково-51″ из расчета 0,01-0,001 МЛД₅₀/кл, культивирование проводят в течение 36-70 ч во взвешенном состоянии и 5-6 суток на микроносителях с ежесуточным сбором вируссодержащего материала, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме.

Указанный способ трудоемок в связи с необходимостью проведения сложных процедур подготовки микроносителей к посеву клеток, снятия клеток с микроносителей и последующего отделения клеточно-вирусной суспензии от микроносителей. Эти технологические процедуры ухудшают воспроизводимость результатов, занимают много времени и не позволяют гарантировать качество целевого продукта. Кроме того, полученный таким способом антиген недостаточно стабилен, а поверхностный белок (гликопротеин) значительно деструктиризирован.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения выхода вирусного антигена, обладающего более высокой иммуногенной активностью.

Поставленная задача решается в способе получения антирабической вакцины, включающем культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии β-пропиолактоном с последующим получением целевого продукта тем, что культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК осуществляют в течение 48-72 часов до концентрации (2,5-3,0)×10⁶ кл./мл с последующим инфицированием клеток вирусом бешенства в дозе 0,01-0,1 МЛД₅₀/кл., выдерживанием при температуре 38,5-39,5°C в течение 60-90 минут с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации сублинии клеток (0,5-0,6)×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48-72 часов при температуре 37-38°C и pH 7,1-7,3, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4-8°C при pH 7,8-8,0 и добавляют трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях 0,7-0,9% и 0,006-0,01% соответственно.

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что целевой продукт получают адсорбцией инактивированного вирусного материала на 4-6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации геля 10-25 мас.%.

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что целевой продукт получают сублимационным высушиванием, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:1-0,9 с защитной средой с pH 7,7-7,9, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	2,7-3,0
пептон	9-10
сахароза	11-12
вода	остальное

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что для инфицирования культуры перевиваемых клеток ВНК в качестве вируса бешенства используют штамм вируса бешенства штаммов «Щелково-51», или «ERA G333», или «РВ-97», или «ТС-80».

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что в качестве культуры перевиваемых клеток ВНК используют культуры перевиваемых клеток ВНК-21, или ВНК-21/13, или ВНК 21/13, или ВНК-21/13-02.

Известно использование для репликации вируса бешенства культуры перевиваемых клеток ВНК - родительской линии, созданной из почек пяти однодневных хомячков в 1961 году (Alves PM, Moreira JL, Rodrigues JM, Aunins JG, Carrondo MJT (1996), Two dimensional versus three dimensional cultures systems: effects on growth and productivity of BHK cells, Biotechnol. Bio-eng. 52: 429-432).

В последующем в нашей стране были зарегистрированы следующие культуры перевиваемых клеток ВНК /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. «Каталог коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии» - Покров. - 2000 г., - с.59-63/, в частности: ВНК-21 (сублиния, поступившая из Англии, Франции, Мексики, США, Швеции и полученные в отечественных профильных учреждениях), ВНК-21/13 (сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита).

Известна также перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК 21/13 (Гринь Светлана Анатольевна «Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов», автореферат на соискание доктора биологических наук, Щелково - 2008 г., стр.5).

Кроме того, также известна перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 (патент №2300562, МПК C12N 5/06, Бюл. №16, опубл. 10.06.2007).

Известно использование штаммов «Щелково-51» (Патент РФ №2191600, МКИ А61К 39/205, 27.10.2002), «ERA G333», «РВ-97» (Патент РФ №2440139, МКИ А61К 39/205, A61P 31/12, 03.11.2010) и штамм «ТС-80» (Патент РФ №2157700, МПК А61К 39/205, 10.20.2000) для вакцин против бешенства плотоядных животных.

Использование ростовых сред в предлагаемом изобретении известно /минимальная среда Игла MEMS с 7% сыворотки КРС и модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ (Живая клетка в культуре, под. ред. Л.П. Дьяконова, М., изд. «Спутник+», 2009, с.55-94).

Трис(гидроксиметил)аминометан (синонимы: 1,1,1-трис(гидроксиметил)-метанамин; 1,1,1-трис(гидроксиметил)-метиламин; 1,1,1-трис(гидроксиметил)метиламин; 1,3-Пропандиол,2-амино-2-(гидроксиметил)-; 2-амино-2-(гидроксиметил)-3-пропандиол; 2-Амино-2-гидроксиметилпропандиол; 2-Амино-2-метилол-1,3-пропандиол; 3-Пропандиол, 2-амино-2-(гидроксиметил)-1). Применение: применяется как фармацевтический интермедиат, биохимический реагент, промежуточный продукт для фосфомицина, вулканизирующих ускорителей, косметики (крема, лосьоны), минеральных масел, парафиновый эмульсификатор /Каталог химических реактивов и высокочистых химических веществ, Изд. »Химия», М., 1971, стр.483/.

Соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты - (синонимы: комплексон-III, трилон Б, хелатон III, ЭДТА - C₁₀H₁₄O₈N₂Na₂*2H₂O). Используется в промышленности для промывки теплоэнергетического оборудования, труб, котлов; водоподготовки в котельных и теплосетях; в виде стабилизатора в процессах полимеризации; в целлюлозно-бумажной промышленности; при производстве каучука; в аналитической химии и во многих других областях /ГОСТ 10652-73/.

Для изготовления антирабических вакцин необходимы биоматериалы с высоким удельным содержанием вирусных частиц, на поверхности которых тримеры молекул гликопротеина должны быть стабилизированы в напряженной нативной конформации, обеспечивающей высокопротективные свойства антигена.

В процессе производства антигенного материала и изготовления препаратов на его основе вирусный гликопротеин, ответственный за иммуногенность, подвержен влиянию различных факторов (химических инактивантов, сублимационной сушке, сдвигам pH и ионного состава), нарушающих его нативную конформацию при выходе сформированных вирусных частиц во внеклеточную среду. В этой связи, для повышения выхода высокоиммуногенного вируса требуется стабилизация структуры протективных антигенов в процессе производства антирабических препаратов. Нами впервые установлено, что если производить культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК при определенных режимах с последующим добавлением трис(гидроксиметил)аминометана и соли динатриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты при определенных концентрациях и определенных значениях pH, то появляется новый технический результат, заключающийся в повышении накопления вирусных частиц и, соответственно, гликопротеина, ответственного за выработку вируснейтрализующих антител, а также стабилизации антигенных свойств вирусного гликопротеина.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «Щелково-51», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 1/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	2,7
пептон	9
сахароза	11
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 2/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 2. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «Щелково-51», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 3/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	3,0
пептон	10
сахароза	12
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 4/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 25 мас.%.

Пример 3. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /минимальная среда Игла MEMS с 7% сыворотки КРС/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ERA G333», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 5/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	2,7
пептон	9
сахароза	11
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 6/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 4. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /минимальная среда Игла MEMS с 7% сыворотки КРС/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ERA G333», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 7/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	3,0
пептон	10
сахароза	12
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 8/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 25 мас.%.

Пример 5. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13-02, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл, температурой суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «РВ-97», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 9/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	2,7
пептон	9
сахароза	11
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 10/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 6. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13-02, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «РВ-97», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 11/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	3,0
пептон	10
сахароза	12
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 12/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 25 мас.%.

Пример 7. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК 21/13, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл, температурой суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ТС-80», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 13/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	2,7
пептон	9
сахароза	11
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 14/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 8. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК 21/13, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ТС-80», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 15/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

желатин	2,7
пептон	9
сахароза	11
вода	остальное

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 16/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 9. Из представленной таблицы видно, что вакцины 1-16, полученные согласно примерам 1-8, обладают большей иммуногенностью при более производительном и технологичном способе изготовления.

Из представленного выше следует, что предложенный способ получения антирабической вакцины при использовании вирусов бешенства штаммов «Щелково-51», «ERA G333», «РВ-97» и «ТС-80» для инфицирования культуры перевиваемых клеток ВНК, при укороченном цикле инкубации, обеспечивает повышение удельной иммуногенной активности антигенных материалов и, как результат, - увеличение количества вакцинных доз:

- за счет увеличения накопления антигена, обеспеченного созданием оптимальных условий в системе клетка-вирус, для активизации адсорбции вируса путем введения в технологический процесс стадии инкубирования концентрата клеток и вируса при повышенной температуре;

- последующей репродукции вируса в клеточной системе, переведенной в фазу пролиферативного роста, и стабилизации нативной конформации вирусного гликопротеина, сохранения структуры его молекул в ходе выделения вируса на заключительном этапе репродукции вируса и при его сорбции на гидроокиси алюминия или сублимационном высушивании;

- благодаря максимальному сохранению антигенных и иммуногенных свойств вируссодержащего материала на промежуточных стадиях производственного цикла.

Таблица
Иммуногенность инактивированных антирабических вакцин, определенная методом NIH в международных единицах (МЕ/мл)
№№ опытных и контрольных вакцин	изготовленные из вируса, полученного через:
14 суток	30 суток
Вакцина 1	1,24	2,8
Вакцина 2	1,33	3,0
Вакцина 3	1,24	2,7
Вакцина 4	1,33	3,2
Вакцина 5	1,23	2,9
Вакцина 6	1,32	3,2
Вакцина 7	1,23	3,0
Вакцина 8	1,30	3,5
Вакцина 9	1,25	3,0
Вакцина 10	1,35	4,0
Вакцина 11	1,26	3,2
Вакцина 12	1,31	3,2
Вакцина 13	1,32	2,7
Вакцина 14	1,30	3,0
Вакцина 15	1,24	2,8
Вакцина 16	1,25	3,1
Прототип (сухая антирабическая вакцина)	0,8	1,8
Прототип (жидкая антирабическая вакцина)	0,9	1,6

1. Способ получения антирабической вакцины, включающий культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии β-пропиолактоном с последующим получением целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК осуществляют в течение 48-72 часов до концентрации (2,5-3,0)×10⁶ кл./мл с последующим инфицированием клеток вирусом бешенства в дозе 0,01-0,1 МЛД₅₀/кл., выдерживанием при температуре 38,5-39,5°C в течение 60-90 минут с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации сублинии клеток (0,5-0,6)×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48-72 часов при температуре 37-38°C и pH 7,1-7,3, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4-8°C при pH 7,8-8,0 и добавляют трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях 0,7-0,9% и 0,006-0,01% соответственно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт получают адсорбцией инактивированного вирусного материала на 4-6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации геля 10-25 мас.%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт получают сублимационным высушиванием, причем перед высушиванием вируссодер