Способ получения туберкулина для массовой диагностики и профилактики туберкулеза

Способ получения туберкулина для массовой диагностики и профилактики туберкулеза

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении, предназначенного для диагностики туберкулеза.

Туберкулез - серьезное заболевание, как правило, поражающее легкие, которое может угрожать жизни, если не назначить своевременное и правильное лечение. Передается воздушно-капельным путем от людей с активной формой заболевания.

Своевременное выявление туберкулеза во всех возрастных группах способствует уменьшению числа запущенных форм заболевания, сокращению бактериовыделителей и, следовательно, уменьшению резервуара инфекции в обществе.

Очищенный туберкулин в стандартном разведении представляет собой фильтрат смеси убитых нагреванием культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, очищенный путем ультрафильтрации, осажденный трихлоруксусной кислотой, обработанный этиловым спиртом и эфиром для наркоза, растворенный в стабилизирующем растворителе.

Активное вещество препарата - аллерген туберкулопротеин - вызывает при постановке внутрикожной туберкулиновой пробы у инфицированных или вакцинированных лиц специфическую реакцию гиперчувствительности замедленного типа в виде местной реакции - гиперемии и инфильтрата (папулы).

С целью улучшения качества препарата проведены исследования, направленные на изыскание способа получения высокоочищенного аллергена туберкулопротеина, свободного от балластных веществ, не обладающего сенсибилизирующими свойствами, обладающего высокой специфичностью и дающего минимальное количество ложноположительных реакций на введение туберкулина.

Известный способ получения туберкулина - способ Ф. Зейберт (Пономарев А.В., Специфическая профилактика инфекционных болезней / Лянда-Геллер Б.А., Современное состояние вопроса о биологической химии туберкулина, Москва, 1959 - С. 289-302). Технологией предусматривались физико-химическая очистка и концентрирование фильтрата с применением процесса ультрафильтрации культуральной жидкости, осаждение активного туберкулопротеина с применением трихлоруксусной кислоты с последующим удалением кислоты эфиром, лиофилизация эфиром конечного субстрата.

Способ получения туберкулина А.Л. Лозовской (Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены / Туберкулины, Москва «Медицина», 1990 - С. 168-174) предполагал исключение процесса ультрафильтрации. Апробированный ею способ предусматривал осаждение активного туберкулопротеина с применением трихлоруксусной кислоты с последующей обработкой 1% раствором ТХУ, 0,3% раствором K₂HPO₄, этиловым спиртом, ацетоном и эфиром. Данный способ не нашел широкого применения в производстве.

В данном изобретении для производства аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении используется синтетическая питательная среда, прототипом которой послужила «классическая» среда Линниковой и Могилевского, описанная в патенте № SU 1069783 A «Способ получения туберкулезного диагностикума».

Оптимальная среда для выращивания микобактерий туберкулеза, обеспечивающая туберкулинообразование и отличающаяся по составу от аналогичных синтетических питательных сред, применяемых для культивирования микобактерий туберкулеза, тем, что в ней вместо аспарагина присутствует гликокол. Гликокол служит источником азота, глицерин - источником углеводов и энергетических ресурсов, калий фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий хлористый и натрий углекислый, железо и аммоний лимоннокислый - источником микроэлементов.

Состав синтетической питательной среды, описанный в данном изобретении, отличается от состава «классической» питательной среды Линниковой и Могилевского по следующим показателям:

Таблица 1
Наименование компонента питательной среды	Патент SU 1069783 A «классическая» питательная среда	Заявка P №2013140658 синтетическая питательная среда	Комментарии
на 200 л питательной среды	в пересчете на 1 л	на 1 л питательной среды
Гликокол (кислота аминоуксусная)	1,7 кг	8,50 г	7,73 г	Загрузка на 10% меньше
Аммоний лимоннокислый однозамещенный или	1,0 кг	5,0 г	4,54 г	Загрузка на 10% меньше
Лимонная кислота +	-	-	4,18 г
Аммиак водный	-	-	1,18 л
Калий фосфорнокислый двухзамещенный	0,6 кг	3,0 г	2,72 г	Загрузка на 10% меньше
Натрий углекислый безводный или	0,6 кг	3,0 г	2,72 г	Загрузка на 10% меньше
Натрия карбонат 10-водный	-	-	7,36 г
Натрий хлористый	0,4 кг	2,0 г	1,82 г	Загрузка на 10% меньше
Магний сернокислый	0,2 кг	1 г	0,91 г	Загрузка на 10% меньше

Продолжение таблицы 1
Наименование компонента питательной среды	Патент SU 1069783 A «классическая» питательная среда	Заявка P №2013140658 синтетическая питательная среда	Комментарии
на 200 л питательной среды	в пересчете на 1 л	на 1 л питательной среды
Железо лимоннокислое окисное	0,01 кг	0,05 г	0,045 г	Загрузка на 10% меньше
Глицерин	14 кг	70 г	63,63 г	Загрузка на 10% меньше
Кислота ортофосфорная	60-90 мл	0,30-0,45 мл	до pH 7,0±0,1	регламентировано значение pH среды
Вода очищенная	До 200 л	до 1,0 л	до 1,0 л	до 1,0 л

Питательная среда данного состава обеспечивает активный рост туберкулезной культуры и высокое туберкулинообразование.

Изменение состава питательной среды путем пересмотра соотношения компонентов и четкое регламентирование значение рН среды позволило получить питательную среду с оптимальными параметрами, обеспечивающими возможность равномерного роста микобактерий туберкулеза в процессе культивирования.

На базе ФГУП СПбНИИВС ФМБА России были проведены сравнительные испытания образцов аллергена туберкулопротеина, полученных по одной и той же технологии, но с применением двух типов питательных сред: «классической» и синтетической питательной среды.

Все образцы прошли контроль качества в соответствии с требованиями НД на токсичность, специфическую безвредность, отсутствие сенсибилизирующих свойств, содержание белка, растворимость.

Установлено, что аллерген-туберкулопротеин, полученный с применением синтетической питательной среды, описанной в формуле изобретения, указанной в заявке №2013140658, обладает более высокой специфической активностью, по сравнению с аналогичным продуктом, полученным с применением «классической» питательной среды описанной в патенте.

Результаты сравнительных исследований специфической активности образцов, полученных с применением различных питательных сред, представлены в Таблице 2.

Образцы аллергена-туберкулопротеина - очищенные порошки туберкулина отдельных осаждений.

Образцы №1-10 - получены с применением «классической» среды Линниковой и Могилевского.

Образцы №11-20 - получены с применением синтетической питательной среды.

Таблица 2
Сравнение специфической активности образцов аллергена-туберкулопротеина, приготовленных с применением «классической» и синтетической питательных сред
Номера образцов	Специфическая активность (R)
«классическая» питательная среда	синтетическая питательная среда
Доза-навеска0,4 мг/мл	Доза-навеска0,5 мг/мл	Доза-навеска0,6 мг/мл	Доза-навеска0,4 мг/мл	Доза-навеска0,5 мг/мл	Доза-навеска0,6 мг/мл
1	0,70	0,79	0,88
2	0,64	0,77	0,85
3	0,75	0.83	0,98
4	0,69	0,8	0,97
5	0,79	0,83	0,90
6	0,74	0,88	0,98
7	0,71	0,80	0,95
8	0,63	0,80	0,94
9	0,66	0,85	0,99
10	0,73	0,88	1,00
11				0,79	1,00	1,25
12				0,75	1,20	1,38
13				0,80	1,10	1,40
14				1,10	1,40	1,70
15				0,76	0,90	1,20
16				0,85	1,15	1,40
17				0,79	1,10	1,45
18				0,65	1,00	1,37
19				0,82	1,19	1,47
20				0,80	1,30	1,60

Представленные данные позволяют сделать вывод, что при эквивалентных дозах-навесках порошков туберкулина, полученных с применением разных питательных сред, специфическая активность зависит от типа питательной среды, используемой в процессе получения полупродуктов.

Состав синтетической питательной среды:

Гликокол (кислота аминоуксусная)	7,73 г
Аммоний лимоннокислый однозамещенный	4,54 г или
(лимонная кислота - 4,18 г и аммиак водный - 1,18 л)
Калий фосфорнокислый двухзамещенный	2,72 г
Натрий углекислый безводный	2,72 г или
(натрия карбонат 10-водный - 7,36 г)
Натрий хлористый	1,82 г
Магний сернокислый	0,91 г
Железо лимоннокислое окисное	0,045 г
Глицерин	63,63 г
Кислота ортофосфорная	до pH 7,0±0,1
Вода очищенная	до 1,0 л

Микобактерии туберкулеза засеваются на синтетическую питательную среду и культивируются при температуре от 37 до 38°C в течение 6-8 недель. Сроки культивирования микобактерий туберкулеза определены 6-8 неделями, вместо 8-12 недель, поскольку к этому сроку культивирования количество образующегося туберкулопротеина достаточно велико, и в нем содержится максимум активного вещества. При более длительных сроках выращивания образуется большое количество туберкулопротеина, но последний содержит меньшее количество активного начала.

По окончании сроков культивирования предусматривается стерилизация туберкулезной культуры в автоклаве паром под давлением при температуре (101±1)°C, давлении (0,10±0,05) кгс/см² в течение (60±5) минут. Стерилизация обеспечивает не только гибель микроорганизмов и, вследствие этого, безопасность дальнейшего получения и применения препарата. В процессе нагревания происходит частичная денатурация находящегося в культуральной среде туберкулопротеина, но и дезинтеграция его крупных мицелл с образованием высокомолекулярных туберкулополипептидов. Это способствует утрате туберкулином его антигенных свойств, то есть способности образовывать специфические антитела и вызывать сенсибилизацию здорового организма. Вместе с тем, несмотря на частичную денатурацию туберкулопротеина, препарат сохраняет способность вызывать специфическую реакцию замедленного типа у инфицированных микобактериями туберкулеза или инфицированных лиц.

Следующим этапом технологического процесса является приготовление фильтрата смеси туберкулезных культур. Удаление микробных тел происходит с применением предфильтров типа АР-20, АР-25 фирмы «Миллипор» вместо асбестовых фильтрующих пластин, применяемых ранее. Дальнейшая очистка и концентрирование фильтрата туберкулезных культур проводится путем ультрафильтрации с применением мембран из полисульфона с номинальной отсечкой по молекулярной массе 10 кДа. В процессе ультрафильтрации из раствора туберкулина удаляются неколлоидные составные части - вода, соли, глицерин и остатки питательной среды, низкомолекулярные продукты азотистого, углеводного и липидного метаболизма микобактерий туберкулеза, выделившихся при их культивировании в питательную среду. Пик специфической реакции гиперчувствительности замедленного типа выявляется белками, молекулярная масса которых более 10 кДа.

Активный белок туберкулопротеин осаждают с применением 50% раствора трихлоруксусной кислоты, затем проводят дополнительную очистку материала путем центрифугирования со скоростью (2000±500) об/мин убывающими концентрациями трихлоруксусной кислоты, этиловым спиртом и эфиром наркозным.

В процессе химической очистки происходит освобождение осадка туберкулопротеина и пептидов от полисахаридов, липидов, пигментов и других примесей.

Активный белок туберкулопротеин осаждают с применением 50% раствора трихлоруксусной кислоты. Для полного осаждения раствор с осадком выдерживают при температуре от 2 до 8°C не менее 3 ч.

Полученный осадок центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Затем обрабатывают убывающими концентрациями трихлоруксусной кислоты - 10%-ным раствором ТХУ и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин и 5%-ным раствором ТХУ и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин.

Обработку осадка этиловым спиртом проводят несколько раз до обесцвечивания надосадочной жидкости. Центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Обработка материала этиловым спиртом на холоду, предусмотренная данным способом, предложена с целью более полной очистки осадка и создания гидрофильной промежуточной стадии от водного раствора трихлоруксусной кислоты к наркозному эфиру. Это также позволило сократить объемы наркозного эфира в дальнейшей обработке.

Обработку осадка эфиром наркозным проводят 7 раз. Центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Продолжительность 5, 6 и 7-й обработок составляет (20±5) мин.

Технический результат заключается в том, что способ получения аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении позволяет получить диагностический препарат, не обладающий сенсибилизирующими свойствами, обладающий стабильностью всех показателей качества в течение установленного срока годности (2 года). Кроме того, технический результат заключается в следующем:

- Аллерген-туберкулопротеин, полученный с применением заявляемой синтетической питательной среды, описанной в формуле изобретения, обладает более высокой специфической активностью, по сравнению с аналогичным продуктом, полученным с применением «классической» питательной среды, и позволяет получать продукт заданного качества при использовании сравнительно меньшей дозы-навески аллергена-туберкулопротеина.

- Сроки культивирования микобактерий туберкулеза определены 6-8 неделями, что дает высокий выход туберкулопротеина, содержащего максимум активного вещества. Сокращение сроков культивирования позволило сократить энергозатраты и трудозатраты на производство 1 г аллергена - туберкулопротеина.

- Стерилизация микобактерий туберкулеза в автоклаве паром под давлением при температуре (101±1)°C, давлении (0,10±0,05) кгс/см² в течение (60±5) минут обеспечивает не только гибель микроорганизмов и, вследствие этого, безопасность дальнейшего получения и применения препарата. В процессе нагревания происходит, как частичная денатурация находящегося в культуральной среде туберкулопротеина, так и дезинтеграция его крупных мицелл с образованием высокомолекулярных туберкулополипептидов. Это способствует утрате туберкулином его антигенных свойств, то есть способности образовывать специфические антитела и вызывать сенсибилизацию здорового организма. Вместе с тем, несмотря на частичную денатурацию туберкулопротеина, препарат сохраняет способность вызывать специфическую реакцию замедленного типа у инфицированных микобактериями туберкулеза или инфицированных лиц.

- В процессе ультрафильтрации из раствора туберкулина удаляются неколлоидные составные части - вода, соли, глицерин и остатки питательной среды, низкомолекулярные продукты азотистого, углеводного и липидного метаболизма микобактерий туберкулеза, выделившихся при их культивировании в питательную среду, что позволяет получить аллерген-туберкулопротеин высокой степени очистки и снизить количество неспецифических аллергических реакций при применении конечного продукта.

- Обработка материала этиловым спиртом на холоду, предусмотренная данным способом, создает гидрофильную промежуточную стадию при переходе от обработки водным раствором трихлоруксусной кислоты к обработке наркозномым эфиром. Это также позволило сократить количество обработок полупродукта наркозным эфиром в 2 раза и, соответственно, сократить объемы наркозного эфира, используемого для очистки полупродукта.

Пример осуществления способа.

1. Приготовление синтетической питательной среды.

В качестве питательной среды для массового культивирования микобактерий туберкулеза в целях получения туберкулина используют жидкую синтетическую питательную среду с гликоколом и глицерином.

Состав синтетической питательной среды:

Гликокол (кислота аминоуксусная)	7,73 г
Аммоний лимоннокислый однозамещенный	4,54 г или
(лимонная кислота - 4,18 г и аммиак водный - 1,18 л)
Калий фосфорнокислый двухзамещенный	2,72 г
Натрий углекислый безводный	2,72 г или
(натрия карбонат 10-водный - 7,36 г)
Натрий хлористый	1,82 г
Магний сернокислый	0,91 г
Железо лимоннокислое окисное	0,045 г
Глицерин	63,63 г
Кислота ортофосфорная	до pH 7,0±0,1
Вода очищенная	до 1,0 л

Расчет компонентов питательной среды производят, исходя из регламентированного объема готовой серии питательной среды, который составляет 50 л. Питательную среду, разливают по 0,6 л в матрацы вместимостью 1,5 л и стерилизуют в автоклаве паром под давлением при температуре (120±1)°C, давлении (1,0±0,1) кгс/см² в течение (60±5) мин.

2. Приготовление маточной культуры.

Ампулу с лиофилизированной культурой микобактерий туберкулеза вскрывают. Содержимое ампулы туберкулезной культурой человеческого вида штамма "ДТ/St" и бычьего вида штамма "Vallee" растворяют в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида.

Культуральную взвесь засевают на пробирки с питательной средой Павловского из расчета: 1 ампула на 1 пробирку. Засеянные пробирки со средой Павловского инкубируют в термостате при температуре (37,5±0,5)°C в течение (21±2) сут.

После получения доброкачественных культур обоих штаммов (не менее 2-х пассажей) с хорошим обильным ростом и наличием пленки на жидкой фазе среды Павловского, пленку пересевают на жидкую картофельную среду. Засеянные колбы с жидкой картофельной средой инкубируют в термостате при температуре (37,5±0,5)°C в течение (16±2) сут.

Выросшую на жидкой картофельной среде туберкулезную культуру обоих штаммов (рост в виде пленки) пересевают в матрацы с синтетической средой.

Засеянные туберкулезной культурой матрацы помещают в термостатную комнату и инкубируют при температуре (37,5±0,5)°C в течение 5-10 сут. Выросшая в матрацах на синтетической среде культуральная пленка является первичной маточной культурой (матрицей).

3. Посев маточных культур на синтетическую среду и их культивирование.

Полученную при инкубации в матрацах пленку туберкулезной культуры человеческого вида штамма "ДТ/St" и бычьего вида штамма "Vallee" в возрасте 5-10 сут (маточную культуру) рассевают на матрацы с синтетической средой. Засевают по 20 матрацев (24 л) синтетической питательной среды каждым штаммом микобактерий туберкулеза.

Засеянные туберкулезной культурой матрацы с синтетической средой помещают в термостатную комнату и инкубируют при температуре (37,5±0,5)°C в течение (49±7) сут.

4. Стерилизация туберкулезных культур.

Стерилизацию туберкулезных культур проводят в автоклаве паром под давлением при температуре (101±1)°C, давлении (0,10±0,05) кгс/см² в течение (60±5) минут

5. Приготовление фильтрата смеси туберкулезных культур.

Туберкулезную культуру человеческого и бычьего видов сливают из матрацев в промежуточную емкость в поштаммно равном соотношении. Смесь культур фильтруют в промежуточную емкость через предфильтры для удаления микробной биомассы (объем микробной биомассы составляет от 2 до 4 л), затем фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в стерильную емкость. Объем фильтрата смеси туберкулезных культур составляет 10-12 л.

6. Приготовление концентрированного фильтрата.

Проводят ультрафильтрацию фильтрата смеси туберкулезных культур. Процесс ультрафильтрации продолжают до тех пор, пока объем фильтрата туберкулезных культур не сконцентрируется в 8-10 раз от первоначального объема. В бутыль с концентратом добавляют стерильный 0,25% раствор фенола до первоначального объема фильтрата смеси туберкулезных культур. Раствор перемешивают и проводят повторное концентрирование до тех пор, пока объем разбавленного концентрата не сконцентрируется в 8-10 раз от первоначального объема. Объем концентрата составляет 1-1,2 л.

7. Осаждение концентрированного фильтрата. 0,15 л

В бутыль с концентрированным фильтратом прибавляют 1/8 часть от его объема (порядка 0,15 л) 50% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Бутыль 2-3 раза встряхивают. Для полного осаждения раствор с осадком выдерживают при температуре от 2 до 8°C не менее 3 ч.

8. Обработка осадка 10% раствором ТХУ.

Полученный раствор с осадком центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин для удаления надосадочной жидкости. Затем в центрифужные стаканы с осадком вносят порядка 0,10 л 10%-ного раствора ТХУ, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин.

9. Обработка осадка 5% раствором ТХУ.

В центрифужные стаканы с осадком вносят порядка 0,10 л 5%-ного раствора ТХУ, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Обработку проводят двукратно.

10. Обработка осадка этиловым спиртом.

В центрифужные стаканы с осадком вносят 0,20 л 96° этилового спирта, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин (EI-30) в течение (15±5) мин. Обработку осадка этиловым спиртом проводят трижды до обесцвечивания надосадочной жидкости. Объем этилового спирта, израсходованного на стадии суммарно, составляет 0,60 л.

11. Обработка осадка эфиром наркозным.

В центрифужные стаканы с осадком вносят 0,15 л эфира наркозного, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Обработку эфиром проводят 7 раз. Продолжительность 5, 6 и 7-й обработок (20±5) мин. Объем эфира наркозного, израсходованного на стадии суммарно, составляет 1,05 л.

Образовавшийся осадок стеклянной лопаткой распределяют по стенкам центрифужного стакана и помещают для высушивания в настольный защитный бокс. Выход очищенного порошка-полуфабриката туберкулина - аллергена туберкулопротеина составляет (5±2) г.

12. Контроль показателей качества аллергена-туберкулопротеина.

Контроль качества аллергена туберкулопротеина проводят в соответствии с требованиями Промышленного Регламента на производство Аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенного туберкулина в стандартном разведении), раствора для внутрикожного введения. Испытания стабильности препарата Аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенного туберкулина в стандартном разведении), проведенные в период с 2009 года по 2011 год, подтвердили стабильность всех показателей качества препарата в течение 2 лет 3 месяцев с момента производства и соответствие препарата требованиям Нормативной документации. Способ позволил увеличить срок годности препарата до 2 лет.

В 2012 году ФГУП СПбНИИВС ФМБА России разработана и зарегистрирована в России новая форма выпуска Аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенного туберкулина в стандартном разведении).

До 2012 года выпуск препарата осуществлялся в ампулах по 3 мл (30 доз) по 10 ампул в упаковке №10.

В настоящее время препарат выпускается в комплекте: 1 ампула по 1 мл (10 доз) препарата в комплекте с пятью одноразовыми туберкулиновыми шприцами, оснащенными механизмом, исключающим их повторное применение, с инструкцией по применению и скарификатором.

По сравнению с предыдущей формой выпуска, за счет уменьшения количества доз препарата в ампуле, исключается необходимость хранения препарата в ампуле после вскрытия, тем самым исключается вероятность микробной контаминации неизрасходованных доз препарата.

Наличие в комплекте одноразовых самоблокирующихся туберкулиновых шприцов повышает удобство применения препарата, а также соответствует современным рекомендациям ВОЗ.

1. Питательная среда для культивирования микобактерий для получения аллергена туберкулопротеина, содержащая аммоний лимоннокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий углекислый, натрий хлористый, магний сернокислый, железо лимоннокислое окисное, глицерин, кислоту ортофосфорную, воду очищенную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гликокол, при следующем содержании компонентов:

Гликокол (кислота аминоуксусная)	7,73 г
Аммоний лимоннокислый однозамещенный	4,54 г или
(лимонная кислота - 4,18 г и аммиак водный - 1,18 л)
Калий фосфорнокислый двухзамещенный	2,72 г
Натрий углекислый безводный	2,72 г или
(натрия карбонат 10-водный - 7,36 г)
Натрий хлористый	1,82 г
Магний сернокислый	0,91 г
Железо лимоннокислое окисное	0,045 г
Глицерин	63,63 г
Кислота ортофосфорная	до pH 7,0±0,1
Вода очищенная	до 1,0 л

2. Способ получения аллергена туберкулопротеина, заключающийся в том, что микобактерии туберкулеза культивируют в течение 6-8 недель на синтетической питательной среде по п.1, по окончании культивирования туберкулезную культуру стерилизуют в автоклаве паром под давлением при температуре 100-102°C, давлении 0,05-0,15 кгс/см² в течение 55-65 мин с последующей фильтрацией на мембранных фильтрах с размером пор 0,45 мкм, полученные фильтраты очищают путем ультрафильтрации с применением мембраны из полисульфона с номинальной отсечкой по молекулярной массе 10 кДа, активный белок туберкулопротеин осаждают с применением 50% раствора трихлоруксусной кислоты, затем обрабатывают убывающими концентрациями трихлоруксусной кислоты, очищают полученный материал с применением этилового спирта и эфира наркозного на центрифуге путем центрифугирования со скоростью 1500-2500 об/мин при температуре от 0 до 5°C.