Антитела против интерлейкина 17 (ил-17) человека и их применение

Антитела против интерлейкина 17 (ил-17) человека и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к антителам против ИЛ-17А человека (антитело ИЛ-17), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и их применению.

Уровень техники

Интерлейкин 17А человека (CTLA-8, Swiss Prot Q16552, далее обозначаемый «ИЛ-17») является провоспалительным цитокином, вырабатываемым подгруппой Т-клеток памяти (называемых Th17), участвующих в патогенезе рассеянного склероза (PC). ИЛ-17А участвует в индукции других воспалительных цитокинов, хемокинов и молекул адгезии. Лечение животных с помощью антител, нейтрализующих ИЛ-17А, снижает сферу охвата и тяжесть аутоиммунного энцефаломиелита (Komiyama Y. и др., J. Immunol. 177, 2006, cc.566-573). ИЛ-17А сверхэкспрессируется в цереброспинальной жидкости пациентов с рассеянным склерозом (Hellings P.W. и др., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, cc.42-50; Matusevicius D. и др., Multiple Sclerosis 5, 1999, cc.101-104; WO 2005/051422). Кроме того, антитела, нейтрализующие ИЛ-17А, снижают тяжесть и сферу охвата индуцированного коллагеном артрита в модели ревматоидного артрита (РА) у мышей, и высокие уровни ИЛ-17А могут быть выявлены в синовиальной жидкости воспаленных суставов у пациентов с РА (Ziolkowska М. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc.2832-2838; Kotake S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, cc.345-1352; Hellings P.W. и др., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, cc.42-50).

WO 96/17939, US 5716623; WO 95/18826; WO 97/15320; WO 99/35276 и WO 00/69436, WO 95/18826, US 6274711, US 6274711, WO 97/15320, US 6063372, WO 2006/013107 и WO200802115 относятся к ИЛ-17А и антителам против ИЛ-17А.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение включает антитело, связывающееся с ИЛ-17, которое отличается тем, что вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 или 9 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, а также тем, что вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6. Предпочтительно антитело отличается тем, что вариабельный домен тяжелой цепи включает SEQ ID NO:7 или 10. Предпочтительно антитело отличается тем, что вариабельный домен тяжелой цепи включает SEQ ID NO:7 или 10, а вариабельный домен легкой цепи включает SEQ ID NO:8. Предпочтительно антитело, связывающее ИЛ-17 и отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, является изотипом IgG1 человека, модифицированным в шарнирной области по положению аминокислот 216-240, предпочтительно по положению аминокислот 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй внутридоменной области по положению аминокислот 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело включает мутации L234A (аланин вместо лейцина по положению аминокислоты 234) и L235A. Предпочтительная константная область тяжелой цепи, включающая мутации L234A и L235A, показана в SEQ ID NO:11.

Предпочтительная линия гибридомных клеток по настоящему изобретению, <hИЛ-17>1А1.3С1 (антитело 3С1) депонирована в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ), Брауншвейг, Германия.

Линия клеток	Номер в коллекции	Дата депонирования
<hИЛ-17>1А1.3С1	DSM ACC2941	12 августа 2008

Антитело, получаемое из указанной линии клеток (антитело 3С1), является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Другой объект по настоящему изобретению является химерным, гуманизированным ил истощенным по эпитопу Т-клеток вариантом антитела 3С1 (DSM ACC2941). Антитело специфически связывается с ИЛ-17 с величиной IC₅₀, равной 1 нМ или меньше. Предпочтительными версиями 3С1 являются Mab 106 и Mab 107.

Настоящее изобретение также относится к антителу, связывающему ИЛ-17 и отличающемуся тем, что связывается с тем же эпитопом ИЛ-17, с которым связывается моноклональное антитело 3С1. Антитело, связывающееся с ИЛ-17 со сродством, составляющим по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, является изотипом IgG1 человека, модифицированным в шарнирной области по положению аминокислот 216-240, предпочтительно по положению аминокислот 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй внутридоменной области по положению аминокислот 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело является изотипом IgG1 человека, включающим мутации L234A (аланин вместо лейцина по положению аминокислоты 234) и L235A.

Предпочтительно антитело является гуманизированным или антителом человека. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению ингибирует в концентрации 100 нг/мл индуцированную ИЛ-17А макаки крабоеда выработку ИЛ-6 и ИЛ-8 в анализе высвобождения цитокина с величиной IC₅₀, равной 1,5 нМ или ниже, используя кожные фибробласты макаки крабоеда.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция антитела по настоящему изобретению. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает антитело, отличающееся связыванием с тем же эпитопом ИЛ-17, с которым связывается моноклональное антитело 3С1. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции, связывающееся с ИЛ-17 со степенью сродства, составляющей по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, является изотипом IgG1 человека, модифицированным в шарнирной области по положению аминокислот 216-240, предпочтительно по положению аминокислот 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй внутридоменной области по положению аминокислот 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антителом является изотип IgG1 человека, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина по положению аминокислоты 234) и L235A.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения применяют антитело по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает антитело, отличающееся связыванием с тем же эпитопом ИЛ-17, с которым связывается моноклональное антитело 3С1. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции, связывающееся с ИЛ-17 со степенью сродства, составляющей по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, является изотипом IgG1 человека, модифицированным в шарнирной области по положению аминокислот 216-240, предпочтительно по положению аминокислот 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй внутридоменной области по положению аминокислот 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело является изотипом IgG1 человека, включающим мутации L234A (аланин вместо лейцина по положению аминокислоты 234) и L235A.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения применяют антитело по настоящему изобретению для лечения рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, болезни Крона, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), астмы и отторжения трансплантата. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения фармацевтической композиции, включающей антитело по настоящему изобретению. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает антитело, отличающееся связыванием с тем же эпитопом ИЛ-17, с которым связывается моноклональное антитело 3С1. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции, связывающееся с ИЛ-17 со степенью сродства, составляющей по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, является изотипом IgG1 человека, модифицированным в шарнирной области по положению аминокислот 216-240, предпочтительно по положению аминокислот 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй внутридоменной области по положению аминокислот 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело является изотипом IgG1 человека, включающим мутации L234A (аланин вместо лейцина по положению аминокислоты 234) и L235A.

Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с ИЛ-17, которое отличается включением области CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:1, и предпочтительно мутаций L234A и L235A в константный домен тяжелой цепи IgG1. Предпочтительно антитело включает также область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 или 9 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3. Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с ИЛ-17, которое отличается включением области CDR3 легкой цепи по настоящему изобретению и предпочтительно мутаций L234A и L235A в константный домен тяжелой цепи IgG1. Предпочтительно антитело включает также область CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:2 или 9 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3. Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по настоящему изобретению, отличающееся включением вариабельного домена тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7 или 10 и вариабельного домена легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8 и предпочтительно мутаций L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG1.

Антитело по настоящему изобретению отличается тем, что константные цепи происходят от человека. Такие константные цепи известны в данной области и, например, описаны Kabat (см., например, Johnson G. и Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc.214-218). Например, полезная константная область тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с мутациями L234A и L235A. Например, полезная константная область легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность константной области каппа-легкой цепи последовательности SEQ ID NO:12. Также предпочтительно, чтобы антитело происходило от мыши и включало основу вариабельной последовательности антитела мыши по Kabat (см., например, Johnson G. и Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc.214-218).

Антитело по настоящему изобретению особенно отличается подавлением выделения интерлейкина-8 (ИЛ-8) из клеток CCD25-SK. Антитело по настоящему изобретению специфически нейтрализует опосредованную ИЛ-17 активацию клеток с величиной IC₅₀, равной 0,5 нМ (16 нг/мл) или менее. Антитело по настоящему изобретению специфически связывается с ИЛ-17 с величиной IC₅₀, равной 1 нМ или менее.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно является изотипом IgG1 человека. Предпочтительные константные области γ1 тяжелой цепи показаны в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:11 без мутаций L234A и L235A.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно отличается отсутствием связывания фактора C1q комплемента человека и, следовательно, не обладает эффекторной функцией CDC.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно является изотипом IgG1 человека, модифицированным в шарнирной области по положению аминокислот 216-240, предпочтительно по положению аминокислот 220-240, между C_H1 и C_H2, и/или во второй внутридоменной области по положению аминокислот 327-331 между C_H2 и C_H3. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно отличается принадлежностью к изотипу IgG1 человека, содержащему по меньшей мере одну мутацию L234 (лейцина по положению аминокислот 234), L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и/или Р329 (нумерация по индексу EU). Предпочтительно антитело является изотипом IgG1 человека, включающим мутации L234A (аланин вместо лейцина по положению аминокислоты 234) и L235A.

Настоящее изобретение также предусматривает векторы экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для получения путем рекомбинации такого антитела. Настоящее изобретение также включает прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, включающие вектор по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способ получения рекомбинантного антитела человека или гуманизированного антитела по настоящему изобретению, отличающийся экспрессией нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, и выделения указанного антитела из указанных клеток или супернатанта культуры клеток. Настоящее изобретение также включает антитело, получаемое таким рекомбинантным методом.

Антитела по настоящему изобретению демонстрируют пользу для пациентов, нуждающихся в ИЛ-17 нацеливающей терапии. Антитела по настоящему изобретению обладают новыми и патентоспособными свойствами, приносящими пользу для пациента со следующими иммунологическими заболеваниями, особенно с рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, псориазом, болезнью Крона, хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ), астмой или отторжением трансплантата. Антитела по настоящему изобретению не вызывают чувствительности к стафилококковой и кишечной бактериальной инфекции у подвергаемых лечению пациентов. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения пациента с рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, псориазом, болезнью Крона, хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ), астмой или отторжением трансплантата, включающий введение пациенту с установленным указанным заболеванием (и, следовательно, нуждающемуся в такой терапии) эффективного количества антитела, связывающегося с ИЛ-17, по настоящему изобретению. Антитела предпочтительно вводят в фармацевтической композиции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения пациента с рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, псориазом, болезнью Крона, хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ), астмой или отторжением трансплантата, отличающийся введением пациенту антитела по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает применение антитела по настоящему изобретению для лечения пациента с рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, псориазом, болезнью Крона, хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ), астмой или отторжением трансплантата и для получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение также включает способ получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, включающую антитело по настоящему изобретению, необязательно вместе с буфером и/или адъювантом, для состава антител для фармацевтических целей. Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции, включающие антитело по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть включена в изделие или в набор.

Подробное описание изобретения

Понятие «антитело» охватывает разные формы структур антител, включая, но ими не ограничиваясь, целые антитела и фрагменты антител. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно является гуманизированным антителом, химерным антителом или другим генетически сконструированным антителом, измененным, но не утратившим специфических свойств по настоящему изобретению. Понятие «фрагменты антитела» включают часть антитела полной длины, предпочтительно его вариабельный домен, или по меньшей мере его сайт связывания антигена. К примерам фрагментов антител относятся двухвалентные антитела, молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичных антител, сформированных из фрагментов антител. Антителами scFv являются, например, антитела, описанные в работе Huston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, cc.46-52. Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные полипептиды, обладающие свойствами домена V_H, т.е. способные соединяться вместе с доменом V_L, или с доменом V_L, связывающимся с ИЛ-17, т.е. способные соединяться вместе с доменом V_H с функциональным антиген-связывающим сайтом и тем самым обеспечивающим свойства антитела по настоящему изобретению. Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела», используемые в настоящем изобретении, относятся к получению молекул антител одной аминокислотной композиции. Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, у которых каркасный участок и/или «комплементарно детерминируемые области (complementary determining regions - CDR)» модифицированы для включения CDR иммуноглобулина от другого вида по сравнению с CDR исходного иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения CDR мыши пересаживают в каркасный участок антитела человека для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270.

Понятие «связывание с ИЛ-17», используемое в настоящем изобретении, означает связывание антитела с ИЛ-17 человека в анализе связывания ELISA. Связывание устанавливают, если антитело вызывает соотношение С/Ш (сигнал/шум) 7:1 или более при концентрации антитела 1 мкг/мл. Антитело по настоящему изобретению специфически связывается с ИЛ-17А человека с величиной IC₅₀, равной 1 нМ (0,15 мкг/мл) или ниже. Антитело не связывается с ИЛ-17 В, С, D, Е и F (соотношение С/Ш (сигнал/шум) ниже 7:1) и, следовательно, специфически связывается с ИЛ-17А. Связывание с ИЛ-17 А и вариантами проводят методом ELISA, используя иммобилизованный ИЛ-17 или его вариант.

Понятие «эпитоп» означает белковый детерминант, способный специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, например аминокислот или боковых цепей сахаров, и обычно эпитопы имеют специфические трехмерные пространственные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первыми, но не со вторыми, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению связывается специфически с нативным, но не денатурированным ИЛ-17. Антитело ИЛ-17 по настоящему изобретению связывается с тем же эпитопом на ИЛ-17, с которым связывается антитело Mab317. Свойство связывать эпитоп антитела ИЛ-17 по настоящему изобретению может быть определено, используя методы, известные в настоящем изобретении. Антитело ИЛ-17 тестируют in vitro с помощью анализа перекрестного блокирующего связывания для определения способности исследуемого антитела препятствовать связыванию антитела Mab317 с ИЛ-17. Если происходит вытеснение исследуемого антитела антителом Mab317 по меньшей мере на 15%, тогда эпитопы находятся в непосредственной близости.

Понятие «вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (V_L), вариабельный домен тяжелой цепи (V_H)) в контексте настоящего изобретения означает каждую из доменов пары легкой и тяжелой цепи, которые непосредственно вовлечены в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей имеют ту же общую структуру, и каждый домен включает четыре области каркасных участков (FR), последовательности которых в высокой степени консервативные, соединенные тремя «гипервариабельными областями» (или комплементарно детерминируемыми областями - CDR). Каркасные участки принимают конфигурацию β-плоскости и CDR могут формировать петли, соединяющие структуру β-плоскости. Области CDR в каждой цепи поддерживаются в присущей им трехмерной структуре каркасными участками и формируют вместе с областями CDR из другой цепи сайт связывания антигена. Области CDR3 легкой цепи антитела играют особенно важную роль в специфическом связывании/сродстве антител по настоящему изобретению и, следовательно, предусматривают другой объект по настоящему изобретению.

Понятие «антиген-связывающая часть антитела», используемое в настоящем изобретении, относится к аминокислотным остатка антитела, ответственным за связывание антигена. Антиген-связывающая часть антитела включает аминокислотные остатки из «комплементарно детерминируемых областей (CDR)». Понятия «каркасный участок (Framework - FR)» или «области FR» относятся к тем вариабельным областям доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельных областей, описанных в настоящем изобретении. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антител включают от N- до С-конца домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Особенно CDR3 тяжелой цепи является областью, которая наибольшим образом содействует связыванию антигена и обусловливает свойства антитела. Области CDR и FR определяют по стандартному определению Kabat и др. в кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Мэриленд, и/или по таким остаткам из «гипервариабельной петли».

Понятие «аминокислота», используемое в настоящем изобретении, означает группу природных карбокси-α-аминокислот, включая аланин (по трехбуквенному коду: ala, по однобуквенному коду: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Понятия «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего изобретения означают молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», если она расположена в функциональной связи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК последовательности-предшественника или секреторного лидера оперативно связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в качестве белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связаны с кодирующей последовательностью, если они воздействуют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы является оперативно связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы способствовать трансляции. Обычно «оперативно связанный» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются лежащими на одной прямой и в случае секреторного лидера соприкасаются в рамке считывания. Однако энхансеры не должны соприкасаться. Связывание дополняется лигированием по соответствующим сайтам рестрикции. Если таких сайтов нет, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры согласно с обычной практикой. В контексте настоящего изобретения понятия «клетки», «клеточные линии» и «культуры клеток» используют взаимозаменяемо, и все эти обозначения включают последующие генерации. Таким образом, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают клетки главного субъекта и культуры, производные от них, независимо от числа пересевов. Также следует понимать, что все последующие генерации могут быть полностью неидентичными по ДНК из-за спланированных или случайных мутаций. К этим понятиям также относятся варианты последующих генераций, имеющие ту же функцию или то же биологическое действие, что и первоначально трансформированные клетки.

«Часть Fc» антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции. Термин «часть Fc антитела» известен специалистам в данной области и определяется по расщеплению антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей, антитела или иммуноглобулины делятся на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. По константным областям тяжелой цепи разные классы иммуноглобулинов называются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Часть Fc антитела непосредственно включена в ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность) и CDC (complement-dependent cytotoxicity - комплемент-зависимую цитотоксичность), основанные на активации комплемента, связывании C1q и связывании рецептора Fc. Активация комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора комплемента C1q с частью Fc большинства антител подкласса IgG. Хотя влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в части Fc. Такие сайты связывания известны в данной области и описаны, например, Boakle R.J. и др., Nature 282, 1979, cc.742-743; Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, cc.2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, cc.907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, cc.338-344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc.995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc.4178-4184; Hezareh M. и др., J. Virology 75, 2001, cc.12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc.319-324; ЕР 0307434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация по индексу EU по Kabat, см. ниже). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 обычно проявляют активирование комплемента и связывание C1q, хотя IgG4 не активирует систему комплемента и не связывает C1q.

Антитело по настоящему изобретению включает часть Fc, происходящую от человека, которая является частью Fc антитела человека подкласса IgG1. Для части Fc антитела по настоящему изобретению предпочтительно нельзя обнаружить связывания C1q, согласно описанному ниже.

Таким образом, настоящее изобретение включает антитело по настоящему изобретению, отличающееся тем, что указанное антитело связывает ИЛ-17, содержащий часть Fc, происходящую от человека, и не связывает фактор C1q комплемента человека и, следовательно, избегает эффекторной функции CDC.

Предпочтительно антитело по настоящему изобретению связывается с рецептором Fey подкласса IgG1 или IgG2 человека, с мутацией в L234, L235 и/или D265 и/или мутацией PVA236. Предпочтительны мутации L234A, L235A, L235E и/или PVA236 (PVA236 означает, что аминокислотная последовательность ELLG (по однобуквенному коду аминокислот) в положениях аминокислот 233-236 у IgG1 или EFLG у IgG4 замещена на PVA). Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает антитело по настоящему изобретению, отличающееся тем, что указанное антитело является антителом подкласса IgG1 человека, включающее по меньшей мере одну мутацию L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и/или Р329. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является антителом человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело является гуманизированным. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело по настоящему изобретению, содержащее часть Fc, производную от антитела человека, и отличающееся тем, что указанное антитело является антителом человека подкласса IgG1, содержащим по меньшей мере одну мутацию в L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и указанное антитело связывается с ИЛ-17 с величиной K_D менее 10^-8 М в анализе BIAcore. В другом варианте осуществления настоящего изобретения диапазон K_D составляет от 10^-11 до 10^-9 М.

Связывание C1q может быть измерено по Idusogie Е.Е. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc.4178-4184. Но связывание C1q по настоящему изобретению отличается тем, что в таком анализе, в котором планшет ELISA покрыт разными концентрациями антитела, добавляют C1q человека. Связывание C1q определяют с помощью антитела, направленного против C1q человека, с последующим выявлением конъюгата, меченного пероксидазой, с субстратом для пероксидазы ABTS® (2,2'-азино-ди-[3-этилбензтиазолинсульфонатом]). По настоящему изобретению не установлено связывание C1q, если оптическая плотность (ОП) при 405 нм исследуемого антитела ниже 0,05 при концентрации антитела 10 мкг/мл.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно отличается тем, что константные цепи происходят от человека. Такие константные цепи известны в данной области и описаны, например, Kabat (см., например, Johnson G. и Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc.214-218). Например, полезная константная область тяжелой цепи человека включает SEQ ID NO:23. Например, полезная константная область легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность константной области каппа-легкой цепи SEQ ID NO:12.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую и легкую цепи антитела по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает способ лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, отличающийся введением пациенту терапевтически эффективного количества антитела по настоящему изобретению. Настоящее изобретение включает применение антитела по настоящему изобретению для лечения. Настоящее изобретение включает применение антитела по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для профилактики и лечения воспалительных и тромботических расстройств. Настоящее изобретение включает применение антитела по настоящему изобретению для лечения воспалительных заболеваний, предпочтительно для лечения хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), рассеянного склероза и ревматоидного артрита.

К антителам по настоящему изобретению также относятся такие антитела с «модификациями консервативных последовательностей» (варианты антител), модификациями нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не влияют или не изменяют указанные выше характеристики антитела по настоящему изобретению. Модификации могут быть интродуцированы стандартными методами, известными в данной области, например сайт-направленным мутагенезом и ПЦР-опосредованным мутагенезом. К консервативным аминокислотным замещениям относятся те, в которых аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие сходные боковые цепи, определены в настоящей области. К этим семействам относятся аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, прогнозировавшиеся аминокислотные остатки в анти-ИЛ-17 антителе человека могут быть предпочтительно замещены другими аминокислотными остатками из семейства с той же боковой цепью. «Вариантом» анти-ИЛ-17 антитела в контексте настоящего изобретения называется молекула, которая отличается по аминокислотной последовательности от «исходной» аминокислотной последовательности анти-ИЛ-17 антитела десятью, предпочтительно примерно двумя-пятью, добавлениями, делециями и/или замещениями в одной или нескольких вариабельных областях исходного антитела. Аминокислотные замещения могут быть получены мутагенезом, основанным на молекулярном моделировании, описанном Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327, и Queen С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc.10029-10033.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает способ получения антитела против ИЛ-17, который не связывает рецептор Fcγ и/или C1q, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела типа IgG1 человека, связывающаяся с ИЛ-17, модифицирована таким образом, что указанное модифицированное антитело не связывается с C1q и/или Fcγ рецептором, указанная модифицированная нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь указанного антитела, инсертированы в вектор экспрессии, указанный вектор инсертирован в эукариотическую клетку-хозяина, кодируемый белок экспрессируется и выделяется из клеток-хозяев или из супернатанта.

Идентичность или гомология последовательностей в настоящем изобретении выражена в виде процента аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, идентичной с исходной последовательностью, после выравнивания последовательностей и интродукции гэпов при необходимости для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Ни одна из N-концевой, C-концевой или внутренней мутации по типу протяженного отрезка, делеции или инсерции в последовательность антитела не может быть сконструирована в качестве определяющей идентичность или гомологию последовательности. Вариант сохраняет способность связывать ИЛ-17 человека и предпочтительно обладает свойствами, превосходящими свойства исходного антитела. Например, вариант может проявлять пониженные побочные эффекты при лечении.

«Исходное» антитело включает области CDR антитела 3С1 и предпочтительно используется для получения варианта. Предпочтительно исходное антитело содержит каркасный участок и, если имеется, содержит константную область антитела человека или константные домены антитела человека. Например, исходное антитело может быть гуманизированным антителом или антителом человека.

Антитела по настоящему изобретению предпочтительно получают методами рекомбинации. Такие методы хорошо известны в данной области и включают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и обычно очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи или их фрагменты, инсертируют в векторы экспрессии стандартными методами. Экспрессию проводят в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, например клетках СНО, клетках NS0, клетках SP2/0, клетках HEK293, клетках COS, в дрожжах или клетках Е.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или после лизиса клеток). Рекомбинантное получение антител известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, cc.183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc.271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc.151-160; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, cc.870-880. Антитела могут присутствовать в целых клетках, в лизатах клеток или в частично очищенной или существенно очищенной форме. Очистку проводят для элиминации других клеточных компонентов или других контаминантов, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая колоночную хроматографию и другие, хорошо известные в данной области. См. кн.: «Current Protocols in Molecular Biology», 1987, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Экспрессию в клетках NSO описывают, например, Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, cc.109-123; Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, cc.261-270. Кратковременную экспрессию описывают, например, Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с.Е9. Клонирование вариабельных доменов описывают Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc.3833-3837; Carter Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc.4285-4289; Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc.77-87. Система предпочтительной кратковременной экспрессии (HEK 293) описана Schlaeger E.-J. и Christensen K., Cytotechnology 30, 1999, cc.71-83, и Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996, cc.191-199. Моноклональные антитела соответствующим образом отделяют от культуральной среды обычными методами очистки иммуноглобулина, например хроматографией с применением белка А-Цефарозы, гидроксилапатита, гель-электрофорезом, диализом или аффинной хроматографией. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать, используя обычные процедуры. Гибридомные клетки могут служить источником такой ДНК и РНК. После выделения ДНК может быть инсертирована в векторы экспрессии, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, например клетки HEK 293, клетки СНО или клетки миеломы, которые иным образом не вырабатывают белок, для синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

Варианты аминокислотной последовательности антитела ИЛ-17 человека получают путем внедрения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую антитело, или синтезом пептида. Однако такие модификации могут быть осуществлены только в весьма ограниченном диапазоне, например, описанном выше. Например, модификации не изменяют указанных выше свойств антитела, например, изотипа IgG и связывания эпитопа, но могут улучшить выход рекомбинантного продукта, стабильность белка или облегчить очистку. Какой-либо остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации анта-ИЛ-17 антитела, также может быть замещен, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и для предупреждения нарушенного перекрестного скрещивания. Напротив, цистеиновые связи (связь) могут быть добавлены к антителу для улучшения его стабильности (особенно если антитело является фрагментом антитела, например, фрагментом Fv). Другой тип варианта аминокислоты антитела изменяет первоначальный вариант гликозилирования антитела. Понятие «изменени