Способ нейтрализации вируса гепатита с, полностью человеческое моноклональное антитело против вируса гепатита с (варианты), композиция полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с и гибридная мышь/человек клеточная линия - продуцент полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с (варианты)

Способ нейтрализации вируса гепатита с, полностью человеческое моноклональное антитело против вируса гепатита с (варианты), композиция полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с и гибридная мышь/человек клеточная линия - продуцент полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам и технологии нейтрализации вируса гепатита С, а именно к антителам против вируса гепатита С, и может использоваться в медицине, фармацевтической промышленности и смежных отраслях науки и техники.

Гепатит С является широко распространенным в мире опасным вирусным заболеванием. Согласно проведенным статистическим исследованиям, в мире вирусом гепатита С (HCV) заражены более 170 миллионов человек, то есть почти в 5 раз больше, чем вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). HCV-инфекция вышла на первое место в ряду причин печеночно-клеточного рака; кроме того, она стала наиболее частой причиной трансплантации печени у взрослых в западных странах (Mohd Hanafiah K, Groeger J, Flaxman AD, Wiersma ST. Hepatology. 2013, 57(4):1333-1342). HCV-инфекция во многих случаях протекает без клинических проявлений, несмотря на воспаление и фиброз печени, которые носят стойкий и прогрессирующий характер и в конечном итоге приводят к циррозу печени, печеночной недостаточности или раку печени (Zoulim F, Chevallier М, Maynard M, Trepo С.Rev Med Virol. 2003, 13(1):57-68). Проблема усугубляется тем, что вирус HCV очень часто остается в организме инфицированных больных навсегда - доля инфицированных, у которых вирус вызывает хроническую инфекцию, составляет до 85%. Все эти причины делают исследования, направленные на диагностику и лечение гепатита С, весьма актуальными и практически важными.

Вирус гепатита С (Hepatitis С Virus, HCV) был впервые идентифицирован в 1989 г. (Chen SL, Morgan TR. Int J Med Sci. 2006, 3(2):47-52), однако масштаб проблемы, которую он представляет для здравоохранения, и нагрузки, создаваемой вызываемым им заболеванием, в полной мере осознан лишь в последние годы, когда появились достаточно надежные методы его диагностики. В настоящее время считается, что распространение данного вируса происходило в течение нескольких десятилетий или даже дольше, причем случаи заражения в недавнем прошлом были часто связаны с внутривенным введением лекарственных препаратов и другими неустановленными факторами/способами передачи инфекции (Aceijas С, Rhodes Т. Int J Drug Policy. 2007, (5):352-358).

HCV - это небольшой (40-60 нм в диаметре), оболочечный, одноцепочечный РНК-содержащий вирус рода Hepacivirus семейства Flaviviridae. Как геном вируса HCV, так и белки, кодируемые его генами, полностью охарактеризованы (Kato N. Microb Comp Genomics. 2000, 5(3): 129-151). Положительная цепь РНК вирусного генома состоит из 5′-нетранслируемой области, одной открытой рамки считывания длиной около 9 000 нуклеотидов и короткой 3′- нетранслируемой области (фиг.1). Открытая рамка считывания кодирует один полипептид длиной приблизительно 3 010 аминокислот, так называемый «полипротеин», который во время и после трансляции расщепляется в нескольких точках под действием сигнальных хозяйских пептидаз, а также протеаз, кодируемых HCV (Niepmann M. Curr Top Microbiol Immunol. 2013, 369:143-166). В результате этого расщепления образуются по крайней мере три структурных белка (Core, E1 и Е2) и шесть неструктурных (NS) белков (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B).

Е1 и Е2 представляют собой два сильно гликозилированных белка вирусной оболочки, которые могут взаимодействовать с плазматическими мембранами гепатоцитов и других клеток, опосредуя прикрепление вируса и его проникновение в клетку. Белки Е1 и Е2 образуют друг с другом гете-ромерные комплексы, однако вопрос о том, должны ли эти белки ассоциировать друг с другом для связывания с клеточными мембранами, окончательно не решен. Гликопротеин Е1 (аминокислоты 192-383 полипротеина) служит шапероном для правильной укладки белка Е2 во время его синтеза, облегчает связывание Е2 с поверхностными рецепторами клеток и, как считается, участвует в слиянии вируса с клеточной мембраной (Poenisch M, Bartenschlager R. Semin Liver Dis. 2010, 30(4):333-347). Гликопротеин Е2 (аминокислоты 384-746 полипротеина) содержит гипервариабельный участок в N-концевой области (аминокислоты 384-411). NS-белки представляют собой ферменты или вспомогательные факторы, которые катализируют и регулируют репликацию РНК-генома HCV. Соге-белок взаимодействует с вирусной РНК и образует нуклеокапсид (Piceiro D, Martinez-Salas Е. Viruses. 2012, 4(10):2233-2250).

В настоящее время предполагается следующая модель жизненного цикла HCV (Kim CW, Chang KM. Clin Mol Hepatol. 2013, 19(1):17-25; Pawlotsky JM, Chevaliez S, McHutchison JG. Gastroenterology. 2007, 132(5); 1979-1998). Заражение вирусом начинается с его прикрепления к клетке за счет специфического взаимодействия между молекулами, расположенными на поверхности клетки-мишени, и белками оболочки вируса. Прикрепление HCV к поверхности клетки опосредуется связыванием гликопротеина Е2 с рецептором тетраспанинового семейства CD81, экспрессирующимся на гепатоцитах и В-лимфоцитах, после чего возникает более специфическое взаимодействие с одним или несколькими «входными» рецептороми, среди которых идентифицированы: рецептор липопротеинов низкой плотности, скавенджер-рецептор SR-BI, клаудин-1 и окклю-дин. На следующем этапе вирус входит в клетку, по-видимому, за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза. Плюс-цепь РНК вирусного генома подвергается трансляции в цитоплазме, и образующийся полипептид процессируется на мембране эндоплазматического ретикулума. Там же происходит сборка репликазы и направляемый ею синтез минус-цепи РНК, которая затем используется в качестве матрицы для синтеза молекул плюс-цепи РНК. Плюс-цепь РНК инкапсулируется структурными белками и заключается в оболочку путем почкования в просвет эндоплазматического ретикулума. В конечном итоге, инфекционные вирионы высвобождаются за счет транспорта через комплекс Гольджи.

Вследствие высокой частоты репликации и отсутствия функции редактирования у репликазы вируса, геном HCV характеризуется высокой генетической изменчивостью. HCV подразделяется на шесть основных генотипов, нуклеотидные последовательности которых различаются примерно на 30%; при этом в мире насчитывается более 30 подтипов этого вируса. В США и Европе доминируют подтипы 1а и 1b, в то время как в большинстве азиатских стран часто встречается подтип lb (Doyle JS, Hellard ME, Thompson AJ. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2012, 26(4):413-427; Hara K, Rivera MM, Koh C, Sakiani S, Hoofhagle JH, Heller T. J Clin Microbiol. 2013, 51(5):1485-1489; Bukh J, Miller RH, Purcell RH. Semin Liver Dis. 1995, 15(1):41-63).

Вирус HCV заражает человека главным образом через гепатоциты, однако имеются данные, что HCV способен также инфицировать другие органы и клетки, в особенности, клетки лимфоидных органов. Подобная внепеченочная инфекция может вносить свой вклад в опосредованный иммунной системой патогенез хронического заболевания печени и/или в развитие аутоиммунных заболеваний, в том числе смешанной кри-оглобулинемии и гломерулонефрита (Inokuchi M, Ito Т, Uchikoshi M, Shimozuma Y, Morikawa K, Nozawa H, Shimazaki Т, Hiroishi К, Miyakawa Y, Imawari M. J Med Virol. 2009, 82(12):2064-2072; Morsica G, Tambussi G, Sitia G, Novati R, Lazzarin A, Lopaico L, Mukenge S. Blood. 1999, 94(3): 1138-1139).

Современные методы лечения HCV-инфекции далеко не оптимальны. Интерферон-альфа в комбинации с рибавирином, которые применяются для лечения гепатита С в настоящее время, позволяют получить желаемый ответ на лечение лишь у 50% от леченых больных; при этом значительная часть больных вообще не могут применять эти препараты из-за возникающих у них нежелательных явлений (Wong W, Terrault N. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2005, 3(6):507-520.). При этом ощущается острая потребность в более эффективных средствах для предотвращения рецидива гепатита С у пациентов, которым проведена трансплантация печени (повторная HCV-инфекция у пациентов, которым была проведена трансплантация печени в связи с терминальной печеночной недостаточностью, обусловленной HCV-инфекцией, встречается практически в 100% случаев). Отмечено, что пациенты, перенесшие трансплантацию, переносят лечение интерфероном-альфа в комбинации с рибавирином плохо. Более того, интерферон-альфа может в ряде случаев усугублять реакцию отторжения трансплантата (Escudero A, Rodraguez F, Serra MA, Del Oimo JA, Montes F, Rodrigo JM. J Gastroenterol Hepatol. 2008, 23(6):861-866; Abe H, Aida Y, Ishiguro H, Yoshizawa K, Seki N, Miyazaki T, Itagaki M, Sutoh S, Ika M, Kato K, Shimada N, Tsubota A, Aizawa Y. J Med Virol. 2013, 85(9):1523-1533).

Хотя в последние несколько лет осложнения и смертность, связанные с гепатитом С, удалось значительно снизить за счет применения направленных противовирусных препаратов, в частности ингибиторов протеазы и обратной транскриптазы, разработка новых лекарственных средств против HCV наталкивается на серьезные препятствия, к числу которых относятся способность вируса к хронической персистенции, генетическая диверсификация, возникающая при репликации в хозяйском организме, появление мутантных форм вируса, устойчивых к лекарственным препаратам. Кроме того, надо учитывать, что противовирусные лекарственные препараты могут вызывать негативные побочные эффекты.

В настоящее время многие биотехнологические и фармацевтические компании осуществляют поиск новых методов направленного воздействия на уже известные вирусные мишени, разрабатывают профилактические и/или терапевтические вакцины против HCV, а также усовершенствуют уже имеющиеся методы лечения на основе интерферона. В клинической разработке находятся средства лечения гепатита С, которые должны быть более безопасными и эффективными; некоторые из них представляют собой продукты модификации интерферона-альфа. К числу ингибиторов, находящихся во II фазе клинической разработки, относятся вещества, мишенями которых являются сайт внутреннего связывания рибосом (IRES) HCV, протеаза NS3 и полимераза NS5B. Клиническая разработка одного из возможных ингибиторов протеазы NS3 была остановлена, поскольку он оказывал токсическое действие на сердце млекопитающих, что говорит о возможных проблемах, которые могут встать при разработке лекарственных препаратов этого класса в будущем.

Недавно разработанные ингибиторы NS3-протеазы вируса HCV (те-лапревир и цепревир) позволяют увеличить частоту стойкого вирусологического ответа, однако их можно применять лишь у пациентов, инфицированных HCV генотипа 1; кроме того, у пациентов, получающих эти лекарственные препараты, быстро возникает устойчивость вируса к ним. (Kwo PY, Lawitz EJ, McCone J, SchiffER, Vierling JM, Pound D, Davis MN, Galati JS, Gordon SC, Ravendhran N, Rossaro L, Anderson FH, Jacobson IM, Rubin R, Koury K, Pedicone LD, Brass CA, Chaudhri E, Albrecht JK. Lancet. 2010, 376(9742):705-716; McHutchinson J.G., McHutchison JG, Manns MP, Muir AJ, Terrault NA, Jacobson IM, Afdhal NH, Heathcote EJ, Zeuzem S, Reesink HW, Garg J, Bsharat M, George S, Kauffman RS, Adda N, Di Bisceglie AM. N Engl J Med. 2010, 362 (14):1292-1303).

Для связывания и ингибирования микро РНК печени miR-122, которая необходима для репликации вируса, предлагается использовать фосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид (препарат миравирсен) (Janssen HL, Reesink HW, Lawitz EJ, Zeuzem S, Rodriguez-Torres M, Patel K, van der Meer AJ, Patick AK, Chen A, Zhou Y, Persson R, King BD, Kauppinen S, Levin AA, Hodges MR. N Engi J Med. 2013, 368(18):1685-1694). Недостатком подобных препаратов, направленных на снижение уровня miR-122, является возможность образования и ускоренное развитие злокачественных новообразований (Koberle V, Kronenberger В, Pleli Т, Trojan J, Imelmann E, Peveling-Oberhag J, Welker MW, Elhendawy M, Zeuzem S, Piiper A, Waidmann O. Eur J Cancer. 2013, dot: 10.10167j.ejca.2013.06.002).

Среди появившихся за последние годы новых и более эффективных методов лечения наиболее перспективным является иммунотерапия с использованием терапевтических моноклональных антител, специфичных к белкам HCV (Sautto GA, Diotti RA, Clementi M. New Microbiol. 2012, 35(4):387-397; Haberstroh A, Schnober EK, Zeisel MB, Carolla P, Barth H, Blum HE, Cosset FL, Koutsoudakis G, Bartenschlager R, Union A, Depla E, Owsianka A, Patel AH, Schuster C, Stoll-Keller F, Doffoel M, Dreux M, Bau-mert TF. Gastroenterology. 2008, 135(5):1719-1728). Данные разработки базируются на имеющихся сообщениях, что в организме больных, инфицированных HCV, образуются антитела, направленные против вируса. Эти антитела могут принадлежать к различным классам (подклассам) иммуноглобулинов и обладать различной антигенной специфичностью. Функциональные эффекты таких антител варьируют от простого связывания, не оказывающего влияния на вирус, до реальной нейтрализации и уничтожения вируса или предотвращения его размножения Piazza M, Sagliocca L, Tosone G, Guadagnino V, Stazi MA, Orlando R, Borgia G, Rosa D, Abrignani S, Palumbo F, Manzin A, Clementi M. Arch Intern Med. 1997, 157(14): 1537-1544). При этом элиминации вируса сопутствует быстрое (уже на ранней стадии инфекции) появление нейтрализующих антител широкого спектра действия. Напротив, антитела от пациентов, у которых наблюдается прогрессирование инфекции в хроническую фазу, нейтрализуют вирус лишь в небольшой степени, либо вообще не обладают нейтрализующей способностью (Pestka JM, Zeisel MB, Blaser E, Schurmann P, Bartosch B, Cosset FL, Patel AH, Meisel H, Baumert J, Viazov S, Rispeter K, Blum HE, RoggendorfM, Baumert TF. Proc Nati Acad Sci USA. 2007, 104(14):6025-6030). Можно предположить, что неэффективность антительного ответа против HCV обусловлена общим дисбалансом гуморального иммунного ответа (Di Lorenzo С., Angus A.G., Patel A.H. Vimses. 2011, 3(11):2280-2300).

Терапевтический потенциал антител в значительной степени зависит от их конкретных мишеней - эпитопов белков вируса, с которыми они способны реагировать. Хотя антитела против неструктурных белков HCV зарегистрированы у людей, больных гепатитом С, такого рода антитела обычно не оказывают существенного влияния на вирус. В то же время антитела, направленные против структурных белков, и прежде всего против белков оболочки Е1 и Е2, могут обладать нейтрализующей активностью, блокируя проникновение вируса в клетки или запуская механизмы опосредованной антителами клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-зависимого лизиса (CDL), приводящие к его уничтожению. Исходя из этого, можно ожидать, что одним из перспективных подходов к созданию новых препаратов для лечения гепатита С является получение и испытание человеческих моноклональных антител против консервативных участков структурных вирусных белков на основе природных антител, выработавшихся естественным путем у HCV-инфицированных больных (Clementi N, De Marco D, Mancini N, Solforosi L, Moreno GJ, Gubareva LV, Mishin V, Di Pietro A, Vicenzi E, Siccardi AG, Clementi M, Burioni R. PLoS One. 2011, 6(12):e28001. dot: 10.1371; Solforosi L, Mancini N, Canducci F, Clementi N, Sautto GA, Diotti RA, Clementi M, Burioni R. New Microbiol. 2012, 35(3):289-294). При этом можно ожидать, что моноклональные антитела, действуя непосредственно на вирус, будут снижать его уровень в крови и предотвращать повторную инфекцию новых клеток печени (Burioni R, Perotti M, Mancini N, Clementi M.J. Hepatol. 2008, 49(2):299-300). Кроме того, введение специфических моноклональных антител против HCV или смесей таких антител может восстановить баланс в пользу иммунной системы организма и воспрепятствовать распространению вируса.

В настоящее время известно, что несколько препаратов на основе моноклональных антител против белка Е2 проходят фазы I или II клинических испытаний. В частности, в клинических исследованиях фазы I человеческого моноклонального антитела XTL-002 было показано, что более чем у половины из 15 пациентов с гепатитом С, которым была проведена однократная внутривенная инфузия XTL-002, отмечалось значительное снижение вирусной нагрузки, величина которого составляла от 2 до 100 раз; при этом серьезных побочных эффектов у них отмечено не было (http://www.xtlbio.com/news/news_item.asp-id=26.htm). Два клинических исследования по предотвращению повторной HCV-инфекции у пациентов с хронической инфекцией во время и после трансплантации печени показали умеренное и кратковременное снижение виремии после инфузии человеческого антитела XTL68 против белка Е2 вируса HCV (Galun E, Terrault NA, Eren R, Zauberman A, Nussbaum O, Terkieltaub D, Zohar M, Buchnik R, Ackerman Z, Safadi R, Ashur Y, Misrachi S, Liberman Y, Rivkin L, Dagan S. J.Hepatol. 2007, 46(1):37-44; Schiano TD, Charlton M, Younossi Z, Galun E, Pruett T, Tur-Kaspa R, Eren R, Dagan S, Graham N, Williams PV, Andrews J. Liver Transpl. 2006, 12(9): 1381-1389). Еще одно клиническое исследование по предотвращению повторной инфекции трансплантата печени при помощи моноклональных антител начато в Страсбурге, Франция (Fafi-Kremer S, Fofana I, Soulier E, Carolla P, Meuleman P, Leroux-Roels G, Patel AH, Cosset FL, Pessaux P, Doffoel M, Wolf P, Stoll-Keller F, Baumert TF. J Exp Med. 2010 207(9):2019-2031).

С использованием трансгенных мышей было разработано гуманизированное моноклональное антитело MBL-HCV1, направленное против высококонсервативного линейного эпитопа оболочечного гликопротеина Е2 вируса HCV (аминокислоты 412-423) и способное in vitro нейтрализовать HCV различных генотипов (Broering TJ, Garrity KA, Boatright NK, Sloan SE, Sandor F, Thomas WD Jr, Szabo G, Finberg RW, Ambrosino DM, Babcock GJ. J. Virol. 2009, 83(23): 12473-12482). В исследовании по выбору диапазона доз, которое проводили на шимпанзе, однократная инъекция этого антитела в дозе 250 мг/кг предотвращала острую HCV-инфекцию (Morin TJ, Broering TJ, Leav BA, Blair BM, Rowley KJ, Boucher EN, Wang Y, Cheslock PS, Knauber M, Olsen DB, Ludmerer SW, Szabo G, Finberg RW, Purcell RH, Lan-ford RE, Ambrosino DM, Molrine DC, Babcock GJ. PLoS Pathog. 2012; 8(8):e1002895. doi: 10.1371).

Было предпринято рандомизированное исследование с целью изучения эффекта многократных инъекций MBL-HCV1 на элиминацию HCV у пациентов, перенесших трансплантацию печени. Завершенное в 2009 г. исследование I фазы, в котором участвовал 31 здоровый доброволец, показало, что антитело хорошо переносится и не вызывает серьезных побочных эффектов. Испытуемые, инфицированные вирусом HCV генотипа 1а, в исследовании I фазы получали 11 инфузий антитела в дозе 50 мг/кг/сут (до 14 дней после трансплантации печени). У испытуемых, получавших антитело, снижение вирусной нагрузки относительно исходного значения было заметно сильнее, чем у испытуемых, получавших плацебо. Кроме того, в группе с антителом срок восстановления вирусной нагрузки был значительно больше, чем в группе с плацебо (18,7 дней против 2,4 дней). Вместе с тем, как и в случае монотерапии другими препаратами для лечения HCV-инфекции, у пациентов, получавших антитело, возникали устойчивые варианты вируса. Это может быть обусловлено тем, что эпитоп для данного антитела расположен очень близко к гипервариабельному участку белка Е2 HCV (Chung RT, Gordon FD, Curry MP, Schiano TD, Emre S, Corey K, Markmann JF, Herd M, Pomposelli JJ, Pomfret EA, Florman S, Schilsky M, Broering TJ, Finberg RW, Szabo G, Zamore PD, Khettry U, Babcock GJ, Ambrosino DM, Leav B, Leney M, Smith HL, Molrine DC. American J. of Transpl. 2013, 13(4): 1047-1054).

Компания Crucell, Ltd. разработала программу комбинирования разных антител против вируса гепатита С. В настоящее время ею проводится оценка большой панели полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита С, при этом особое внимание уделяется определенным участкам белка Е2 HCV (http://www.crucell.com/R_and_D-Clinical_Development-HepatitisC).

Человеческие моноклональные антитела против HCV получают, главным образом, на основе технологии рекомбинантных ДНК с использованием библиотек вариабельных доменов легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов или при помощи гибридных клеточных культур, являющихся результатом слияния лимфоцитов крови инфицированного человека и подходящей «партнерской» линии клеток (Karpas A, Dremucheva A, Czepulkowski BH. Proc Nati Acad Sci USA. 2001, 98(4): 1799-1804). Альтернативным подходом может быть «очеловечивание» мышиных моноклональных антител против HCV.

Вместе с тем, проведенный анализ просмотренных литературных источников показал, что имеющиеся разработки не носят универсального характера и в настоящее время не позволяют получать достаточно надежные результаты по диагностике HCV и лечению вызываемого им заболевания.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому эффекту является группа изобретений (US 20120039846, 2012), включающая в себя композиции для профилактики и лечения HCV-инфекции. В состав композиции входит одно или несколько человеческих моноклональных антител, направленных против конформационных эпитопов белка Е2 оболочки вируса гепатита С, а именно моноклональное антитело НС-11, секретируемое линией гибридомных клеток, хранящейся в коллекции АТСС под инвентарным номером РТА-9418, или его фрагмент, включающие CDR1-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность GATFSSFI, CDR2-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность IIPMFGTA, CDR3-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность AMEVPGFCRGGSCSGYMDV, CDR1-участок легкой цепи, содержащий последовательность HSVSSSN, CDR2-участок легкой цепи, содержащий последовательность GAS и CDR3-участок легкой цепи, содержащий последовательность QQYGSSPIT; моноклональное антитело НС-1, секретируемое линией гибридомных клеток, хранящейся в коллекции АТСС под инвентарным номером РТА-9416, или его фрагмент, включающие CDR1-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность GGTYNSEV, CDR2-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность FIPMFGTA, CDR3-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность AKVLQVGGNLVVRPL, CDR1-участок легкой цепи, содержащий последовательность QTISSTH, CDR2-участок легкой цепи, содержащий последовательность GVS и CDR3-участок легкой цепи, содержащий последовательность HQYGNSPQT; моноклональное антитело НС-3, секретируемое линией гибридомных клеток, хранящейся в коллекции АТСС под инвентарным номером РТА-9417, или его фрагмент, включающие CDR1-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность GFSLSTTGVG, CDR2-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность IYWDDDK, CDR3-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность ALNSYRSGTILYRELELRGLFYI, CDR1-участок легкой цепи, содержащий последовательность QSISSW, CDR2-участок легкой цепи, содержащий последовательность ESS и CDR3-участок легкой цепи, содержащий последовательность QQYESSSWT; моноклональное антитело СВН-23, секретируемое линией гибридомных клеток, хранящейся в коллекции АТСС под инвентарным номером РТА-9419, или его фрагмент, включающие CDR1-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность GGTFSSYA, CDR2-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность IVPMFGTE, CDR3-участок тяжелой цепи, содержащий последовательность ARHENIYGTPFDY, CDR1-участок легкой цепи, содержащий последовательность HSITRY, CDR2-участок легкой цепи, содержащий последовательность AAS, и CDR3-участок легкой цепи, содержащий последовательность QQSYSTLLT.

Наряду с антителами в данную группу изобретений входят клеточные линии, их продуцирующие, а также фармацевтические композиции на их основе. Эпитопы перечисленных антител имеют конформационный характер. Авторами показано, что эпитоп для антитела НС-11 включает аминокислоты Gly530 и Asp535 белка Е2, контактирующие с антителом; эпитоп для антитела НС-1 включает контактирующие аминокислоты Trp529, Gly530 и Asp535; эпитоп для антитела НС-3 включает контактирующие аминокислоты Arg657, Asp658, Phe679, Leu692, Ile696, Asp698. (Здесь и далее нумерация аминокислот соответствует последовательности полипротеина вируса гепатита С изолята Н77 геротипа 1a - референсный номер NP_671491.1 в международной базе данных NCBI Protein).

Недостатком данной группы изобретений является то, что предлагаемые композиции не покрывают все эпитопы белка Е2, к которым возможно образование антител, нейтрализующих вирус, в связи с чем можно ожидать их недостаточную эффективность с точки зрения блокирования размножения вируса.

Задачей, решаемой в рамках заявляемой группы изобретений, являлось повышение эффективности нейтрализации вируса гепатита С. При решении данной задачи исходили из того, что к настоящему времени охарактеризован ряд эпитопов белка Е2 для человеческих моноклональных антител, обладающих нейтрализующей HCV активностью, а именно: линейные эпитопы с координатами 412-423 (W02006100449, 2006); 480-494, 613-621 (W02004087760, 2004); конформационные непрерывные эпитопы с координатами 396-424, 412-424, 436-447, 523-540 (US 20110311550, 2011); конформационные прерывистые эпитопы, содержащие аминокислоты Leu641, Thr648, Pro512, Leu580, Pro591, Arg588 (WO 2010035292, 2010), а также указанные выше эпитопы, представленные в изобретении (US 20120039846, 2012). Проведенный анализ показал, что некоторые участки аминокислотной последовательности белка Е2 не содержат описанных эпитопов. В частности, неизвестны антитела с эпитопами на участках 448-479, 494-511, 541-579, 592-612, 622-640. Можно было предполагать, что антитела к таким эпитопам будут обладать новыми свойствами и потенциально могут оказаться более эффективными для профилактики и лечения гепатита С.

Технической задачей являлось расширение круга антител, пригодных для воздействия на вирус гепатита С, путем создания человеческих моно-клональных антител к белку Е2 оболочки вируса, обладающих нейтрализующей активностью и направленных к новым, ранее не описанным эпитопам, и повышение надежности связывания вирусов гепатита С. При этом под термином «эпитоп» в тексте настоящего изобретения понимается та часть полипептидной молекулы белка Е2, которая распознается каким-либо из описываемых моноклональных антител и вступает с ним в непосредственный контакт. Эпитоп может представлять собой непрерывную аминокислотную последовательность, а может быть прерывистым, то есть составленным из ряда аминокислот, далеких друг от друга по порядковому номеру, но близкорасположенных в пространственной структуре белка.

Также различают линейные и конформационные эпитопы. В первом случае распознавание эпитопа антителом определяется только аминокислотной последовательностью эпитопа, во втором случае оно также зависит от конформационной структуры эпитопа в составе белковой молекулы.

Технический результат достигался созданием антител, способных связываться с эпитопами, далее обозначенными как Э1 и/или Э2 и/или Э3, которые включают в себя аминокислотные последовательности вариабельных участков их тяжелых (VH) и легких (VL) цепей:

последовательность участка VH антитела RYB1, SEQ ID NO:5;

последовательность участка VL антитела RYB1, SEQ ID NO:9;

последовательность участка VH антитела RYB2, SEQ ID NO:13;

последовательность участка VL антитела RYB2, SEQ ID NO:17;

последовательность участка VH антитела RYB3, SEQ ID NO:21;

последовательность участка VL антитела RYB3, SEQ ID NO:25.

При этом для ингибирования вируса используется, как правило, композиция, состоящая из трех антител, получивших наименования RYB 1, RYB2 и RYB3, в соотношении (% масс.) RYB1:RYB2:RYB3=20-40:20-40:20-40. Лучшие результаты достигались при соотношении ингредиентов композиции в соотношении 1:1:1. Снижение концентрации одного из ингредиентов до содержания в смеси менее 20% нежелательно в связи с возрастающей вероятностью понижения эффективности воздействия на вирус из-за вариабельности его генотипа, хотя определенный, но менее выраженный эффект достигается при использовании для блокирования размножения вируса в качестве одного из вариантов воздействия вышеупомянутых антител в меньшей концентрации или вообще индивидуально.

Установлено, что эпитопом антитела RYB1, в дальнейшем обозначенным как Э1, является определенная конформация последовательности аминокислот, заключенной в пределах участка HPEATYSRCG (589-598, SEQ ID NO:30) и содержащей аминокислоты Ser595 и Arg596. При этом наиболее значимым является центральный фрагмент этого участка из 6 аминокислот: EATYSR (591-596, SEQ ID NO:31). Данный эпитоп в литературе не описан.

Эпитопом антитела RYB2, в дальнейшем обозначенным как Э2, является определенная конформация последовательности аминокислот, заключенной в пределах участка VCGPVYCF (502-509, SEQ ID NO:32) и содержащей аминокислоту Tyr507. При этом наиболее значимым является центральный фрагмент этого участка из 6 аминокислот: CGPVYC (503-508, SEQ ID NO:33). Данный эпитоп в литературе не описан.

Эпитопом антитела RYB3, в дальнейшем обозначенным как Э3, является определенная конформация последовательности аминокислот, заключенной в пределах участка HPEATYSRCGSGPWITP (589-605, SEQ ID NO:34) и содержащей аминокислоты Ser595, Arg596 и Ser599. При этом наиболее значимым является один из внутренних фрагментов этого участка YSRCGS (594-599, SEQ ID NO:35) или SRCGSG (595-600, SEQ ID NO:36). Данный эпитоп в литературе не описан.

Указанные антитела были получены в результате создания гибридных клеточных линий (гибридом) BIONA-RYB1, BIONA-RYB2 и BIONA-RYB3, продуцирующих вышеуказанные антитела. Заявляемые гибридомы депонированы 17.07.2013 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номерами, соответственно, Н-142, Н-143 и Н-144 и обладают следующими характеристиками.

Штамм BIONA-RYB1 (регистрационный номер Н-142)

Название антитела: RYB1.

Класс/суб. класс антитела: human IgG1 (kappa).

Иммуноген, используемый для получения антитела: вирус гепатита С (естественное инфицирование).

Специфичность антитела: белок Е2 оболочки вируса гепатита С.

Известная перекрестная реакция: все генотипы вируса гепатита С.

Возраст штамма: 12 мес.

Место происхождения: г.Москва, ООО «БионА Фарма», штамм родословной не имеет и ранее не депонировался

Партнеры для гибридизации клеток: мононуклеарные клетки, выделенные из селезенки пациента, умершего от гепатита С, и принадлежащая ООО «БионА Фарма» гибридная (мышь/человек) миеломная клеточная линия BIONA-X.

Культуральные свойства штамма, маркерные признаки: суспензионная культура лимфоцитоподобных клеток, маркеры штамма не определяли.

Рекомендуемые условия для замораживания. Клетки штамма осаждают центрифугированием 15 мин при 200 g, ресуспендируют в сыворотке плода коровы, содержащей 10% диметилсульфоксида, до концентрации 3×10⁶ клеток/мл, разливают в пластиковые ампулы для криоконсервирования (COSTAR-CORNING) объемом 2 мл и помещают в контейнер STRATAGENE для медленного замораживания, предварительно охлажденный до 4°С. Контейнер выдерживают в низкотемпературном холодильнике при -70°С 24 часа, после чего ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Возможно программное замораживание со снижением температуры на 1°С в минуту до -4°С с переносом в жидкий азот. Размораживание быстрое, при 37°С. Содержимое ампулы после размораживания переносят в 10 мл бессывороточной среды DMEM, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл среды для культивирования и переносят в культуральный флакон. Выживаемость клеток, определяемая по включению трипанового синего, составляет более 80%.

Рекомендуемые условия для культивирования. Среда DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и концентрата аминокислот и витаминов для базальной среды Игла. Для выращивания штамма используют стандартные культуральные флаконы. Во флакон площадью 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Культивирование проводят при 37°С в атмосфере 5,6% CO₂. Пассаж 1:5 производят при достижении плотности культуры 1×10⁶ клеток/мл среды путем замены 4 мл клеточной суспензии на 4 мл свежей культуральной среды.

Контаминация: бактерии, грибы и микоплазма в культуре при длительном наблюдении визуально не обнаружены.

Производимый продукт: моноклональное полностью

человеческое антитело RYB1 класса IgG1 (kappa), специфичное к белку Е2 оболочки вируса гепатита С.

Область применения штамма: создание терапевтического средства для лечения гепатита С.

Активность (продуктивность) штамма (с указанием условий культивирования), а также другие производственные показатели: при культивировании в стандартных условиях в течение 3 сут концентрация IgG1 человека в культуральной среде достигает значения 20 мкг/мл.

Способ определения активности штамма с указанием метода: измерение IgG1 человека в культуральной кондиционированной среде методом количественного иммуноферментного анализа (ELISA) при помощи соответствующего набора реагентов (например, ELH-IGG 1-001 Human IgG1 ELISA kit, Raybiotech, США).

Штамм BIONA-RYB2 (регистрационный номер Н-143)

Название антитела: RYB2.

Класс/суб. класс антитела: human IgG1 (kappa).

Иммуноген, используемый для получения антитела: вирус гепатита С (естественное инфицирование).

Специфичность антитела: белок Е2 оболочки вируса гепатита С.

Известная перекрестная реакция: все генотипы вируса гепатита С.

Возраст штамма: 12 мес.

Место происхождения: г. Москва, ООО «БионА Фарма», штамм родословной не имеет и ранее не депонировался.

Партнеры для гибридизации клеток: мононуклеарные клетки, выделенные из селезенки пациента, умершего от гепатита С, и принадлежащая ООО «БионА Фарма» гибридная (мышь/человек) миеломная клеточная линия BIONA-X.

Культуральные свойства штамма, маркерные признаки: суспензионная культура лимфоцитоподобных клеток, маркеры штамма не определяли.

Рекомендуемые условия для замораживания. Клетки штамма осаждают центрифугированием 15 мин при 200 g, ресуспендируют в сыворотке плода коровы, содержащей 10% диметилсульфоксида, до концентрации 3×10⁶ клеток/мл, разливают в пластиковые ампулы для криоконсервирования (COSTAR-CORNING) объемом 2 мл и помещают в контейнер STRATAGENE для медленного замораживания, предварительно охлажденный до 4°С. Контейнер выдерживают в низкотемпературном холодильнике при -70°С 24 часа, после чего ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Возможно программное замораживание со снижением температуры на 1°С в минуту до -4°С с переносом в жидкий азот.Размораживание быстрое, при 37°С. Содержимое ампулы после размораживания переносят в 10 мл бессывороточной среды DMEM, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл среды для культивирования и переносят в культуральный флакон. Выживаемость клеток, определяемая по включению трипанового синего, составляет более 85%.

Рекомендуемые условия для культивирования. Среда DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и концентрата аминокислот и витаминов для базальной среды Игла. Для выращивания штамма используют стандартные культуральные флаконы. Во флакон площадью 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Культивирование проводят при 37°С в атмосфере 5,6% СО₂. Пассаж 1:5 производят при достижении плотности культуры 1×10⁶ клеток/мл среды путем замены 4 мл клеточной суспензии на 4 мл свежей культуральной среды.

Контаминация: бактерии, грибы и микоплазма в культуре при длительном наблюдении визуально не обнаружены.

Производимый продукт: моноклональное полностью человеческое антитело RYB2 класса IgG1 (kappa), специфичное к белку Е2 оболочки вируса гепатита С.

Область применения штамма: создание терапевтического средства для лечения гепатита С.

Активность (продуктивность) штамма (с указанием условий культивирования), а также другие производственные показатели: при культивировании в стандартных условиях в течение 3 сут. концентрация IgG1 человека в культуральной среде достигает значения 25 мкг/мл.

Способ определения активности штамма с указанием метода: измерение IgG1 человека в культуральной кондиционированной среде методом количественного иммуноферментного анализа (ELISA) при помощи соответствующего набора реагентов (например, ELH-IGG1-001 Human IgG1 ELISA kit, Raybiotech, США).

Штамм BIONA-RYB3 (регистрационный номер Н-144)

Название антитела: RYB3.

Класс/суб. класс антитела: human IgG1 (kappa).

Иммуноген, используемый для получения антитела: вирус гепатита С (естественное инфицирование).

Специфичность антитела: белок Е2 оболочки вируса гепатита С.

Известная перекрестная реакция: все генотипы вируса гепатита С.

Возраст штамма: 12 мес.

Место происхождения: г. Москва, ООО «БионА Фарма», штамм родословной не имеет и ранее не депонировался.

Партнеры для гибридизации клеток: мононуклеарные клетки, выделенные из селезенки пациента, умершего от гепатита С, и принадлежащая ООО «БионА Фарма» гибридная (мышь/человек) миеломная клеточная линия BIONA-X.

Культуральные свойства штамма, маркерные признаки: полусуспензионная культура лимфоцитоподобных клеток, маркеры штамма не определяли. Рекомендуемые условия для замораживания. Клетки штамма осаждают центрифугированием 15 мин при 200 g, ресуспендируют в сыворотке плода коровы, содержащей 10% диметилсульфоксида, до концентрации 3×10⁶ клеток/мл, разливают в пластиковые ампулы для криоконсервирования (COSTAR-CORNING) объемом 2 мл и помещают в контейнер STRATAGENE для медленного замораживания, предварительно охлажденный до 4°С. Контейнер выдерживают в низкотемпературном холодильнике при -70°С 24 часа, после чего ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Возможно программное замораживание со снижением температуры на 1°С в минуту до -4°С с переносом в жидкий азот. Размораживание быстрое, при 37°С. Содержимое ампулы после размораживания переносят в 10 мл бессывороточной среды DMEM, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл среды для культивирования и переносят в культуральный флакон. Выживаемость клеток, определяемая по включению трипанового синего, составляет более 70%.

Рекомендуемые условия для культивирования. Среда DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и концентрата аминокислот и витаминов для базальной среды Игла. Для выращивания штамма используют стандартные культуральные флаконы. Во флакон площадью 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Культивирование проводят при 37°С в атмосфере 5,6% СО₂. Пассаж 1:5 производят при достижении плотности культуры 1×10⁶ клеток/мл среды путем переноса среды с плавающими клетками в стерильную пробирку, снятия прикрепленных клеток трипсином, объединения с плавающими клетками и отбора пятой части объединенной клеточной суспензии для нового посева.

Контаминация: бактерии, грибы и микоплазма в культуре при длительном наблюдении визуально не обнаружены.

Производимый продукт: моноклональное полностью человеческое антитело RYB3 класса IgG1 (kappa), специфичное к белку Е2 оболочки вируса гепатита С.

Область применения штамма: создание терапевтического средства для лечения гепатита С.

Активность (продуктивность) штамма (с указанием условий культивирования), а также другие производс