Системы экспрессии белка

Системы экспрессии белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к способам и материалам, и в частности, к последовательностям вирусного происхождения, для повышения экспрессии генов в растениях и других эукариотических клетках, например, гетерологичных генов, которые кодируют представляющие интерес белки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Комовирусы (comoviruses) (CPMV)

Комовирусы представляют собой РНК-вирусы с геномом, состоящим из двух частей. Сегменты РНК-генома комовируса называются RNA-1 и RNA-2. RNA-1 кодирует VPg, белки репликазу и протеазу (Lomonossoff & Shanks, 1983). Репликаза необходима вирусу для репликации генома вируса. RNA-2 комовируса, вируса мозаики коровьего гороха (CPMV, cowpea mosaic virus), кодирует белки 58К и 48К, а также два белка оболочки вируса, L и S.

Инициация трансляции RNA-2 всех комовирусов происходит в двух разных сайтах инициации, расположенных в одной и той же триплетной рамке считывания, что приводит к синтезу двух белков с совпадающими карбоксильными концами. Данное явление двойной инициации возникает вследствие «пропускающего сканирования» ("leaky scanning") рибосомами во время трансляции.

5'-концевые инициирующие кодоны (старт-кодоны) (AUG) в RNA-2 CPMV находятся в положениях 115, 161, 512 и 524. Старт-кодоны в положениях 161 и 512 находятся в одной триплетной рамке считывания. Инициация в старт-кодоне в положении 161 приводит к синтезу полипротеина 105K, а инициация в старт-кодоне в положении 512 обеспечивает синтез полипротеина 95K. Поскольку синтез обоих полипротеинов заканчивается в одном и том же терминирующем кодоне (стоп-кодоне) в положении 3299, белки 105K и 95K являются белками с совпадающими карбокси-концами. Кодон AUG в положении 524 может выступать в качестве инициатора, в случае если AUG в положении 512 делегирован. Однако в присутствии AUG 512 он не выполняет данную функцию, а только кодирует аминокислоту метионин (Holness et al., 1989; Wellink et al., 1993). Старт-кодон в положении 115 не является необходимым для репликации вируса (Wellink et al., 1993). Белки 105K и 95K, кодируемые сегментом генома RNA-2 CPMV, представляют собой основные продукты трансляции, впоследствии расщепляемые в результате кодируемой RNA-1 протеолитической активности с образованием либо белка 58K, либо белка 48K в зависимости от того, какой полипротеин, 105K или 95K, подвергается процессингу, и двух белков оболочки вируса, L и S. Инициация трансляции в старт-кодоне в положении 512 в CPMV более эффективна, чем инициация в положении 161 и приводит к образованию большего количества полипротеина 95K, чем полипротеина 105K.

Старт-кодон в положении 115 в RNA-2 CPMV лежит в 3'-5' направлении («выше», upstream) от сайтов инициации в положениях 161 и 512 и находится в другой рамке считывания. Поскольку данный старт-кодон находится «в фазе» с терминирующим кодоном в положении 175, инициация в данном сайте может привести к образованию пептида, содержащего 20 аминокислот. Однако на сегодняшний день образование указанного пептида не было обнаружено.

Необходимость сохранения рамки между кодонами AUG

Эксперименты с мутагенезом продемонстрировали, что сохранение рамки между сайтами инициации в положениях 161 и 512 в RNA-2 CPMV необходимо для эффективной репликации RNA-2, осуществляемой кодируемой RNA-1 репликазой (Holness et al., 1989; van Bokhoven et al., 1993; Rohll et al., 1993; Wellink et ql., 1993). Данная необходимость ограничивает длину последовательностей, которые могут быть встроены выше инициирующего кодона 512 в векторы экспрессии на основании RNA-2 CPMV (см. ниже), что затрудняет клонирование чужеродных генов в указанные векторы. Например, она препятствует применению полилинкеров, т.к. их использование обычно изменяет открытую рамку считывания (OPC, ORF) между данными сайтами инициации.

Векторы CPMV

CPMV послужил основой для создания векторных систем, подходящих для получения гетерологичных полипептидов в растениях (Liu et al., 2005; Sainsbury et al., 2007). Данные системы основаны на модификации RNA-2, но различаются в зависимости от того, используются ли полноразмерные варианты или варианты, содержащие делеции. Однако в обоих случаях репликацию модифицированной RNA-2 осуществляют путем совместной инокуляции с RNA-1. Системы экспрессии на основе полноразмерного варианта RNA-2 включают слияние чужеродного белка с С-концом полученных из RNA-2 полипротеинов. Высвобождение N-концевого полипептида опосредуется действием каталитической пептидной последовательности 2А из вируса ящура (Gopinath et al., 2000). Полученные молекулы RNA-2 способны распространяться как внутри растения, так и между растениями. Данная стратегия была использована для экспрессии ряда рекомбинантных белков, таких как коровий антиген вируса гепатита В (HBcAg) и малые иммунные белки (SIP), в растениях коровьего гороха (Mechtcheriakova et al., 2006; Monger et al., 2006; Alamillo et al., 2006). Несмотря на успешный результат, использование полноразмерного вирусного вектора обладает недостатками, связанными с ограничениями по размеру встраиваемых последовательностей и вопросами биобезопасности.

Для решения указанных проблем недавно была разработана система, основанная на содержащем делеции варианте RNA-2 CPMV (Canizares et al., 2006). В данной системе удалена область RNA-2, кодирующая двигательный белок и оба белка оболочки. Однако молекулы, содержащие делеции, сохраняют цис-действующие последовательности, необходимые для репликации, осуществляемой кодируемой RNA-1 репликазой, что обеспечивает поддержание высоких уровней амплификации гена при отсутствии сопутствующей вероятности заражения окружающей среды модифицированным вирусом. В случае включения в инокулят в дополнение к RNA-1 супрессора сайленсинга генов, такого как HcPro из вируса картофеля Y (PVY, Brigneti et al., 1998), вектор CPMV, содержащий делеции, может быть использован в качестве системы временной (транзиентной) экспрессии (WO/2007/135480 Bipartite System, Method And Composition For The Constitutive And Inducible Expression Of High Levels Of Foreign Proteins In Plants; также Sainsbury et al., 2009). Однако в отличие от ситуации с вектором на основе полноразмерной RNA-2, репликация ограничена инокулированными листьями. Описанные векторы CPMV используют для экспрессии многоцепочечных комплексов, состоящих из одного вида полипептида.

Также было показано, что множественные копии векторов на основе полноразмерных или содержащих делеции вариантов RNA-2 CPMV подходят для получения гетеромерных белков в растениях (Sainsbury et al., 2008). Путем совместной инфильтрации двух полноразмерных конструкций РНК-2, содержащих разные маркерные гены, в Nicotiana benthamiana в присутствии RNA-1 было показано, что два чужеродных белка могут быть эффективно экспрессированы в пределах одной клетки в инокулированной ткани. Кроме того, указанные белки могут быть одновременно локализованы в одних и тех же субклеточных компартментах, что является обязательным условием для образования гетеромеров.

Также была исследована пригодность различных векторов RNA-2 CPMV для экспрессии гетеромерных белков в растениях. Встраивание тяжелых и легких цепей IgG в полноразмерные и содержащие делеции варианты RNA-2 показало, что оба подхода приводили к накоплению полноразмерных молекул IgG в инокулированной ткани, но уровни были значительно выше при использовании содержащих делеции векторов RNA-2. Соответственно, способность полноразмерных конструкций RNA-2 к системному распространению, по-видимому, не характерна для получения гетеромерных белков, и использование содержащих делеции вариантов RNA-2 очевидно является предпочтительным, в частности, поскольку они также обладают преимуществами с точки зрения биобезопасности.

Таким образом, известные основанные на CPMV векторные системы представляют собой подходящие инструменты для экспрессии гетерологичного гена, который кодирует представляющий интерес белок в растениях. Однако в данной области техники по-прежнему существует необходимость в разработке оптимизированных векторных систем, которые улучшают, например, выход экспрессированных гетерологичных белков и удобство применения указанного вектора.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что мутация старт-кодона в положении 161 в векторе RNA-2 CPMV существенно повышает уровни экспрессии белка, кодируемого геном, встроенным после старт-кодона в положении 512. Указанные уровни экспрессии белка повышались примерно в 20-30 раз по сравнению с экспрессией этого же белка из вектора RNA-2 CPMV, отличающегося только тем, что старт-кодон в положении 161 был интактным (Sainsbury and Lomonossoff, 2008). Настоящее изобретение позволяет получать высокие уровни чужеродных белков при отсутствии необходимости репликации вируса.

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что мутация старт-кодона в положении 161 устраняет необходимость сохранения рамки между положением мутированного старт-кодона в положении 161 и старт-кодоном в положении 512, что позволяет встраивать последовательности любой длины после мутированного старт-кодона в положении 161. Это обеспечивает особенные преимущества, поскольку позволяет встраивать полилинкеры любой длины в векторы RNA-2 после мутированного старт-кодона, которые затем могут быть использованы для облегчения клонирования представляющего интерес гена в вектор.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что несмотря на увеличение экспрессии белка, растения, трансформированные вектором RNA-2 CPMV, содержащим мутированный старт-кодон в положении 161, выглядели более здоровыми, т.е. демонстрировали менее значительный некроз по сравнению с растениями, трансформированными известными векторами RNA-2 CPMV. Здоровье растений представляет собой фактор, имеющий большое значение в экспрессии белков из растений, поскольку здоровые растения живут в течение более длительных периодов времени. Кроме того, здоровье растений также имеет большое значение в очистке белков из растений, поскольку таннины, вырабатываемые вследствие некроза, могут затруднять очистку белка (Sainsbury and Lomonossoff, 2008).

Соответственно, настоящее изобретение относится к улучшенным системам получения белка и к способам, основанным на модифицированных последовательностях двухкомпонентного вируса.

Таким образом, в соответствии с различными аспектами настоящего изобретения предложена или использована последовательность энхансера экспрессии, являющаяся производной (или обладающая гомологией с) сегмента генома RNA-2 двухкомпонентного РНК-вируса, такого как комовирус, в которой целевой сайт инициации был подвергнут мутации.

Согласно настоящему изобретению также предложены способы повышения экспрессии или активности повышения трансляции последовательности, полученной из сегмента генома RNA-2 двухкомпонентного вируса, включающие осуществление мутации расположенного в указанной последовательности целевого сайта инициации.

Некоторые конкретные определения и варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны более подробно.

В настоящем описании последовательности энхансера экспрессии («энхансерные» последовательности или энхансерные элементы) представляют собой последовательности, являющиеся производными (или обладающие гомологией с) сегмента генома RNA-2 двухкомпонентного РНК-вируса, такого как комовирус, в которых целевой сайт инициации был подвергнут мутации. Указанные последовательности могут усиливать экспрессию в прямом направлении (downstream) гетерологичной ОРС, к которой они присоединены. Без ограничения, считают, что указанные последовательности в случае их присутствия в транскрибируемой РНК могут усиливать трансляцию гетерологичной ОРС, к которой они присоединены.

В настоящем описании «целевой сайт инициации» представляет собой сайт инициации (старт-кодон) в сегменте RNA-2 генома двухкомпонентного вируса дикого типа (например, комовируса), из которого получают рассматриваемую последовательность энхансера, при этом указанный сайт инициации выступает в качестве сайта инициации для получения (трансляции) более длинного из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом генома RNA-2 дикого типа.

Как описано выше, образование более длинного из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых RNA-2 CPMV, белка 105K, инициируется в сайте инициации в положении 161 в сегменте генома RNA-2 CPMV дикого типа. Таким образом, целевой сайт инициации в последовательностях энхансеров, полученных из сегмента генома RNA-2 CPMV, представляет собой сайт инициации в положении 161 в RNA-2 CPMV дикого типа.

Мутации вокруг старт-кодона в положении 161 могут оказывать тот же (или близкий) эффект, что и мутация самого старт-кодона в положении 161, например нарушение окружения данного старт-кодона может означать, что указанный старт-кодон «пропускается» чаще.

Соответственно, согласно одному из аспектов настоящего изобретения целевой сайт инициации может быть опосредованно «подвергнут мутации» путем осуществления мутации одного или более нуклеотидов, расположенных выше и/или ниже указанного целевого сайта инициации, но с сохранением целевого сайта инициации дикого типа, при этом эффект мутации данных нуклеотидов совпадает с или близок эффекту, наблюдаемому при мутировании самого целевого сайта инициации.

Поскольку целевые сайты инициации выступают в качестве сайта инициации для получения более длинного из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом генома RNA-2 дикого типа, следовательно, указанные целевые сайты инициации находятся в рамке (в фазе) со вторым сайтом инициации в том же сегменте генома RNA-2 дикого типа, который служит сайтом инициации для получения более короткого из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых RNA-2 дикого типа. Два сайта инициации находятся в рамке в том случае, если они находятся в одной и той же триплетной рамке считывания.

Целевой сайт инициации в последовательностях энхансеров, полученных из сегмента генома RNA-2 CPMV дикого типа, т.е. сайт инициации в положении 161, находится в рамке с сайтом инициации в положении 512, выполняющим функцию сайта инициации для получения более короткого из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых RNA-2 CPMV (белок 95K) в сегменте генома RNA-2 CPMV дикого типа.

Таким образом, целевой сайт инициации расположен выше (5') второго сайта инициации в сегменте генома RNA-2 дикого типа, из которого получают последовательность энхансера, выполняющую функцию сайта инициации для получения более короткого из двух полипротеинов с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом генома RNA-2 дикого типа. Кроме того, целевой сайт инициации также может быть расположен ниже (3') третьего сайта инициации в геноме RNA-2 дикого типа, из которого получают последовательность энхансера. В CPMV указанный целевой сайт инициации, т.е. сайт инициации в положении 161, расположен выше второго сайта инициации в положении 512, выполняющего функцию сайта инициации для получения белка 95К, и ниже третьего сайта инициации в положении 115.

Соответственно, целевой сайт инициации в последовательности энхансера, полученной из сегмента генома RNA-2 двухкомпонентного вируса, представляет собой первый из двух сайтов инициации для получения двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых RNA-2 дикого типа. Термин «первый» в данном контексте относится к сайту инициации, расположенному ближе к 5'-концу сегмента генома RNA-2 дикого типа.

Если это желательно, мутации может быть подвергнуто несколько сайтов инициации в последовательности. Например, «третий» сайт инициации в положении 115 (или соответствующий положению 115) также может быть удален или изменен. Было показано, что удаление AUG 115 в дополнение к удалению AUG 161 дополнительно усиливает экспрессию (Sainsbury and Lomonossoff, 2008).

Последовательности энхансеров согласно настоящему изобретению основаны на модифицированных последовательностях из сегментов генома RNA-2 двухкомпонентных РНК-вирусов.

В настоящем описании двухкомпонентный вирус или вирус с геномом, состоящим из двух частей, может являться членом семейства Comoviridae. Все виды семейства Comoviridae, видимо, кодируют белки с совпадающими карбокси-концами. Виды семейства Comoviridae включают Комовирусы (Comovirus), Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus и Sadwavirus. Комовирусы включают Cowpea mosaic virus (CPMV, вирус мозаики коровьего гороха), Cowpea severe mosaic virus (CPSMV, вирус тяжелой мозаики коровьего гороха). Squash mosaic virus (SqMV, вирус мозаики тыквы), Red clover mottle virus (RCMV, вирус крапчатости красного клевера). Bean pod mottle virus (BPMV, вирус пятнистости стручков бобовых). Предпочтительно двухкомпонентный вирус (или комовирус) представляет собой CPMV.

Последовательности сегментов генома RNA-2 данных комовирусов и некоторых конкретных штаммов доступны из базы данных NCBI (Национального Центра Биотехнологической Информации) под входящими номерами, указанными в скобках: RNA-2 вируса мозаики коровьего гороха (NC_003550), RNA-2 вируса тяжелой мозаики коровьего гороха (NC_003544), RNA-2 вируса мозаики тыквы (NC_003800), RNA-2 штамма Kimble вируса мозаики тыквы (AF059533), RNA-2 штамма Arizona вируса мозаики тыквы (AF059532), RNA-2 вируса крапчатости красного клевера (NC_003738), RNA-2 вируса пятнистости стручков бобовых (NC_003495), RNA-2 штамма K-Hopkins1 вируса пятнистости стручков бобовых (AF394609), RNA-2 штамма K-Hancock1 вируса пятнистости стручков бобовых (AF394607), андийского вируса крапчатости картофеля (APMoV: L16239) и вируса мозаики редиса (RaMV; АВ295644). Существуют также частичные последовательности RNA-2, полученные из bean rugose mosaic virus (вирус крапчатой мозаики бобовых) (BRMV; AF263548) и предполагаемого члена вида Комовируса, turnip ringspot virus (вирус кольцевой пятнистости репы) (EF 191015). Также доступны многочисленные последовательности из других видов семейства Comoviridae.

На сегодняшний день у всех исследованных комовирусов обнаружили наличие двух альтернативных старт-кодонов для экспрессии полипротеинов с совпадающими карбокси-концами из сегментов генома РНК. В частности, известно, что сегменты RNA-2 генома CPMV, CPSMV, BPMV, SqMV и RCMV содержат два альтернативных инициирующих кодона для экспрессии полипротеинов с совпадающими карбокси-концами.

Соответственно, целевые сайты инициации в других комовирусах, эквивалентные сайту инициации в положении 161 в сегменте RNA-2 дикого типа CPMV (т.е. соответствуют ему), могут быть идентифицированы способами, известными в данной области техники. Например, целевые сайты инициации могут быть идентифицированы путем совмещения последовательностей между последовательностью сегмента генома RNA-2 дикого типа CPMV и последовательностью сегмента генома RNA-2 другого комовируса. Указанные совмещения последовательностей могут быть использованы для идентификации целевого сайта инициации в последовательности сегмента RNA-2 генома комовируса путем идентификации сайта инициации, который по меньшей мере при совмещении расположен рядом или в том же положении, что и целевой сайт инициации в положении 161 в RNA-2 CPMV дикого типа.

Целевые сайты инициации в других комовирусах также могут быть идентифицированы путем определения старт-кодона, выполняющего функцию сайта инициации для синтеза более длинного из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом RNA-2 генома комовируса дикого типа. Данный подход также может быть использован в комбинации с совмещением, как описано выше, т.е. данный подход может быть использован для подтверждения того, что сайт инициации комовируса, идентифицированный посредством совмещения с RNA-2 CPMV, представляет собой целевой сайт инициации.

Конечно, указанные выше способы также могут быть использованы для идентификации сайтов инициации в сегментах RNA-2 геномов других комовирусов, эквивалентных сайту инициации в положении 512 в сегменте RNA-2 генома CPMV дикого типа. Однако вместо идентификации старт-кодона, выполняющего функцию сайта инициации для синтеза более длинного из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом RNA-2 генома комовируса дикого типа, идентифицируют старт-кодон, выполняющий функцию сайта инициации для синтеза более короткого из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом генома RNA-2 комовируса дикого типа.

После идентификации двух сайтов инициации RNA-2 комовируса, вероятно эквивалентных сайтам инициации в положениях 161 и 512 в RNA-2 CPMV, идентификация целевого сайта инициации может быть подтверждена путем проверки того, что указанные два сайта инициации расположены в одной и той же рамке, т.е. в одной и той же триплетной рамке считывания, т.к. только в этом случае они могут выполнять функцию сайтов инициации для получения двух белков с совпадающими карбокси-концами.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность энхансера содержит нуклеотиды 1-512 сегмента генома RNA-2 CPMV (см. Таблицу 1), в которой целевой сайт инициации в положении 161 был подвергнут мутации. В другом варианте реализации настоящего изобретения последовательность энхансера содержит эквивалентную последовательность другого комовируса, в которой целевой сайт инициации, эквивалентный старт-кодону в положении 161 CPMV, был подвергнут мутации. Целевой сайт инициации может быть подвергнут мутации путем замены, делеции или встраивания. Предпочтительно, целевой сайт инициации подвергают мутации путем точечной мутации.

В альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения последовательность энхансера содержит нуклеотиды 10-512, 20-512, 30-512, 40-512, 50-512, 100-512, 150-512, 1-514, 10-514, 20-514, 30-514, 40-514, 50-514, 100-514, 150-514, 1-511, 10-511, 20-511, 30-511, 40-511, 50-511, 100-511, 150-511, 1-509, 10-509, 20-509, 30-509, 40-509, 50-509, 100-509, 150-509, 1-507, 10-507, 20-507, 30-507, 40-507, 50-507, 100-507 или 150-507 последовательности сегмента RNA-2 генома комовируса, содержащей мутированный целевой сайт инициации. В других вариантах реализации настоящего изобретения последовательность энхансера содержит нуклеотиды 10-512, 20-512, 30-512, 40-512, 50-512, 100-512, 150-512, 1-514, 10-514, 20-514, 30-514, 40-514, 50-514, 100-514, 150-514, 1-511, 10-511, 20-511, 30-511, 40-511, 50-511, 100-511, 150-511, 1-509, 10-509, 20-509, 30-509, 40-509, 50-509, 100-509, 150-509, 1-507, 10-507, 20-507, 30-507, 40-507, 50-507, 100-507 или 150-507 последовательности сегмента RNA-2 генома CPMV, приведенной в Таблице 1, в которой целевой сайт инициации в положении 161 в сегменте RNA-2 генома CPMV дикого типа был подвергнут мутации.

В других вариантах реализации настоящего изобретения последовательность энхансера содержит нуклеотиды 1-500, 1-490, 1-480, 1-470, 1-460, 1-450, 1-400, 1-350, 1-300, 1-250, 1-200 или 1-100 последовательности сегмента RNA-2 генома комовируса, содержащего мутированный целевой сайт инициации.

В альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения последовательность энхансера содержит нуклеотиды 1-500, 1-490, 1-480, 1-470, 1-460, 1-450, 1-400, 1-350, 1-300, 1-250, 1-200 или 1-100 последовательности сегмента RNA-2 генома CPMV, приведенной в Таблице 1, в которой целевой сайт инициации в положении 161 в сегменте RNA-2 генома CPMV дикого типа был подвергнут мутации.

Последовательности энхансеров, содержащие по меньшей мере 100 или 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 460, по меньшей мере 470, по меньшей мере 480, по меньшей мере 490 или по меньшей мере 500 нуклеотидов последовательности сегмента RNA-2 генома комовируса с мутированным целевым сайтом инициации, также представляют собой варианты реализации настоящего изобретения.

Кроме того, последовательности энхансеров, содержащие по меньшей мере 100 или 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 460, по меньшей мере 470, по меньшей мере 480, по меньшей мере 490 или по меньшей мере 500 нуклеотидов последовательности сегмента генома RNA-2 CPMV, приведенной в Таблице 1, в которых целевой сайт инициации в положении 161 в сегменте RNA-2 генома CPMV дикого типа был подвергнут мутации, также представляют собой варианты реализации настоящего изобретения.

Альтернативные варианты реализации настоящего изобретения представляют собой последовательности энхансеров, обладающие по меньшей мере 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% или 50% идентичностью с последовательностью сегмента RNA-2 генома CPMV, представленной в Таблице 1, в которых целевой сайт инициации в положении 161 в сегменте RNA-2 генома CPMV дикого типа был подвергнут мутации.

Термины «процентное сходство», «процентная идентичность» и «процентная гомология» применительно к конкретной последовательности используются, как указано в программе GCG Университета Висконсина. Таким образом, последовательности энхансеров могут специфично гибридизоваться с комплементарной последовательностью последовательности сегмента RNA-2 генома CPMV, приведенной в Таблице 1, при условии, что целевой сайт инициации, соответствующий положению 161 в сегменте RNA-2 генома CPMV дикого типа, был подвергнут мутации.

Термин «специфично гибридизоваться» относится к ассоциации двух одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты, имеющих последовательность, достаточно комплементарную для обеспечения указанной гибридизации в заранее определенных условиях, как правило используемых в данной области техники (иногда называемая «по существу комплементарной»). В частности, указанный термин относится к гибридизации олигонуклеотида с по существу комплементарной последовательностью, содержащейся в молекуле одноцепочечной ДНК или РНК согласно настоящему изобретению, за исключением гибридизации олигонуклеотида с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами некомплементарной последовательности. Термин «комплементарный» относится к естественной ассоциации последовательностей нуклеиновых кислот путем спаривания оснований (A-G-T спаривается с комплементарной последовательностью Т-С-А). Комплементарность двух одноцепочечных молекул может быть частичной в случае, если только некоторые из пар нуклеиновых кислот комплементарны; или полной в случае, если все пары оснований комплементарны. Степень комплементарности влияет на эффективность и силу реакций гибридизации и амплификации.

Целевой сайт инициации в последовательности энхансера согласно настоящему изобретению может быть подвергнут мутации путем делеции, встраивания или замены, в результате чего он не сможет функционировать в качестве сайта инициации трансляции. Например, может быть осуществлена точечная мутация в положении целевого сайта инициации в последовательности энхансера. В качестве альтернативы, целевой сайт инициации в последовательности энхансера может быть удален либо частично, либо полностью. Например, может быть осуществлена делеция, «охватывающая» целевой сайт инициации в последовательности энхансера. Делеции, «охватывающие» сайт инициации, могут иметь длину до (включительно) 5, до 10, до 15, до 20, до 25, до 30, до 35, до 40, до 45, или до 50 нуклеотидов по сравнению с последовательностью сегмента генома RNA-2 дикого типа, из которого получена последовательность энхансера.

Без конкретного теоретического обоснования считают, что мутация старт-кодона в положении 161 в CPMV приводит к инактивации супрессора трансляции, следствием которой является усиленная инициация трансляции со старт-кодонов, расположенных ниже инактивированного супрессора трансляции.

Таким образом, согласно настоящему изобретению также предложена последовательность энхансера, полученная из сегмента RNA-2 генома двухкомпонентного вируса, при этом указанная последовательность энхансера содержит инактивированную последовательность супрессора трансляции.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ повышения экспрессии или активности повышения трансляции последовательности, полученной из сегмента RNA-2 генома двухкомпонентного вируса, включающий инактивацию расположенной в ней последовательности супрессора трансляции.

Как уже указывалось выше, считают, что мутация сайта инициации в положении 161 в сегменте RNA-2 генома CPMV приводит к инактивации супрессора трансляции, обычно присутствующего в RNA-2 CPMV.

В настоящем описании последовательность супрессора трансляции представляет собой последовательность в сегменте RNA-2 дикого типа генома двухкомпонентного вируса (например, комовируса), из которого получают рассматриваемую последовательность энхансера, содержащую или состоящую из сайта инициации для образования (трансляции) более длинного из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом генома RNA-2 дикого типа.

Последовательности супрессора трансляции в последовательностях энхансеров, полученных из сегмента RNA-2 генома CPMV, представляют собой последовательности, содержащие или состоящие из целевого сайта инициации, описанного выше. Таким образом, последовательности супрессора трансляции содержат или состоят из целевого сайта инициации, как определено выше, и могут быть инактивированы путем мутагенеза, как описано выше.

Вышеопределенные последовательности энхансеров могут быть использованы в различных аспектах и вариантах реализации настоящего изобретения следующим образом.

Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложена или применена выделенная нуклеиновая кислота, состоящая или по существу состоящая из последовательности энхансера экспрессии, как описано выше.

В настоящем описании термин «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относится к любой молекуле ДНК или РНК, либо одно-, либо двухцепочечной, и в случае одноцепочечной - к молекуле комплементарной ей последовательности либо в линейной, либо в кольцевой форме. В рассматриваемых молекулах нуклеиновых кислот последовательность или структура молекулы конкретной нуклеиновой кислоты может быть описана в настоящей заявке согласно стандартному представлению последовательности в направлении 5'-3'. В отношении нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению иногда используют термин «выделенная нуклеиновая кислота». Применительно к ДНК данный термин относится к молекуле ДНК, отделенной от последовательностей, с которыми она непосредственно контактирует во встречающемся в природе геноме организма, из которого она происходит.

Например, термин «выделенная нуклеиновая кислота» может включать молекулу ДНК, встроенную в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор, или интегрированную в геномную ДНК прокариотической или эукариотической клетки, или организма-хозяина.

Применительно к РНК термин «выделенная нуклеиновая кислота» относится в первую очередь к молекуле РНК, кодируемой выделенной молекулой ДНК, как определено выше. В качестве альтернативы, указанный термин может относиться к молекуле РНК, которая была в достаточной степени отделена от других нуклеиновых кислот, с которыми она связана в естественном состоянии (т.е. в клетках или тканях). Термин «выделенная нуклеиновая кислота» (либо ДНК, либо РНК) может также означать молекулу, полученную непосредственно биологическими или синтетическими способами и отделенную от других компонентов, присутствующих во время ее образования.

Таким образом, нуклеиновая кислота может состоять или по существу состоять из части или фрагмента сегмента генома RNA-2 двухкомпонентного РНК-вируса, из которого получают энхансер. Например, в одном из вариантов реализации нуклеиновая кислота не содержит по меньшей мере части кодирующей области сегмента генома RNA-2, из которого она получена. Кодирующая область может представлять собой область сегмента генома RNA-2, кодирующую более короткий из двух белков с совпадающими карбокси-концами. Нуклеиновая кислота может состоять или по существу состоять из части сегмента генома RNA-2 двухкомпонентного РНК-вируса, продолжающейся от 5'-конца сегмента генома RNA-2 дикого типа до сайта инициации, в котором происходит инициация образования (трансляции) более короткого из двух белков с совпадающими карбокси-концами, кодируемых сегментом генома RNA-2 дикого типа.

Термин «по существу состоящий из» применительно к конкретному нуклеотиду или аминокислоте означает последовательность, обладающую свойствами данной SEQ ID NO. Например, применительно к аминокислотной последовательности указанный термин включает последовательность per se и молекулярные модификации, которые не влияют на основные и новые характеристики данной последовательности. Например, применительно к нуклеиновой кислоте указанный термин включает последовательность per se и незначительные изменения и/или присоединенные участки, которые не повлияют на энхансерную функцию данной последовательности или придадут дополнительную функциональность.

Настоящее изобретение также относится к системам экспрессии генов, содержащим последовательность энхансера согласно настоящему изобретению.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена система экспрессии генов, содержащая последовательность энхансера, как описано выше.

Система экспрессии генов может также содержать ген, который кодирует представляющий интерес белок, встроенный ниже последовательности энхансера. Встроенные последовательности, которые кодируют представляющий интерес белок, могут быть любого размера.

Соответственно, согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена система экспрессии генов, содержащая:

(а) последовательность энхансера, описанную выше; и (b) ген, который кодирует представляющий интерес белок, при этом указанный ген расположен ниже последовательности энхансера.

Указанные ген и представляющий интерес белок могут быть гетерологичными, т.е. не кодируемыми двухкомпонентным РНК-вирусом дикого типа, из которого получают последовательность энхансера.

Системы экспрессии генов могут быть использованы для экспрессии представляющего интерес белка в организме-хозяине. В данном случае представляющий интерес белок также может быть гетерологичным по отношению к рассматриваемому организму-хозяину, т.е. может быть введен в рассматриваемые клетки (например, растения или его предшественника) с использованием методов генной инженерии, т.е. с участием человека. Гетерологичный ген в организме может заменять эквивалентный эндогенный ген, т.е. ген, который обычно выполняет ту же или схожую функцию, или встроенная последовательность может являться дополнительной к указанному эндогенному гену или другой последовательности.

Для специалистов в данной области техники очевидно, что для экспрессии представляющего интерес гена необходимо наличие сайта инициации (AUG), расположенного выше экспрессируемого гена. Указанные сайты инициации могут быть представлены либо в виде части последовательности энхансера, либо в виде части гена, который кодирует представляющий интерес белок.

Организм-хозяин может представлять собой растение. Однако поскольку механизмы трансляции у эукариот очень консервативны, системы экспрессии генов могут также быть использованы для экспрессии представляющего интерес белка в эукариотических организмах-хозяевах, отличных от растений, например, в клетках насекомых, в виде модифицированных бакуловирусных векторов, или в клетках дрожжей или млекопитающих.

Системы экспрессии генов могут быть функционально связаны с последовательностями промоторов и терминаторов.

Таким образом, системы экспрессии генов могут дополнительно содержать последовательность терминатора и ген, который кодирует представляющий интерес белок, может быть расположен между последовательность энхансера и последовательностью терминатора, т.е. ниже (3') последовательности энхансера и выше (5') последовательности терминатора.

Таким образом, согласно настоящему изобретению также предложена кассета экспрессии, содержащая:

(i) промотор, функционально связанный с

(ii) последовательность энхансера, описанную выше,

(iii) представляющий интерес ген, который необходимо экспрессировать

(iv) последовательность терминатора.

В предпочтительном варианте промотор, используемый для управления представляющим интерес геном, является сильным промотором. Примеры сильных промоторов для использования в растениях включают:

(1) p35S: Odell et al., 1985;

(2) промотор вируса мозаики маниоки (Cassava Vein Mosaic Virus), pCAS, Verdaguer et al., 1996;

(3) промотор малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы, pRbcS: Outchkourov et al., 2003.

Другие сильные промоторы включают pUbi (для однодольных и двудольных растений) и pActin.

В предпочтительном варианте реализации промотор представляет собой индуцибельный промотор.

Термин «индуцибельный» применительно к промотору хорошо понятен специалистам в данной области техники. По существу, экспрессия под контролем индуцируемого промотора «включается» или усиливается в ответ на прилагаемый стимул. Природа указанного стимула для различных промоторов различна. Некоторые индуцибельные промоторы могут обеспечивать незначительные или недетекти