Набор для предварительного придания направленности действия, способ и средства, применяемые в нем

Набор для предварительного придания направленности действия, способ и средства, применяемые в нем

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к способу предварительного придания направленности действия для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, где применяют абиотические реакционноспособные химические группы, которые проявляют биоортогональную реакционную способность по отношению друг к другу. Изобретение также относится к набору для предварительного придания направленности действия, содержащему по меньшей мере один предварительно направляющий зонд и по меньшей мере один эффекторный зонд, где предварительно направляющий зонд содержит первичный направляющий фрагмент и первую биоортогональную реакционноспособную группу и где эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, такой как метка или фармацевтически активное соединение, и вторую биоортогональную реакционноспособную группу. Изобретение также относится к предварительно направляющим средствам, применяемым в упомянутых выше способе и наборе. Изобретение конкретно имеет отношение к ядерной визуализации и лучевой терапии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во многих областях медицинской диагностики и терапии желательным является селективно доставлять агент, такой как терапевтическое средство (лекарственное средство) или диагностическое (например, для визуализации) средство, к конкретному участку или ограниченной области в организме субъекта, такого как пациент.

Активная направленность действия на орган или ткань достигается посредством прямого или опосредованного сочетания желательных активных фрагментов (например, средства, усиливающего контрастность, или цитотоксического соединения) в конструкцию для придания направленности действия, которая связывается с клеточными поверхностями или инициирует клеточный захват на целевом участке, представляющем интерес. Направляющие фрагменты, применяемые для придания направленности действия таким агентам, обычно представляют собой конструкции, которые имеют сродство к мишеням на поверхности клеток (например, мембранным рецепторам), структурным белкам (например, амилоидным бляшкам) или внутриклеточным мишеням (например, РНК, ДНК, ферменты, клеточные сигнальные пути). Эти фрагменты могут представлять собой антитела (фрагменты), белки, аптамеры, олигопептиды, олигонуклеотиды, олигосахариды, а также пептиды, пептоиды и органические лекарственные соединения, которые, как известно, накапливаются при конкретном заболевании или дисфункции. Альтернативно, контрастное/терапевтическое средство может быть направлено на метаболический путь, который регулируется с повышением во время заболевания (такого как инфекция или рак), такой как синтез ДНК, белка и мембранный синтез, и поглощение углеводов. В пораженных болезнью тканях упомянутые выше маркеры могут различать клетки, пораженные заболеванием, от здоровой ткани и предполагать уникальные возможности для раннего обнаружения, специфической диагностики и (направленной) терапии.

Важным критерием для успешного действия средств молекулярной визуализации/терапии в целом и средств ядерной визуализации/терапии в частности является то, что они проявляют высокую степень захвата мишенью, в то же время показывая быстрое выведение (через почечную и/или гепатобилиарную системы) из ткани, не являющейся мишенью, и из крови. Однако это часто является проблематичным: например, визуализационные исследования у людей показали, что максимальная концентрация меченного радиоактивным изотопом антитела на участке опухоли является достижимой в пределах 24 ч, но требуется более нескольких дней перед тем, как концентрация меченого антитела в кровообращении снижается до уровней, достаточно низких для проведения успешной визуализации.

Эти проблемы (особенно в случаях ядерной визуализации и терапии) с медленным или недостаточным накоплением в целевой ткани и медленным выведением из нецелевых областей привели к применению подходов, связанных с предварительным приданием направленности действия.

Предварительное придание направленности действия относится к стадии в способе предварительного придания направленности действия, где первичная мишень (например, поверхность клетки) обеспечивается предварительно направляющим зондом. Последний содержит вторичную мишень, которая постепенно будет подвергаться направленному действию со стороны дополнительного зонда (эффекторный зонд), снабженного вторичным направляющим фрагментом.

Таким образом, при предварительном придании направленности действия, предварительно направляющий зонд связывается с первичной мишенью. Предварительно направляющий зонд также несет вторичные мишени, которые облегчают специфическое сочетание с диагностическим (визуализационным) и/или терапевтическим средством, эффекторным зондом. После того как конструкция, образующая предварительно направляющий зонд, локализована на целевом участке (что требует времени, например, равного 24 ч), может применяться средство выведения для удаления избытка из крови, если природное выведение не является достаточным. На второй стадии инкубации (предпочтительно занимающей более короткое время, например, 1-6 часов) эффекторный зонд связывается с (предварительно)связанным предварительно направляющим зондом через его вторичный направляющий фрагмент. Вторичная мишень (присутствующая на предварительно направляющем зонде) и вторичный направляющий фрагмент (присутствующий на эффекторном зонде) должны связываться быстро, с высокой специфичностью и высоким сродством и должны быть устойчивы внутри организма.

Общая концепция предварительного придания направленности действия обрисована в общих чертах для визуализации на Фиг. 1. Здесь, эффекторный зонд представляет собой зонд для визуализации, содержащий обнаруживаемую метку для визуализационной модальности. Эффекторный зонд связывается с (предварительно)связанным предварительно направляющим зондом через его вторичные направляющие группы.

Общими примерами пар вторичная мишень/вторичный направляющий фрагмент являются биотин/стрептавидин или системы антитело/антиген. Чтобы быть эффективным, эффекторный зонд должен быстро выводиться из организма (например, через почки) для обеспечения желательного высокого накопления в опухоли, с относительно низким нецелевым накоплением. Следовательно, эти зонды обычно являются небольшими.

В ядерной визуализации и лучевой терапии концепция предварительного придания направленности действия имеет дополнительное преимущество, поскольку затратная по времени стадия предварительного придания направленности действия может осуществляться без использования радионуклида, в то время как вторичная направляющая стадия с использованием радионуклида может осуществляться быстрее. Последнее позволяет применять более короткоживущие радионуклиды, с преимуществом минимизации дозы облучения для пациента и, например, применения средств для ПЭТ вместо средств для ОФЭКТ. Кроме того, в целом, этот подход облегчает применение универсального контрастного вещества.

Объекты, в которых осуществляются высокоселективные взаимодействия в биологии в целом (такие как антитело-антиген), и при предварительном придании направленности действия в частности (биотин-стрептавидин, антитело/гаптены, антисмысловые олигонуклеотиды), являются очень крупными. В результате предварительное придание направленности действия с пептидами и небольшими органическими фрагментами в качестве первичных направляющих групп, а также метаболическая визуализация и внутриклеточная целевая визуализация оставались вне пределов достижимости, поскольку размер вторичных мишеней делал применение небольших первичных групп нецелесообразным.

Более того, работа существующих систем предварительного придания направленности действия затруднена факторами, ассоциированными с их биологической природой. Биотин представляет собой эндогенную молекулу, и его конъюгаты могут расщепляться сывороточным ферментом биотинидазой. Когда применяют антисмысловое предварительное придание направленности действия, олигонуклеотиды могут быть объектом атаки РНКазой и ДНКазой. Белки и пептиды также являются объектом воздействия природных путей разложения. Эти взаимодействия могут быть дополнительно ослаблены их нековалентной и динамической природой и ограничены временем пребывания на мишени. В результате время между добавлением двух компонентов при предварительном придании направленности действия является ограниченным, что может приводить к неоптимальным соотношениям мишени к не мишени. Также эндогенный биотин конкурирует с конъюгатами биотина за связывание со стрептавидином. В конце концов, стрептавидин является высокоиммуногенным.

Недавняя разработка направлена на то, чтобы избежать недостатков, ассоциированных с приданием предварительной направленности действия исключительно на основе природных/биологических направляющих конструкций (т.е. биотин/стрептавидин, антитело/гаптен, антисмысловые олигонуклеотиды).

В этом отношении может быть сделана ссылка на WO 2006/038185, в качестве раскрытия способа предварительного придания направленности действия, для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, где применяют абиотические реакционноспособные химические группы, которые проявляют биоортогональную реакционную способность по отношению друг к другу. В этой ссылке биоортогонально взаимодействующие группы представляют собой партнеры реакции в сшивании Штаудингера, т.е. азид и фосфин. Описанный выбор сшивания Штаудингера в качестве химии связывания при предварительном придании направленности действия приводит к доступности реакционноспособных партнеров, которые являются абиотическими, которые образуют устойчивый аддукт при физиологических условиях и которые распознают только друг друга, в то же время, игнорируя их клеточные/физиологические окружения (т.е. они являются биоортогональными).

Еще одной ссылкой на применение в способе предварительного придания направленности действия абиотических реакционноспособных химических групп, которые проявляют биоортогональную реакционную способность по отношению друг к другу, является WO 2007/039858. В этом документе биоортогональные реакционноспособные группы представляют собой партнеры реакции в [3+2] азид - алкин циклоприсоединении.

Еще один тип химии связывания описан Neal K. Devaraj, Ralph Weissleder и Scott Hilderbrand в Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2297-2299. Это относится к применению биоортогональных циклоприсоединений тетразина для мечения живых клеток. Партнерами реакции здесь являются 3-(п-бензиламино)-1,2,4,5-тетразин и норборнен, а именно (1S,2S,4S)-бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-илуксусная кислота, которые вступают в циклоприсоединение Дильса-Альдера с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера, в которой высвобождается молекулярный азот (N₂). Эта химия связывания также относится к реакции Дильса-Альдера с обратным захватом электронов. Сделана ссылка на предварительное придание направленности действия на человеческие клетки рака молочной железы SKBR3 с использованием моноклонального антитела трастузумаб (герцептин), меченного норборненом, с последующим мечением клеток тетразином, связанным с расположенным рядом ИК-флуоресцентным зондом VT680.

Приведенные выше типы химии связывания, несмотря на их применимость, также являются предметом дальнейшего улучшения. Это относится к тому, что по смыслу, между прочим, необходимы относительно высокие концентрации взаимодействующих веществ. Конкретно, данное означает, что эффекторные зонды, чтобы в достаточной степени связаться с предварительно направляющими зондами, требуют относительно длительного времени циркуляции и/или высоких концентраций. Желательно иметь возможность снизить необходимые концентрации эффекторных зондов, в то же время сохраняя преимущества упомянутого выше биоортогонального способа предварительного придания направленности действия.

Дополнительно, особенно со ссылкой на применение в ядерной визуализации и лучевой терапии, желательным является представить быструю и эффективную биоортогональную химию связывания.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для того чтобы лучшим образом принять меры для удовлетворения приведенных выше запросов, изобретение, в одном аспекте, предоставляет набор для направленной медицинской визуализации и/или клинической медицины, содержащий по меньшей мере один предварительно направляющий зонд и по меньшей мере один эффекторный зонд, где предварительно направляющий зонд содержит первичный направляющий фрагмент и первую биоортогональную реакционноспособную группу и где эффекторный зонд содержит эффекторный фрагмент, такой как метка или фармацевтически активное соединение, и вторую биоортогональную реакционноспособную группу, где любая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп представляет собой диенофил, а другая из первой и второй биоортогональных реакционноспособных групп является диеном, где диенофил представляет собой 8-членный циклический диенофил, соответствующий формуле (1):

где каждый R независимо обозначает H или в по большей мере шести случаях заместитель, выбранный из группы, состоящей из алкила, O-алкила, S-алкила, F, Cl, Br, I, SO₂, NO₂, NR'R", причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил, C(=O)Оалкил, C(=O)Оарил, CONR'R", причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H, арил или алкил, ОСОалкил, ОСОарил, NR'СОалкил, причем R' представляет собой H или алкил, NR'СОарил, причем R' представляет собой или алкил, NR'C(=O)Оалкил, причем R' представляет собой H или алкил, NR'C(=O)Оарил, причем R' представляет собой H или алкил, OCONR'алкил, причем R' представляет собой H или алкил, OCONR'арил, причем R' представляет собой H или алкил, NR'CONR"алкил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил, NR'CONR"арил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил, NR'CSNR"алкил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил и NR'CSNR"арил, причем R' и R", каждый независимо, представляют собой H или алкил; причем по меньшей мере один R, содержащийся в линкерном фрагменте, связан, необязательно через спейсер, с предварительно направляющим зондом или эффекторным зондом, и где X и Y, каждый независимо, обозначают H или заместитель, выбранный из группы, состоящей из алкила, O-алкила, S-алкила, F, Cl, Br, I, SO₂, NO₂ и NRR', причем R и R', каждый независимо, представляют собой H или алкил или вместе образуют связь; и где диен выбирают таким образом, чтобы он был способен к взаимодействию с диенофилом посредством протекающего циклоприсоединения Дильса-Альдера с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ предварительного придания направленности действия, а также применяемые в нем предварительно направляющие средства и направленную медицинскую визуализацию или терапию, где этот набор применяют.

В еще одном дополнительном аспекте изобретение представляет собой соединение, соответствующее формуле (1), для применения в способе предварительного придания направленности действия у животного или человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет описано по отношению к конкретным вариантам осуществления и со ссылкой на некоторые чертежи, но изобретение не ограничивается ими, но ограничивается только формулой изобретения. Любые ссылочные знаки в формуле изобретения не должны рассматриваться как ограничивающие объем правовых притязаний. Описанные чертежи являются только схематическими и не являются ограничивающими. На чертежах размер некоторых элементов может быть преувеличен и не совпадать по масштабу для иллюстративных целей. Там, где термины "содержащий" и “включающий” применяют в настоящем описании и формуле изобретения, они не исключают другие элементы или стадии. Там, где неопределенный или определенный артикль применяют при ссылке на единственное число имени существительного, например "a" или "an", "the", это включает множественную форму этого существительного, если что-либо еще не утверждается конкретно.

Кроме того, следует отметить, что термин "содержащий" и “включающий”, используемый в описании и в формуле изобретения, не должен интерпретироваться как ограниченный средствами, перечисленными после его употребления; он не исключает другие элементы или стадии. Таким образом, объем охвата выражения "устройство, содержащее средства А и B" не должно быть ограничено устройствами, состоящими только из компонентов А и B. Это означает, что в отношении настоящего изобретения только уместными компонентами устройства являются А и B.

В некоторых химических формулах сделана ссылка на "алкил" и "арил". В этом отношении, "алкил", каждый независимо, указывает на алифатическую, с прямой цепью, разветвленную или циклическую алкильную группу из вплоть до десяти атомов углерода, возможно включающую 1-3 гетероатома, таких как O, N или S, и предпочтительно из 1-6 атомов углерода, и "арил", каждый независимо, указывает на ароматическую или гетероароматическую группу из вплоть до десяти атомов углерода, возможно включающую 1-3 гетероатома, таких как N или S. В некоторых формулах группы или заместители указаны со ссылкой на букву, такую как "A", "B", "X", "Y", и разнообразно пронумерованные "R" группы. Определения этих букв следует читать со ссылкой на каждую формулу, т.е. в различных формулах эти буквы, каждая независимо, могут иметь различные значения, если не указано иным образом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 отображает общую схему концепции предварительного придания направленности действия, как обсуждается выше;

Фиг.2. предоставляет схему реакции для реакции [4+2] Дильса-Альдера; между (3,6)-ди-(2-пиридил)-s-тетразином и E-циклооктеном с последующей ретрореакцией Дильса-Альдера, в которой образуются продукт и азот. Поскольку производное транс-циклооктена не содержит электроноакцепторных групп как в классической реакции Дильса-Альдера, этот тип реакции Дильса-Альдера отличается от классического типа и часто именуется как "реакция Дильса-Альдера с обратным захватом электронов". В последующем тексте последовательность обеих стадий реакции, т.е. первоначального циклоприсоединения Дильса-Альдера (обычно циклоприсоединения Дильса-Альдера с обратным захватом электронов) и последующей ретрореакции Дильса-Альдера будет именоваться в сокращенном виде как "ретрореакция Дильса-Альдера".

Фиг. 3 (a и b) отображают общие схемы предварительного придания направленности действия с использованием ретрохимии Дильса-Альдера;

Фиг. 4 - Фиг. 7 иллюстрируют схемы синтеза для соединений, используемых в Примерах.

Фиг. 8-9 иллюстрируют схемы синтеза для соединений, используемых в примере in vivo.

Фиг. 10-12 иллюстрируют применимость настоящего изобретения in vivo.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Ретрореакция Дильса-Альдера

Химия связывания ретро-Дильса-Альдера, как правило, включает пару взаимодействующих соединений, которые связываются с образованием неустойчивого промежуточного соединения, которое отщепляет небольшую молекулу (в зависимости от исходных соединений, которая может представлять собой, например, N₂, CO₂, RCN, в качестве единственного побочного продукта, через ретрореакцию Дильса-Альдера с образованием устойчивого продукта. Пары взаимодействующих соединений содержат в качестве одного взаимодействующего соединения (т.е. одной биоортогональной реакционноспособной группы) подходящий диен, такой как производное тетразина, и в качестве другого взаимодействующего вещества (т.е. другой биоортогональной реакционноспособной группы) циклооктен или циклооктин в соответствии с формулой (1).

Химия связывания ретро-Дильса-Альдера, как правило, включает пару взаимодействующих соединений, которые связываются с образованием неустойчивого промежуточного соединения, которое претерпевает перегруппировку в устойчивый аддукт через ретрореакцию Дильса-Альдера. Пары взаимодействующих соединений содержат в качестве одного взаимодействующего соединения (т.е. одной биоортогональной реакционноспособной группы) диен, такой как электронодефицитный тетразин, или т.п., и в качестве другого взаимодействующего вещества (т.е. другой биоортогональной реакционноспособной группы) напряженный циклооктен или циклооктин в соответствии с формулой (1).

Исключительно быстрая реакция, например, электронодефицитных (замещенных) тетразинов, например, с напряженным E-циклооктеном приводит в результате к промежуточному соединению сшивания, которое претерпевает перегруппировку в устойчивый дигидропиридазин посредством отщепления N₂, в качестве единственного побочного продукта в [4+2] циклоприсоединении ретро-Дильса-Альдера. Это показано на Фиг. 2.

Два реакционноспособных соединения являются абиотическими и, таким образом, не претерпевают быстрого метаболизма in vivo. Они являются биоортогональными, например, они селективно взаимодействуют друг с другом в физиологических средах.

Ссылки на реакцию Дильса-Альдера с обратным захватом электронов и поведение пары реакционноспособных соединений включают Thalhammer, F.; Wallfahrer, U.; Sauer, J., Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47), 6851-6854; Wijnen, J.W.; Zavarise, S.; Engberts, JBFN, Journal of Organic Chemistry, 1996, 61, 2001-2005; Blackman, M.L.; Royzen, M.; Fox, J.M., Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19).

Следует понимать, что, в широком смысле, в соответствии с изобретением упомянутая выше химия связывания может быть применена по сути к любой паре молекул, групп или фрагментов, которые могут применяться в предварительном придании направленности действия. Т.е. один элемент из такой пары будет содержать первичный направляющий фрагмент, который обладает способностью к связыванию с первичной мишенью, и дополнительно содержит, по меньшей мере, одну вторичную мишень. Другой элемент будет представлять собой вторичный направляющий фрагмент, пригодный для применения в связывании с указанной вторичной мишенью, и дополнительно содержит фрагмент, пригодный для оказания терапевтического действия (обычно фармацевтически активное соединение), или предназначенный для метода визуализации (т.е. метку), или оба.

Таким образом, в соответствии с изобретением любой из предварительно направляющего зонда и эффекторного зонда функционализирован циклооктеном или циклооктином, а другой функционализирован с тетразином или другим подходящим диеном. Это проиллюстрировано на Фиг. 3. Схема сверху (Фиг. 3a) показывает предварительно направляющий зонд, содержащий дипиридилтетразин, связанный через линкерный фрагмент (предпочтительно содержащий гибкий спейсер) с антителом, в качестве первичного направляющего фрагмента, и эффекторный зонд, содержащий циклооктен (в качестве вторичного направляющего фрагмента), присоединенный через линкер (гибкий спейсер) к обнаруживаемой метке. Схема ниже (Фиг. 3b) показывает в точности противоположное, а именно предварительно направляющий зонд, содержащий циклооктен, и эффекторный зонд, содержащий тетразин.

Квалифицированный специалист в данной области осведомлен об изобилии диенов, которые являются реакционноспособными в ретрореакции Дильса-Альдера. Предпочтительные диены приведены ниже со ссылкой на формулы (2)-(7).

где R¹ выбирают из группы, состоящей из алкила, арила, O-алкила, C(=O)O-алкила, O- и NH₂; А и B, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из алкилзамещенного углерода, арилзамещенного углерода, азота, N⁺O^-, N⁺R, причем R представляет собой алкил, при условии, что А и B не являются оба углеродом; X выбирают из группы, состоящей из O, N-алкила и C=O; Y представляет собой CR, причем R выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, C(=O)Оалкила.

Диен формулы (2) является особенно пригодным в качестве партнера реакции для циклооктинового диенофила, т.е. диенофила в соответствии с формулой (1) где X и Y, как определено в формуле (1), вместе образуют связь.

Диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктена, представляет собой

где R¹ и R², каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF₃, C(=O)NH-алкила и NO₂; А выбирают из группы, состоящей из N-алкила, N-арила, C=O и CN-алкила; В представляет собой O; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, N и N⁺O^-.

Сравнимый диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктина, представляет собой

где R¹ и R², каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF₃, C(=O)NH-алкила и NO₂; А выбирают из группы, состоящей из CO, Салкил-алкила, CN-алкила, N-алкила и N-арила; В представляет собой O; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, N и N⁺O^-.

Еще один диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктена, представляет собой

где R¹ и R², каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF₃, C(=O)NH-алкила и NO₂; А выбирают из группы, состоящей из N, C-алкила, C-арила и N⁺O^-; В представляет собой N; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, N и N⁺O^-.

Сравнимый диен, особенно подходящий в качестве партнера реакции для циклооктина, представляет собой

где R¹ выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, OH, C(=O)O-алкила, CF₃ и NO₂; R² выбирают из группы, состоящей из H, алкила, арила, CN, OH, C(=O)O-алкила, CF₃ и NO₂;

A выбирают из группы, состоящей из N, CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N⁺O^-; В представляет собой N; X выбирают из группы, состоящей из CH, C-алкила, C-арила, CC(=O)O-алкила и N; Y выбирают из группы, состоящей из CH, CCN, C-алкила, C-арила, N и N⁺O^-.

Особенно применимыми производными тетразина являются электронодефицитные тетразины, т.е. тетразины, замещенные группами или фрагментами, которые, как правило, не рассматриваются в качестве электронодонорных, и предпочтительно несущие электроноакцепторные заместители.

Эти электронодефицитные тетразины, в общем случае, соответствуют следующей структурной формуле:

В этой формуле R¹ и R², каждый независимо, обозначают заместитель, выбранный из группы, состоящей из 2-пиридила, фенила или фенила, замещенного одной или более электроноакцепторными группами, такими как NO₂, CN, COOH, COOR, CONH₂, CONHR, CONR₂, CHO, COR, SO₂R, SO₂OR, NO, Ar, где R представляет собой C₁-C₆ алкил и Ar обозначает ароматическую групп, особенно фенил, пиридил или нафтил.

В соединениях в соответствии с каждой из формул (2)-(7) могут быть дополнительно предоставлены группы R¹ и R² (включая их на X или Y), с подходящими линкерным или спейсерным фрагментами, как обсуждается ниже. Аналогично и независимо от этого может быть дополнительно предоставлен также диенофил формулы (1) с подходящими линкерным или спейсерным фрагментами, как обсуждается ниже.

Диенофил предпочтительно представляет собой E-циклооктен или циклооктин. Более предпочтительно, этот E-циклооктен или циклооктин является незамещенным (помимо линкера или спейсера), т.е. E-циклооктен в соответствии с формулой 8 или циклооктин формулы 9.

где X и Y имеют приведенное выше значение,

Преимущество применения [4+2] ретрореакции Дильса-Альдера в стратегии предварительного придания направленности действия состоит в том, что как диен, так и циклооктен или циклооктин являются абиотическими и по существу нереакционноспособными по отношению к биомолекулам внутри или на поверхностях клеток и всех других областей, таких как сыворотка и т.д. Таким образом, соединения и способ изобретения могут применяться в живой клетке, ткани или организме. Более того, реакционноспособные группы являются относительно небольшими и могут быть введены в биологические образцы или живые организмы без существенного изменения биологического размера. Применяя [4+2] ретрореакцию Дильса-Альдера, возможно связывать первичные направляющие фрагменты, которые являются крупными по размеру, например антитела, с метками или другими молекулами, применяя небольшие партнеры в реакции, например тетразин или циклооктен. Даже более преимущественно, первичные направляющие фрагменты, которые являются относительно небольшими, например пептиды, могут быть связаны с метками или другими молекулами с использованием (подобранной пары) относительно небольших партнеров реакции, например, тетразина и циклооктена. Размер и свойства предварительно направляющего зонда и эффекторного зонда не испытывают сильного воздействия со стороны вторичной мишени и вторичного направляющего фрагмента, что позволяет применять схемы предварительного придания направленности действия для небольших направляющих фрагментов. Вследствие этого, другие ткани могут быть выбраны в качестве мишеней, т.е. назначение зондов не ограничено сосудистой системой и интерстициальным (межклеточным) пространством как в случае применяемого в настоящее время предварительного придания направленности действия с антителом-стрептавидином. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение применяют для направленной визуализации.

В соответствии с этим вариантом осуществления визуализация конкретной первичной мишени достигается посредством специфического связывания первичного направляющего фрагмента предварительно направляющего зонда и обнаружения этого связывания с использованием обнаруживаемых меток, содержащихся в эффекторном зонде.

Первичная мишень

"Первичная мишень", как используют в настоящем изобретении, относится к мишени для обнаружения в способе диагностики и/или способе визуализации, и/или подлежащей модуляции, связыванию, или иным образом предназначенной для действия фармацевтически активного соединения или другой терапевтической модальности.

Первичная мишень может быть выбрана из каких-либо подходящих мишеней внутри организма человека или животного или на патогене или паразите, например, из группы, содержащей клетки, такие как клеточные мембраны и клеточные стенки, рецепторы, такие как рецепторы клеточной мембраны, внутриклеточные структуры, такие как тельца Гольджи или митохондрии, ферменты, рецепторы, ДНК, РНК, вирусы или вирусные частицы, антитела, белки, углеводы, моносахариды, полисахариды, цитокины, гормоны, стероиды, рецептор соматостатина, моноаминоксидаза, мускариновые рецепторы, симпатическая нервная система миокарда, рецепторы лейкотриенов, например, на лейкоцитах, рецептор урокиназного активатора плазминогена (uPAR), фолатный рецептор, маркер апоптоза, маркер (анти-)ангиогенеза, гастриновый рецептор, допаминергическая система, серотонинергическая система, ГАМКергическая система, адренергическая система, холинергическая система, опиоидные рецепторы, GPIIb/IIIa рецептор и другие относящиеся к тромбам рецепторы, фибрин, рецептор кальцитонина, рецептор туфтсина, рецептор интегрина, рецепторы VEGF/EGF, матриксная металлопротеаза (MMP), рецептор P/E/L-селектина, рецептор LDL, P-гликопротеин, рецепторы нейротензина, рецепторы нейропептидов, рецепторы вещества Р, NK-рецептор, CCK-рецепторы, сигма-рецепторы, рецепторы интерлейкинов, тирозинкиназа вируса herpes simplex, человеческая тирозинкиназа.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения первичная мишень представляет собой белок, такой как рецептор. Альтернативно, первичная мишень может являться метаболическим путем, который регулируется с повышением во время заболевания, например инфекции или рака, таким как синтез ДНК, синтез белка, мембранный синтез и поглощение углеводов. В пораженных болезнью тканях упомянутые выше маркеры могут отличаться от здоровой ткани и предлагать уникальные возможности для раннего обнаружения, специфической диагностики и терапии, особенно направленной терапии.

Предварительно направляющий зонд

Предварительно направляющий зонд содержит фрагмент, который обладает способностью к связыванию с первичной мишенью, представляющей интерес.

Направляющие фрагменты, обычно представляют собой конструкции, которые имеют сродство к мишеням (целям) на поверхности клеток (например, мембранные рецепторы), структурные белки (например, амилоидные бляшки) или внутриклеточные мишени (например, РНК, ДНК, ферменты, клеточные сигнальные пути). Эти фрагменты могут представлять собой антитела (фрагменты), белки, аптамеры, олигопептиды, олигонуклеотиды, олигосахариды, а также пептиды, пептоиды и органические лекарственные соединения, которые, как известно, накапливаются при конкретном заболевании или дисфункции.

Конкретные варианты осуществления пригодных первичных направляющих фрагментов для применения в наборах настоящего изобретения описаны в настоящем документе и включают связывающиеся с рецепторами пептиды и антитела. Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению небольших направляющих фрагментов, таких как пептиды, таким образом, чтобы получать проникающий в клетку направляющий зонд.

"Первичный направляющий фрагмент", как использован в настоящем изобретении, относится к части направляющего зонда, которая связывается с первичной мишенью. Конкретными примерами первичных направляющих фрагментов являются пептиды или белки, которые связываются с рецептором. Другие примеры первичных направляющих фрагментов представляют собой антитела или их фрагменты, которые связываются с клеточным соединением. Антитела могут включать небелковые соединения, а также белки или пептиды. Другие первичные направляющие фрагменты могут состоять из аптамеров, олигопептидов, олигонуклеотидов, олигосахаридов, а также пептоидов и органических лекарственных соединений. Первичный направляющий фрагмент предпочтительно связывается с высокой специфичностью, с высоким сродством, и связь с первичной мишенью предпочтительно является устойчивой внутри организма.

Для обеспечения специфической направленности на перечисленные выше первичные мишени первичный направляющий фрагмент направляющего зонда может содержать соединения, включающие, но не ограниченные ими, антитела, фрагменты антител, например Fab2, Fab, scFV, полимеры (направленное действие на опухоль посредством ЭПР-эффекта), белки, пептиды, например октреотид и производные, VIP, MSH, LHRH, хемотаксические пептиды, бомбезин, эластин, пептидомиметики, углеводы, моносахариды, полисахариды, вирусы, лекарственные средства, химиотерапевтические средства, агонисты и антагонисты рецепторов, цитокины, гормоны, стероиды. Примеры органических соединений, предусмотренных в контексте настоящего изобретения, представляют собой или являются их производными, эстрогены, например эстрадиол, андрогены, прогестины, кортикостероиды, паклитаксел, этопозид, доксорубицин, метотрексат, фолиевую кислоту и холестерин.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения первичная мишень представляет собой рецептор и подходящие первичные направляющие фрагменты включают, но не ограничены ими, лиганд такого рецептора или его часть, которая еще связывается с рецептором, например, связывающийся с рецептором пептид в случае белковых лигандов, связывающихся с рецептором.

Другие примеры первичных направляющих фрагментов белковой природы включают интерфероны, например альфа-, бета- и гамма-интерферон, интерлейкины и белковый фактор роста, такой как фактор роста опухоли, например альфа-, бета-фактор рос