Средство для лечения заболевания

Средство для лечения заболевания

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к лечению аутоиммунных заболеваний. Изобретение относится к средству, такому как гуманизированное моноклональное антитело, которое можно вводить в более высоких дозах, чем ранее описанные дозы. В частности, такое ведение эффективно для пациентов, страдающих заболеванием или имеющих симптомы, для эффективного лечения которых требуются более высокие дозы. Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей средство, такое как антитело, в эффективной концентрации, а также к применению и способам лечения, при которых используются композиции и лекарственные препараты, содержащие указанное средство.

Аутоиммунная реакция представляет собой неспособность организма распознавать собственные составные части (вплоть до субмолекулярных уровней) как “свое”, что приводит к иммунному ответу против собственных клеток и тканей. Любое заболевание, которое является следствием такого патологического иммунного ответа, называют аутоиммунным заболеванием. Аутоиммунные заболевания включают рассеянный склероз (MS), ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатический артрит, язвенный колит, болезнь Крона, миастению гравис (MG), аутоиммунный полигландулярный синдром типа II (APS-II), тиреоидит Хашимото (НТ), диабет 1 типа (T1D), системную красную волчанку (SLE) и аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALS).

Аутоиммунное заболевание возникает, когда Т-клетки распознают “собственные” молекулы, т.е. молекулы, продуцируемые клетками хозяина, и взаимодействуют с ними. Активация "аутореактивных" T-клеток путем презентации аутоантигенов, процессированных антиген-презентирующими клетками (APC), приводит к увеличению их числа и миграции в определенные ткани, где они вызывают воспаление и разрушение ткани.

В норме T-клетки толерантны к аутологичной ткани и реагируют только на презентацию гетерологичных структур. Центральная толерантность и периферическая толерантность включает два механизма, посредством которых иммунная система препятствует индукции разрушительных функций аутореактивными T-клетками. Центральная толерантность опосредуется негативной селекцией. Этот процесс включает элиминацию через клональную делецию аутореактивных T-клеток в процессе онтогенного развития тимуса.

Периферическая толерантность представляет собой резерв, доступный в том случае, если центральная толерантность является недостаточной и аутореактивные клетки выходят из тимуса. Этот механизм толерантности действует постоянно на протяжении всей жизни, сохраняя иммунное безразличие (анергии), периферическую делецию и/или активную супрессию в отношении аутореактивных клеток.

Регуляторные T-клетки (Treg, ранее называемые "супрессорными клетками") в качестве части активной супрессии поддерживают периферическую толерантность и регулируют аутоиммунные реакции (Suri-Payer et al., J. Immunol. 157: 1799-1805 (1996); Asano et al., J. Exp. Med. 184: 387-396 (1996); Bonomo et al., J. Immunol. 154: 6602-6611 (1995); Willerford et al., Immunity 3: 521-530 (1995); Takahashi et al., Int. Immunol. 10: 1969-1980 (1998); Salomon et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Read et al., J. Exp. Med. 192: 295-302 (2000). Как правило, регуляторные T-клетки ингибируют активацию и/или функцию T-хелперов 1 типа (TH1) и эффекторных клеток TH2. Нарушение регуляции частоты или функционирования клеток Treg может привести к истощающим аутоиммунным заболеваниям (Baecher-Allan et al., Immunol. Review 212: 203-216 (2006); Shevach, Annu. Rev. Immunol. 18: 423-449 (2000); Salomon et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 182: 18-32 (2001)).

Охарактеризовано несколько подгрупп регуляторных T-клеток. Семейство Treg состоит из двух основных подгрупп: появляющиеся естественным образом, например CD4⁺CD25⁺ Treg, и периферически индуцированные, Tr1- и Th3-Treg. Более того, у человека и грызунов были описаны NKTreg и CD8⁺ Treg (Fehervari et al., J. Clin. Investigation 114: 1209-1217 (2004)).

Происходящие из тимуса клетки Treg (встречающиеся в природе CD4⁺CD25⁺Treg) являются главными регуляторными клетками, вовлеченными в регуляцию аутоиммунных реакций или патогенных иммунных ответов.

i) они представляют собой CD4⁺ T-клетки и составляют 5-10% от периферических CD4⁺ T-клеток

ii) они созревают в тимусе

iii) они, главным образом, характеризуются объединенной экспрессией рецептора IL-2 (CD25), низкомолекулярной изоформы молекулы CD45, CD152 (CTLA-4) и фактора транскрипции FoxP3.

Роль Treg наилучшим образом можно продемонстрировать на экспериментах, касающихся реконструкции иммунодефицитных “голых” мышей с клетками CD4⁺ и истощением клеток CD25⁺. У “голых” мышей CD4⁺CD25^- с восстановлением развиваются различные орган-специфические аутоиммунные заболевания, такие как гастрит, оофорит, орхит и тиреоидит (Suri-Payeret et al.; J. Immunol. 160: 1212-1218 (1998)).

Введение подгруппы CD4⁺CD25⁺ в эксперименты по реконструкции с “голыми” мышами препятствует возникновению этих заболеваний (Sakaguchi et al., J Immunol. 155: 1151-1164 (1995)). Защитное значение клеток CD4⁺CD25⁺ против органоспецифических аутоиммунных реакций также было показано на нескольких других моделях аутоиммунных реакций (например, модели аутоиммунного гастрита, простатита, оофорита, гломерулонефрита, эпидимита и тириоидита), вызванного неонатальной тимэктомией, проведенной через 3 суток после рождения (d3Tx), или воспалительного заболевания кишечника, вызванного реконструкцией у мышей SCID T-клетками CD45RBhigh, CD4⁺CD25^-. Введение антитела против CD25 мышам in vivo также индуцирует органоспецифическое аутоиммунное заболевание.

Открытие важности регулятора транскрипции FoxP3 для реализации функции регуляторных T-клеток CD4⁺CD25⁺ у мышей и предшествующие наблюдения за пациентами с синдромом IPEX (нарушение иммунной регуляции, полиэндокринопатия, энтеропатия и X-сцепленное наследование), у которых тяжелое воспалительное заболевание, сходное с заболеванием, наблюдаемым у мышей с дефицитом регуляторных клеток CD4⁺CD25⁺ ("scurfy"-синдром), связано с мутацией FoxP3, выявило прямую связь между аутоиммунной моделью животных, регуляторными T-клетками мыши и аутоиммунным заболеванием человека (Sakaguchi et al., J. Immunol. 155: 1151-1164 (1995)).

Фармацевтический механизм регуляторных T-клеток не полностью ясен. Treg CD4⁺CD25⁺ ингибируют поликлональную и антиген-специфическую активацию T-клеток. Супрессия опосредуется зависимым от клеточных контактов механизмом, который требует активации Treg CD4⁺CD25⁺ через TCR, но Treg не демонстрируют пролиферативного ответа при активации или стимуляции TCR митогенными антителами (анергическими) (Shevach, Nature Rev. Immunol 2: 389 (2002). После стимуляции они являются компетентными для супрессии независимым от антигена образом ответа CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток, а также ингибирования активации B-клеток и их клональной экспансии.

Существуют дополнительные данные, указывающие на то, что супрессорная активность CD4⁺CD25⁺ Treg также частично основана на противовоспалительных цитокинах, таких как TGF-β (Kingsley et al., J. Immunol. 168: 1080 (2002); Nakamura et al., J. Exp. Med. 194: 629-644 (2001)). Функциональное значение секреции TGF-β, более того, подтверждается данными о том, что у мышей с дефицитом TGF-β развивается аутоиммунное заболевание и что введение нейтрализующих антител против TGF-β снимает in vivo профилактику аутоиммунных реакций или индуцирующую толерантность активность CD4⁺ T-клеток в некоторых моделях.

В подгруппе CD4⁺ T-клеток могут существовать по меньшей мере еще 2 различных типа клеток с супрессивной функцией, индукция которых происходит после воздействия специфического экзогенного антигена (называемые "адаптивными или индуцибельными регуляторными T-клетками"): регуляторные T-клетки 1 типа (Tr1) и клетки Th3. Эти типы клеток, по-видимому, отличаются от CD4⁺CD25⁺ Treg характером продукции цитокинов. Однако взаимосвязь между этими различными типами неясна и их способы действия не перекрываются.

Tr1-клетки индуцируются повторной стимуляцией TCR в присутствии IL-10, и было показано, что они, главным образом, подавляют иммунные ответы за счет получения высоких уровней IL-10 совместно с умеренными количествами TGF-β (Chen et al., J. Immunol. 171: 733-744 (2003)).

Th3-клетки (идентифицированные на модели EAE после пероральной доставки антигена) продуцируют высокие количества TGF-β и различные количества IL-4 и IL-10. Было показано, что IL-4 сам по себе является основным фактором для дифференцировки Th3-клеток, в противоположность Tr1-клеткам, которые дифференцируются при помощи IL-10 (Chen et al., Science 265:1237-1240 (1994)).

Супрессия функции T-клеток с использованием иммуносупрессивных лекарственных средств является основной терапевтической стратегией, которую успешно использовали для лечения аутоиммунных заболеваний. Однако эти лекарственные средства индуцируют системную иммуносупрессию из-за плохой селективности, что приводит к ингибированию не только вредных функций иммунной системы, но также и полезных. Вследствие этого могут возникнуть различные типы риска, такие как риск инфекции, злокачественной опухоли и токсичности лекарственного средства.

Средства, препятствующие функции T-клеток, представляют собой основу терапии различных аутоиммунных заболеваний.

До настоящего времени было показано, что подход с использованием средств, нацеленных на активацию регуляторных T-клеток, для терапии аутоиммунных заболеваний, является крайне затруднительным. Активация Treg через TCR с использованием антитела-агониста против CD3 OKT-3 (Abramowicz et al., N Engl. J Med. 1992 Sep 3; 327(10):736) или через костимуляторную молекулу CD28 с использованием антитела-суперагониста против CD28 TGN1412 приводит к полному истощению популяции регуляторных T-клеток, а также других традиционных T-клеток и к системной индукции и высвобождению избыточных количеств провоспалительных цитокинов, включая IFN-γ, TNF-α, IL-1 и IL-2, что приводит к клинически выраженному синдрому высвобождения цитокинов (CRS) у человека (Suntharalingam et al., N Engl. J Med. 2006 Sep 7; 355(10):1018-28).

После первых двух или трех инъекций по 5 мг моноклонального антитела OKT3 у большинства пациентов развивается синдром высвобождения цитокинов с высокими уровнями фактора некроза опухоли-альфа, интерлейкина-2 и гамма-интерферона, появляющимися в кровотоке в течение 1-2 ч у реципиентов трансплантата почки (Abramowicz et al., Transplantation. 1989 Apr; 47(4):606-8). Это приводит к узкому терапевтическому окну, которое ограничивает использование этого антитела для лечения аутоиммунного заболевания.

Лечение общей дозой 5-10 мг TGN1412 (0,1 мг антитела против CD28 на килограмм массы тела) приводит к системному воспалительному ответу с полиорганной недостаточностью в течение 90 минут после введения однократной внутривенной дозы TGN1412 (Suntharalingam et al., N Engl. J Med. 2006 Sep 7; 355(10):1018-28).

Общеизвестно, что CD4 T-клетки играют основную роль в инициации и поддержании аутоиммунных реакций. Таким образом, было предложено использовать mAb против поверхностных молекул CD4 T-клеток, и, в частности, mAb против CD4, в качестве иммуносупрессивных средств. Несмотря на то, что множество клинических испытаний подтвердило потенциальный интерес этого подхода, они также выявили несколько трудностей, которые необходимо устранить, чтобы сделать mAb против CD4 более подходящими для применения в рутинной клинической практике.

Было предложено несколько различных механизмов действия mAb против CD4, включая: (1) антагонизм взаимодействий CD4-MHC II, приводящий к ингибированию активации T-клеток, (2) модулирование рецептора CD4, определяемое по снижению экспрессии на клеточной поверхности CD4, (3) частичную передачу сигнала через рецептор CD4 в отсутствие связывания T-клеточного рецептора, которая может подавлять последующую активацию T-клеток и инициировать апоптотическую гибель CD4 T-клеток, (4) Fc-опосредуемую комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) или антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), приводящие к истощению CD4 T-клеток, и (5) стимуляцию регуляторных T-клеток.

Fc-опосредуемая комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), приводящие к истощению CD4 T-клеток, представляют собой главные наблюдаемые механизмы и они, главным образом, показаны для антител подкласса IgG1. Только нескольким антителам против CD4 свойственны другие механизмы, таким как TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A, причем только TRX-1 представляет собой IgG1 (Schulze-Koops et al., J Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Mason et al., J Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al., Rheumatology 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J Immunol. 158(1): 94-103 (1997)).

В случае нескольких антител против CD4 (Mason et al., J. Rheumatol. 29 (2): 220-229 (2002); Kon et al., Eur. Respir J. 18(1):45-52 (2001)) и HuMax-CD4 (Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-1439 (2003), Choy et al., Rheumatology 41 (10): 1142-8 (2002)) было отмечено дозозависимое истощение CD4⁺ T-клеток при "высоких" дозах (несколько циклов с дозировками >100 мг) и временная секвестрация (кратковременное истощение) при "более низких" дозах (несколько циклов при дозировках >10 мг). Несмотря на их активность в отношении истощения, mAb против CD4 не обеспечивают клиническую эффективность и постоянную активность при исследуемых аутоиммунных заболеваниях, например ревматоидном артрите (Strand et al., Nature Reviews 6: 75-92 (2007)). Более того истощение CD4⁺ T-клеток, главным образом, рассматривают как сценарий, который может привести к тяжелой иммуносупрессии.

Антитело B-F5 (IgG1 мыши против CD4 человека) тестировали в отношении различных аутоиммунных заболеваний.

Антитело мыши B-F5 использовали для лечения небольшого количества пациентов с тяжелым псориазом и были описаны некоторые положительные эффекты (Robinet et al., Eur J. Dermatol 1996: 6: 141-6, и Robinet et al., J. Am. Acad. Dermatol. 1997; 36: 582-8).

У пациентов с ревматоидным артритом результаты, наблюдаемые в плацебо-контролируемом испытании с суточной дозой B-F5, не показали значимого улучшения (Wendling et al. J Rheumatol; 25(8):1457-61, 1998).

У пациентов с рассеянным склерозом (MS) наблюдали некоторые положительные эффекты после лечения в течение 10 суток пациентов с ремитирующими формами, некоторые из которых не имели обострений в течение 6 месяцев после терапии (Racadot et al., J Autoimmun, 6(6):771-86, 1993). Сходные эффекты наблюдали Rumbach et al. (Mutt Scler; 1(4):207-12, 1996).

При тяжелой болезни Крона не наблюдали значимого улучшения у пациентов, получавших B-F5 в течение 7 последовательных суток (Canva-Delcambre et al., Aliment Pharmacol Ther 10(5):721-7, 1996).

При профилактике отторжения аллотрансплантата было описано, что биодоступность B-F5 не была достаточной, чтобы позволить его применение для профилактики отторжения аллотрансплантата (Dantal et al. Transplantation, 27; 62(10): 1502-6, 1996).

Из вышесказанного очевидно, что первой проблемой, которую необходимо решить, является необходимость применения высоких доз mAb для достижения клинического эффекта. Это, помимо прочего, может быть результатом плохой доступности лимфоцитов для mAb в тканях-мишенях. Применение более высоких доз может привести к избыточному действию на лимфоциты крови, вызывая нежелательные побочные эффекты.

Другим недостатком терапии моноклональными антителами у человека является то, что эти антитела, главным образом, получают из клеток мыши, и они вызывают противомышиные ответы у реципиентов-людей. Это приводит не только к более низкой эффективности лечения и особенно при любом последующем лечении моноклональными антителами мыши, но также к повышенному риску анафилаксии.

Этого недостатка, в принципе, можно избежать путем использования гуманизированных антител, полученных пересадкой определяющих комплементарность областей (CDR) моноклонального антитела мыши, которые определяют антигенсвязывающую специфичность, в каркасные области (FR) молекулы иммуноглобулина человека. Целью гуманизации является получение рекомбинантного антитела, имеющего те же антигенсвязывающие свойства, что и моноклональное антитело мыши, из которого были получены последовательности CDR, и являющегося значительно менее иммуногенным у человека.

В некоторых случаях замена CDR человека на CDR антитела мыши в каркасных областях человека является достаточной для переноса антигенсвязывающих свойств (включая не только специфичность, но также аффинность к антигену). Однако во многих антителах некоторые остатки FR важны для связывания антигена, поскольку они напрямую контактируют с антигеном в комплексе антитело-антиген или поскольку они влияют на конформацию CDR и, таким образом, на их антиген-связывающие характеристики.

Таким образом, в большинстве случаев также необходимо заменять один или несколько остатков FR человека соответствующими каркасными остатками из антитела мыши. Поскольку для предотвращения противомышиных реакций количество замещенных остатков должно быть настолько малым, насколько это возможно, задачей является определить, какой аминокислотный остаток(ки) важен для сохранения антиген-связывающих свойств. Для прогноза более подходящих для замены участков были предложены различные способы. Несмотря на то, что эти способы обеспечивают общие принципы, которые могут помочь на первых стадиях гуманизации, конечный результат изменяется от одного антитела против другого. Таким образом, для заданного антитела, очень трудно прогнозировать, какие замены обеспечат желаемый результат.

Ранее предпринимались попытки гуманизировать B-F5 мыши, и был достигнут успех в получении гуманизированного B-F5 (в дальнейшем в настоящем документе называемого hB-F5), имеющего сходные свойства связывания CD4 по сравнению с родительским B-F5 мыши.

Таким образом, в WO 2004/083247 описано, что гуманизированное антитело BT061 (гуманизированное B-F5 или просто hB-F5) является эффективным для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз и ревматоидный артрит. В указанной патентной заявке описаны композиции для парентерального введения, полученные для введения дозы 0,1-10 мг, предпочтительно 1-5 мг. Предусмотренные схемы дозирования представляют собой внутривенную дозу 1 мг в сутки и дозу 5 мг раз в двое суток для пациентов с ревматоидным артритом в течение 10 суток. Таким образом, наиболее высокая описанная доза составляет 5 мг за один раз и 25 мг в течение 10 суток.

Это исследование также было описано Wijdenes et al., в реферате и постере, представленном на конференции EULAR, в июне 2005 года. Было описано лечение 11 пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Пациентов лечили 5 внутривенными инфузиями по 5 мг BT061 один раз в двое суток с параллельным лечением 150 мг диклофенака.

Антитело, описанное в этом исследовании, не раскрыто в качестве подходящего для применения в более высоких дозах, и по-прежнему сохраняется необходимость в способах лечения при более высоких дозах, с тем, чтобы лечить большее количество пациентов.

Учитывая указанный выше уровень техники, целью настоящего изобретения является лечение пациентов, страдающих аутоиммунным заболеванием, которые не отвечают в должной степени на существующие способы лечения. В частности, целью настоящего изобретения является поиск лекарственных средств для лечения аутоиммунных заболеваний, которые можно использовать у пациентов в высоких дозах, для повышения ответа на лечение у не отвечающих на текущей момент пациентов.

Удивительно, что эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали, что IgG1-антитело BT061 в противоположность другим mAb против CD4, после связывания с CD4 клеток-мишеней не индуцирует ни ADCC, ни CDC, ни апоптоз.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного заболевания, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и средство, способное активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки, причем композицию вводят индивиду в дозе от 10 мг до 200 мг средства.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного заболевания, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и средство, способное активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки, причем композицию вводят индивиду с дозой средства от 5 до 60 мг/м².

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного заболевания, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и средство, способное активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки, где композицию вводят с дозой средства от 1 до 500 мкг/кг.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и средство, способное активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки, где средство находится в концентрации от 10 до 150 мг/мл.

В предпочтительном аспекте изобретения средство представляет собой гуманизированное антитело против CD4, или его фрагмент, или производное.

Изобретение также относится к применению средства по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания, где средство вводят индивиду в дозе, как определено в настоящем документе. Кроме того, изобретение относится к средству по настоящему изобретению, которое можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания, где средство вводят индивиду в дозе, как определено в настоящем документе.

Исходя из указанных выше доз понятно, что авторы изобретения неожиданно обнаружили, что гуманизированное антитело BT061 (гуманизированное B-F5 или просто hB-F5) по существу не модулирует и не индуцирует высвобождение провоспалительных цитокинов по сравнению с другими взаимодействующими с T-клетками антителами, например антителами против CD3. Кроме того, антитело не вызывает существенного длительного истощения CD4+ лимфоцитов.

Концентрация средства по изобретению конкретно не ограничена, при условии, что оно находится в концентрации выше известных концентраций. Однако, предпочтительно, концентрация средства составляет от 10 (или более чем 10) до 150 мг/мл, от 15 до 150 мг/мл, от 15 до 100 мг/мл, от 15 (или более чем 15) до 75 мг/мл или от 20 до 60 мг/мл. Наиболее предпочтительно, концентрация средства является (приблизительно) любой из 10 мг/мл, 12,5 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл или 100 мг/мл.

Объем дозы, вводимой индивиду с использованием композиции, конкретно не ограничен, при условии, что он доставляет высокую общую дозу по сравнению с уже известными дозами, и, таким образом, подходит для лечения индивидов, для которых такие дозы могут быть эффективны, например, но не ограничиваясь ими, индивидов с тяжелыми случаями и длительным анамнезом заболевания и недостаточным ответом на используемые лекарственные средства. В частности, концентрация средства в величине доз может изменяться для обеспечения требуемых доз, которые описаны в этой заявке.

Величина доз может изменяться в зависимости от способа введения. Предпочтительным является парентеральное введение. Примерами парентерального введения являются внутримышечное введение, внутривенное введение или подкожное введение. Если композицию вводят внутривенной инфузией, то величина дозы может составлять от 0,1 или 0,5 мл до 500 мл, предпочтительно от 15 до 25 мл, и, как правило, приблизительно 20 мл. Если композицию вводят подкожной или внутримышечной инъекцией, то величина дозы дозировки может составлять от 0,1 до 3 мл, предпочтительно от 0,5 до 1,5 мл и, как правило, приблизительно 1 мл.

Однако в некоторых вариантах осуществления композиция может находиться в концентрированной форме и разбавлена до концентрации, требуемой для конкретных индивидов. Предпочтительно, в этих случаях композицию предоставляют в относительно небольших объемах приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 мл. В альтернативных вариантах осуществления, композицию предоставляют в требуемой концентрации с величиной дозы, описанной выше (т.е. в готовом для введения виде). В одном из конкретных вариантов осуществления фармацевтические композиции для подкожного введения предоставляют в готовой для введения форме, так что их может легко вводить лицо, не являющееся медицинским персоналом.

Как указано выше, до настоящего времени не было известно, что средства с эффектом в отношении аутоиммунных заболеваний можно вводить в высоких дозах, которые предусмотрены настоящим изобретением. Хотя известные дозы средств с эффектом в отношении аутоиммунных заболеваний являются эффективными у некоторых индивидов или при некоторых типах заболеваний, понимание того, что их можно успешно использовать в более высоких дозах, открыло путь для более эффективного лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и классов пациентов.

Изобретение проиллюстрировано в качестве примера, с помощью следующих чертежей, где:

На фигуре 1 показан эффект BT061 на синтез цитокинов в культурах цельной крови 3 здоровых доноров. Культуры стимулировали в отдельных экспериментах 4 различными типами активаторов: CD3=антитела против CD3; LPS=липополисахарид; PHA=фитогемагглютинин+антитела против CD28; SEB=стафилококковый энтеротоксин B+антитела против CD28. Для выявления эффектов на различные субпопуляции лейкоцитов определяли различные цитокины: Treg-клетки (CD3: TGF-β, IL-10); моноциты/макрофаги (LPS: IL-10, TNFα, IL-1β); Th2-клетки (PHA: IL-4, IL-5, IL-13); Th1-клетки (SEB: IL-2, IFNγ);

На фигуре 2 показан эффект BT061 в культурах цельной крови человека (доноры с ревматоидным артритом) на синтез цитокинов, инициируемый различными стимуляторами;

На фигуре 3 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая V_H-область B-F5 мыши (SEQ ID NO: 5);

На фигуре 4 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая V_k-область B-F5 мыши (SEQ ID NO: 6);

На фигуре 5 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3) фрагмента плазмиды, кодирующая V_H-область гуманизированного BF-5. Последовательность, кодирующая V-область, подчеркнута, и соответствующая полипептидная последовательность (SEQ ID NO: 17) указана ниже нуклеотидной последовательности;

На фигуре 6 приведена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 4) фрагмента плазмиды, кодирующая V_K-область гуманизированного BF-5. Последовательность, кодирующая V-область, подчеркнута, и соответствующая полипептидная последовательность (SEQ ID NO: 2) указана ниже нуклеотидной последовательности;

На фигурах 7A и 7B соответственно приведено высвобождение TFNα и IL-6, наблюдаемое в клиническом испытании с BT061 (однократная внутривенная инфузия или подкожная инъекция) у здоровых добровольцев по сравнению с уровнями, описанными для моноклональных антител против CD3. В чертежи включены уровни доз и время до выздоровления. Результаты для TRX4, указанные на чертежах в качестве "2)", описаны в Keymeulen et al., 2005 N. Engl. J. Med. Type 1 Diabetes patients. Результаты для теплизумаба, указанные на чертежах в качестве "3)", описаны в Herold et al., 2002 N. Engl. J. Med. Type 1 Diabetes patients. Нормальные значения, указанные на чертежах в качестве "4)", описаны в Straub et al., 2007, Athr. & Rheumat. "*)" соответствует однократной дозе, "**)" соответствует совокупной дозе до достижения пиковой концентрации.

На фигуре 8 показаны уровни IL-2 и IFN-γ в плазме после введения однократной внутривенной или подкожной дозы BT061 у здоровых добровольцев. ULN=верхняя граница нормы; LLN=нижняя граница нормы.

На фигуре 9 показана кинетика количества CD4-клеток (количество клеток на мл плазмы) у добровольцев, которым ввели однократную подкожную дозу BT061. Указаны средние значения для 3 пациентов на группу. Пунктирная линия указывает на верхнюю границу нормы (ULN) и нижнюю границу нормы (LLN).

На фигуре 10 показана кинетика количества CD4-клеток (количество клеток на мл плазмы) у добровольцев, которым ввели однократную внутривенную дозу BT061. Указаны средние значения для 3 пациентов на группу. Пунктирная линия указывает на верхнюю границу нормы (ULN) и нижнюю границу нормы (LLN).

На фигуре 11, части A-H, приведены графики, на которых показаны данные клинических испытаний у пациентов с псориазом дозовой группы I, как описано в примере 7, в которой пациентам проводили внутривенную инъекцию 0,5 мг BT061 или плацебо. В частях A-H фигуры 8 показаны графики показателей PASI для пациентов 1-8 в дозовой группе I, соответственно.

На фигуре 12, части A-H, приведены графики, на которых показаны данные клинических испытаний у пациентов с псориазом дозовой группы II, как описано в примере 7, в которой пациентам проводили внутривенную инъекцию 2,5 мг BT061 или плацебо. В частях A-H фигуры 9 приведены графики показателей PASI для пациентов 1-8 в дозовой группе II, соответственно.

На фигуре 13, части A и B, приведены фотографии клинического испытания у пациентов с псориазом, как описано в примере 7. Фотографии являются фотографиями пациента, являющегося пациентом, получающим дозу группы II. Фотография, показанная в части A, получена перед введением. Фотография, показанная в части B, получена через 28 суток после введения.

На фигуре 14 приведены результаты клинического испытания у пациентов с ревматоидным артритом, как описано в примере 8. На чертеже приведена гистограмма процента пациентов из дозовых групп, которым подкожно вводили 1,25 мг, 6,25 мг, 12,5 мг и 25 мг BT061, достигших по меньшей мере ответа ACR20. Шести пациентам в каждой группе вводили дозу антитела, в то время как двум пациентам вводили плацебо.

На фигурах 15A и 15B приведены результаты клинического испытания у пациентов с ревматоидным артритом, как описано в примере 8. На фигуре 15A приведена гистограмма числа болезненных суставов у пациентов из дозовой группы, в которой подкожно вводили 25 мг BT061. На фигуре 15B приведена гистограмма для числа увеличенных суставов у пациентов из той же дозовой группы. Шести пациентам в каждой группе вводили дозу антитела, в то время как двум пациентам вводили плацебо.

На фигурах 16A и 16B приведены результаты клинического испытания у пациентов с ревматоидным артритом, как описано в примере 8. На чертежах приведены изменения индивидуальных параметров (в %) для одного отвечающего пациента (фигура 16A) и одного неотвечающего пациента (фигура 16B) из группы с подкожным введением дозы 25 мг. На чертежах "Pat GA" и "Phy GA" относятся к общей оценке пациентом и общей оценке врачом, соответственно. Термин "PA боли" относится к оценке пациентом боли.

На фигурах 17A и 17B приведены дополнительные результаты клинического испытания у пациентов с ревматоидным артритом, как описано в примере 8. На чертежах приведено количество болезненных суставов у пациентов из группы с подкожным введением дозы 1,25 мг (фигура 17A) и из группы с подкожным введением дозы 6,25 мг (фигура 17B).

На фигурах 18A и 18B приведены дополнительные результаты клинического испытания у пациентов с ревматоидным артритом, как описано в примере 8. На чертежах приведено количество болезненных суставов у пациентов из группы с подкожным введением дозы 50 мг (фигура 18A) и из группы внутривенной дозы 6,25 мг (фигура 18B).

На фигуре 19 приведено выравнивание полипептидных последовательностей V_K B-F5 мыши (SEQ ID NO:8), FK-001 (SEQ ID NO:9, 10, 11 и 12), L4L (SEQ ID NO: 18) и L4M (SEQ ID NO:2) при конструировании гуманизированной формы B-F5 (т.е. BT061).

На фигуре 20 приведено выравнивание полипептидных последовательностей V_H B-F5 мыши (SEQ ID NO:7), M26 (SEQ ID NO:13, 14, 15 и 16), H37L (SEQ ID NO:1) и H37V (SEQ ID NO:17) при конструировании гуманизированной формы B-F5.

Далее изобретение описано более подробно.

Средства, которые могут использоваться в настоящем изобретении, представляют собой средства, способные активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки. Средство может представлять собой полипептид, белок или антитело. Если средство представляет собой антитело, то оно может представлять собой моноклональное антитело. Предпочтительно, антитело представляет собой моноклональное антитело против CD4. Также антитело может, предпочтительно, представлять собой IgG1-антитело и оно может представлять собой немодифицированное IgG1-антитело.

В предпочтительном аспекте изобретения средство не вызывает существенного повышения уровня провоспалительных цитокинов в плазме крови индивида после введения по сравнению с антителами против CD3. В частности, уровни IFN-γ, TNF-α, IL-6 и/или IL-2 после введения средства по существу не повышаются по сравнению с уровнями плазмы, измеренными у здоровых индивидов (см. таблицу A1). Конкретно, если ULN для конкретного цитокина, приведенную в таблице A1, принять за X, тогда в пределах 96 часов после введения средства по изобретению X увеличивается менее чем в 20 раз. Предпочтительно X увеличивается менее чем в 10 раз. Более предпочтительно эти уровни представляют собой уровни в период, составляющий от 10 минут после начала введения до 96 часов после завершения введения.

Возможно, что у пациентов с аутоиммунным заболеванием уровни цитокинов перед введением средства уже выше, чем уровни, наблюдаемые у здоровых индивидов (ULN, приведенная в таблице A1), например, вследствие модифицированного статуса активации иммунных клеток по сравнению со статусом активации клеток у здоровых индивидов. В этих случаях, за X принимают концентрацию конкретного цитокина непосредственно перед введением, и в пределах 96 часов после введения средства по изобретению X увеличивается менее чем в 20 раз. Предпочтительно X увеличивается менее чем в 10 раз. Более предпочтительно эти уровни представляют собой уровни в течение периода, составляющего 10 минут после начала введения до 96 часов после завершения введения.

Таблица A1:Уровни цитокинов, измеренные в плазме здоровых добровольцев. ULN (верхняя граница нормы) вычислена исходя из средних значений, измеренных для 39 отдельных индивидов+2×стандартное отклонение.
Цитокин	ULN (пг/мл)
IL-2	19,4
IL-6	4,4
TNF-альфа	2,8
IFN-гамма	3,8

В следующем предпочтительном аспекте изобретения средство не вызывает существенного длительного снижения числа CD4+ лимфоцитов в плазме крови индивида. Конкретно, в период от 72 до 96 часов после введения число CD4+ лимфоцитов в плазме крови индивида может составлять более 250 клеток/мкл (или по меньшей мере 250 клеток/мкл).

Предпочтительно эффекты на цитокины и CD4+ лимфоциты, описанные выше, наблюдают по меньшей мере у 80% пациентов, получающих лечение.

Для предотвращения отрицательного влияния на иммунную систему, например снижения числа лимфоцитов или индукции высвобождения цитокинов, в данной области известно применение антител (особенно взаимодействующих с T-клетками антител) подкласса IgG2, IgG3 или IgG4, поскольку антитела подкласса IgG1 проявляют более высокие взаимодействия с Fc-рецептором. Также в данной области известна модификация антител (особенно взаимодействующих с T-клетками антител) путем мутации, дегликозилирования, модификации углеводной части или инженерии углеводной части Fc для уменьшения взаимодействий с Fc-рецептором.

В экспериментах, описанных в настоящем документе, авторы настоящего изобретения выявили, что для средства по настоящему изобретению не обязательно избегать антител подкласса IgG1 и модификации. В частности, данные, приведенные в этой патентной заявке, указывают на то, что средство по настоящему изобретению не проявляет существенного или длительного истощения CD4+ клеток или не индуцируют существенного высвобождения цитокинов по сравнению с антителами против CD3.

Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретения средство представляет собой немодифицированное антитело IgG1, т.е. антитело, которое не включает мутацию Fc и не подвергнуто дегликозилированию, модификации углеводной части или инженерии углеводной части для уменьшения взаимодействий с Fc-рецептором, или его фрагмент, или производное.

Антитела, которые наиболее эффективны для применения в настоящем изобретении, представляют собой гуманизированные антитела против CD4, или их фрагменты, или производные, которые способны активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки. Примеры антител, которые способны активировать CD4+CD25+ регуляторные T-клетки, рассмотрены в Becker et al. (European Journal of Immunology (2007), Vol. 37: pages 1217-1223).

Как правило, антитело по настоящему изобретению, кроме того, содержит константную область (Fc) человека. Эту константную область можно выбирать из константных доменов любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Предпочтительные константные области выбирают из константных доменов IgG, в частности IgG1.

Также в объем настоящего изобретения включены любые фрагменты антитела, содержащий его V-области. В частности, в объем изобретения включены Fab-, Fab'-, F(ab)'₂-, Fv- и scFv-фрагменты.

В особенно предпочтительном аспекте настоящего изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело против CD4 или его фрагмент или производное, полученное из моноклонального антитела против CD4 мыши B-F5. Примером такого антитела является антитело BT061.

Антитело BT061, его фрагменты и производные.

Гуманизированное антитело BT061 (hB-F5) получают из mAb B-F5 мыши, и оно имеет V-д