Средство для лечения заболевания

Средство для лечения заболевания

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к лечению аутоиммунных заболеваний. Изобретение относится к средству, такому как гуманизированное моноклональное антитело с длительным эффектом, которое при лечении можно вводить пациентам менее часто, чем описано ранее. Средство особенно полезно для пациентов, имеющих заболевания или признаки, которые не могут быть устранены за короткий период времени или требуют неопределенного периода времени лечения для эффективного купирования симптомов. Изобретение предусматривает применения и способы лечения с использованием композиций и лекарственных средств, содержащих такое средство.

Аутоиммунитет означает неспособность организма распознавать свои собственные составные части (ниже субмолекулярных уровней) как «свое», что приводит к иммунной реакции против своих собственных клеток и тканей. Любое заболевание, которое возникает в результате такой аномальной иммунной реакции, называют аутоиммунным заболеванием. Аутоиммунные заболевания включают рассеянный склероз (MS), ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатический артрит, язвенный колит, болезнь Крона, тяжелую псевдопаралитическую миастению (MG), аутоиммунный полигландулярный синдром типа II (APS-II), тиреоидит Хашимото (НТ), диабет типа-1 (T1D), системную красную волчанку (SLE) и аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALS).

Аутоиммунное заболевание возникает в том случае, когда Т-клетки узнают и взаимодействуют с «собственными» молекулами, то есть молекулами, продуцируемыми клетками хозяина. Активация «аутореактивных» T-клеток в результате презентации аутоантигенов, процессированных антигенпрезентирующими клетками (APC), приводит к их клональной экспансии и миграции в специфичные ткани, где они индуцируют воспаление и разрушение тканей.

В норме T-клетки толерантны по отношению к аутологичной ткани и реагируют только на презентацию гетерологичных структур. Центральная толерантность и периферическая толерантность включают в себя два механизма, посредством которых иммунная система препятствует индукции вредных функций аутореактивных T-клеток. Центральная толерантность опосредована негативной селекцией. Указанный процесс вызывает опосредованную клональной делецией элиминацию аутореактивных T-клеток во время онтогенетического развития в тимусе.

Периферическая толерантность является резервом, действующим в том случае, если центральная толерантность недостаточна и аутореактивные клетки покидают тимус. Такой механизм толерантности работает непрерывно в течение жизни, удерживая аутореактивные клетки под контролем посредством иммунологического игнорирования (анергии), периферической делеции и/или активной супрессии.

Регуляторные T-клетки (T-рег, ранее также называемые «супрессорными клетками») в качестве части активной супрессии поддерживают периферическую толерантность и регулируют аутоиммунитет (Suri-Payer et al., J Immunol. 157: 1799-1805 (1996); Asano et al., J Exp. Med. 184:387-396 (1996); Bonomo et al., J. Immunol. 154: 6602-6611 (1995); Willerford et al., Immunity 3: 521-530 (1995); Takahashi et al., Int. Immunol. 10: 1969-1980 (1998); Salomon et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Read et al., J Exp. Med. 192: 295-302 (2000). В общем, регуляторные T-клетки ингибируют активацию и/или функцию эффекторных клеток T-хелперов типа 1 (TH1) и TH2. Дисрегуляция частоты или функционирования клеток T-рег может приводить к инвалидизирующим аутоиммунным заболеваниям (Baecher-Allan et al., Immunol. Review 212: 203-216 (2006); Shevach, Annu. Rev. Immunol. 18: 423-449 (2000); Salomon et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 182: 18-32 (2001)).

Охарактеризовано несколько подгрупп регуляторных T-клеток. Семейство T-рег состоит из двух ключевых подгрупп: естественно появляющиеся клетки, например, T-рег CD4⁺CD25⁺, и периферически индуцируемые, T-рег Tr1 и Th3. Кроме того, описаны NK-T-рег и CD8⁺-T-рег у человека и грызунов (Fehervari et al., J. Clin. Investigation 114: 1209-1217 (2004)).

Полученные из тимуса клетки T-рег (естественные CD4⁺CD25⁺ T-рег) являются основными регуляторными клетками, вовлеченными в регуляцию аутоиммунитета или патогенных иммунных реакций.

i) они представляют собой T-клетки CD4⁺ и составляют 5-10% периферических T-клеток CD4⁺;

ii) они созревают в тимусе;

iii) они обычно характеризуются совместной экспрессией рецептора IL-2 (CD25), низкомолекулярной изоформы молекулы CD45, CD152 (CTLA-4) и фактора транскрипции FoxP3.

Роль T-рег лучше всего проиллюстрирована в экспериментах, которые заключаются в восстановлении иммунодефицитных мышей nude с использованием клеток CD4⁺, которые были истощены по клеткам CD25⁺. У восстановленных мышей CD4⁺CD25^- развивались различные органоспецифичные аутоиммунные заболевания, такие как гастрит, оофорит, орхит и тиреоидит (Suri-Payer et al., J. Immunol. 160: 1212-1218 (1998)).

Включение подгруппы CD4⁺CD25⁺ в эксперименты по восстановлению мышей nude предотвращает появление таких заболеваний (Sakaguchi et al., J. Immunol. 155: 1151-1164 (1995)). Защитное значение клеток CD4⁺CD25⁺ против органоспецифичного аутоиммунитета также показано на нескольких других моделях аутоиммунитета (например, аутоиммунный гастрит, простатит, оофорит, гломерулонефрит, эпидидимит и тиреоидит), вызванного неонатальной тимэктомией, осуществляемой через 3 дня после рождения (d3Tx), или воспалительного заболевания кишечника, вызванного путем разведения мышей SCID с использованием клеток T-клеток CD45RBhigh, CD4⁺CD25^-. Введение анти-CD25-антитела in vivo у мышей также индуцирует органоспецифичное локализованное аутоиммунное заболевание.

Открытие важного значения транскрипционного регулятора FoxP3 в функционировании регуляторных T-клеток CD4⁺D25⁺ мышей и предыдущие наблюдения того, что пациенты с синдромом IPEX (X-сцепленный синдром иммунной дисрегуляции с полиэндокринопатией и энтеропатией), тяжелым воспалительным заболеванием, сходным с заболеванием, наблюдаемым у мышей с дефицитом регуляторных клеток CD4⁺CD25⁺ (синдром scurfy), имеют мутации в FoxP3, показали прямую корреляцию между аутоиммунной моделью на животных, мышиными регуляторными T-клетками и аутоиммунным заболеванием человека (Sakaguchi et al., J. Immunol. 155: 1151-1164 (1995)).

Фармацевтический механизм регуляторных T-клеток не полностью выяснен. T-рег CD4⁺CD25⁺ ингибируют активацию поликлональных и антигенспецифичных T-клеток. Супрессия опосредована зависимым от клеточных контактов механизмом, который требует активации T-рег CD4⁺CD25⁺ посредством TCR, но T-рег не дают пролиферативного ответа при активации TCR или стимуляции митогенными антителами (анергические) (Shevach, Nature Rev. Immunol. 2: 389 (2002). После стимуляции они становятся компетентными в отношении супрессии независимым от антигенов образом ответа T-клеток CD4⁺ и T-клеток CD8⁺, а также ингибирования активации B-клеток и их клональной экспансии.

Имеются дополнительные данные, свидетельствующие о том, что супрессорная активность T-рег CD4⁺CD25⁺ отчасти также основана на противовоспалительных цитокинах, подобных TGF-β (Kingsley et al., J. Immunol. 168: 1080 (2002); Nakamura et al., J. Exp. Med. 194: 629-644 (2001)). Функциональная значимость секреции TGF-β дополнительно подтверждена данными о том, что у мышей, дефицитных по TGF-β, развивается аутоиммунное заболевание и что введение нейтрализующих антител к TGF-β отменяет in vivo предотвращение аутоиммунитета или индуцирующей толерантность активности T-клеток CD4⁺ в некоторых моделях.

В подгруппе T-клеток CD4⁺ могут существовать по меньшей мере 2 различающихся типа клеток с супрессорной функцией, которые индуцируются после воздействия специфичного экзогенного антигена (называемые «адаптивными или индуцируемыми регуляторными T-клетками»): регуляторные T-клетки типа 1 (Tr1) клетки и клетки Th3. Указанные типы клеток, по-видимому, можно отличить от T-рег CD4⁺CD25⁺ на основании профилей продукции цитокинов. Однако взаимосвязь между указанными разными типами неясна и способы их действия перекрываются.

Клетки Tr1 индуцировали многократной стимуляцией TCR в присутствии IL-10, и было показано, что в основном осуществляют понижающую регуляцию иммунных реакций посредством продукции высоких уровней IL-10 вместе с умеренными количествами TGF-β (Chen et al., J. Immunol. 171: 733-744 (2003)).

Клетки Th3 (идентифицированные в модели EAE после пероральной доставки антигена) продуцируют высокие количества TGF-β и различные количества IL-4 и IL-10. Показано, что IL-4, сам по себе, является ключевым фактором дифференцировки клеток Th3, в отличие от клеток Tr1, которые дифференцируются IL-10 (Chen et al., Science 265: 1237-1240 (1994)).

Супрессия функции T-клеток в результате применения иммунодепрессивных лекарственных средств является основной терапевтической методикой, которую успешно применяли для лечения аутоиммунных заболеваний. Однако такие лекарственные средства индуцируют общую иммуносупрессию вследствие их плохой избирательности, что приводит к ингибированию не только опасных функций иммунной системы, но также и полезных функций. Как следствие могут возникать некоторые риски, подобные инфекции, злокачественной опухоли и лекарственной токсичности.

Средства, создающие помехи для функционирования T-клеток, являются терапевтической основой различных аутоиммунных заболеваний.

Способ применения средств с целью активации регуляторных T-клеток для терапии аутоиммунных заболеваний, как было показано до настоящего времени, чрезвычайно сложен. Активация T-рег посредством TCR с использованием агонистического анти-CD3-антитела OKT-3 (Abramowicz et al, N Engl. J Med. 1992 Sep 3;327(10):736) или посредством костимулирующей молекулы CD28 с использованием суперагонистического анти-CD28-антитела TGN 1412 приводит к полному истощению популяции регуляторных T-клеток, а также других подходящих T-клеток и системной индукции и высвобождению избыточных количеств провоспалительных цитокинов, включая IFN-γ, TNF-α, IL-1 и IL-2, приводя к клинически выраженному синдрому выброса цитокинов (CRS) у человека (Suntharalingam et al., N. Engl. J. Med. 2006 Sep 7; 355(10): 1018-28).

После первых двух-трех инъекций 5 мг моноклонального антитела OKT3 у большинства пациентов развивается синдром выброса цитокинов с высокими уровнями фактора некроза опухолей-альфа, интерлейкина-2 и гамма-интерферона, появляющихся в пределах 1-2 часов в кровообращении у реципиентов почечных трансплантатов. (Abramowicz et al., Transplantation, 1989 Apr; 47(4): 606-8). Это приводит к узкому терапевтическому окну, которое ограничивает применимость указанного антитела для лечения аутоиммунного заболевания.

Лечение суммарной дозой 5-10 мг TGN1412 (0,1 мг анти-CD28 на килограмм массы тела) приводит к системной воспалительной реакции с полиорганной недостаточностью в течение 90 минут после получения однократной внутривенной дозы TGN 1412 (Suntharalingam et al., N. Engl. J. Med. 2006 Sep 7; 355(10): 1018-28).

В общем, установлено, что T-клетки CD4 играют главную роль в инициации и поддержании аутоиммунитета. Соответственно было предложено применение мАт против поверхностных молекул T-клеток CD4 и, в частности анти-CD4-мАт, в качестве иммунодепрессантов. Хотя многочисленные клинические исследования подтвердили возможную пользу такого способа, в таких исследованиях также выявлено несколько проблем, связанных с получением анти-CD4-мАт, более подходящих для применения в обычной клинической практике.

Было предложено несколько разных механизмов действия CD4-мАт, включая: (1) антагонизм взаимодействий CD4-MHC II, приводящий к ингибированию активации T-клеток, (2) модулирование рецепторов CD4, которое определяют по снижению экспрессии CD4 на клеточной поверхности, (3) частичную передачу сигнала через рецептор CD4 в отсутствие перекрестного связывания T-клеточных рецепторов, которая может супрессировать последующую активацию T-клеток и запускать апоптозную гибель T-клеток CD4, (4) Fc-опосредованную зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) или зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC), приводящую к истощению T-клеток CD4, и (5) стимуляцию регуляторных T-клеток.

Fc-опосредованная зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC) или зависимая от антител клеточная цитотоксичность (ADCC), приводящая к истощению T-клеток CD4, является основным наблюдаемым механизмом и, в частности, показана для антител подкласса IgG1. Только несколько CD4-антител были отнесены к другим механизмам, подобные TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A, при этом только TRX-1 является IgG1 (Schulze-Koops et al., J. Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Mason et al., J. Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al., Rheumatology 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J. Immunol. 158(1): 94-103 (1997)).

Зависимое от дозы истощение T-клеток CD4⁺ при «высоких» дозах (несколько циклов с использованием доз >100 мг) и кратковременную секвестрацию (краткосрочное истощение) при «более низких» дозах (несколько циклов с использованием доз >10 мг) наблюдают при использовании нескольких CD4-антител (Mason et al., J. Rheumatol. 29 (2): 220-229 (2002); Kon et al., Eur. Respir J. 18(l):45-52 (2001)) и HuMax-CD4 (Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-1439 (2003), Choy et al., Rheumatology 41 (10): 1142-8 (2002)). Несмотря на свою активность в истощении популяций клеток, мАт к CD4 не способны обеспечить клиническую пользу и соответствующую эффективность при исследованных аутоиммунных заболеваниях, например ревматоидном артрите (Strand et al., Nature Reviews 6: 75-92 (2007)). Кроме того, обычно считают, что истощение T-клеток CD4⁺ представляет собой сценарий, который может вызывать тяжелую иммуносупрессию.

Антитело B-F5 (мышиный IgG1 против CD4 человека) испытывали при разных аутоиммунных заболеваниях.

Небольшое количество пациентов с тяжелым псориазом лечили мышиным B-F5-антителом, и были описаны некоторые положительные эффекты (Robinet et al., Eur. J. Dermatol. 1996: 6: 141-6, и Robinet et al., J. Am. Acad. Dermatol. 1997; 36: 582-8).

У пациентов с ревматоидным артритом наблюдаемые результаты в плацебоконтролируемом испытании с использованием ежедневной дозы B-F5 не показали значимого улучшения (Wendling et al. J. Rheumatol.; 25(8): 1457-61, 1998).

У пациентов с рассеянным склерозом (MS) наблюдали некоторые позитивные эффекты после 10-дневного лечения у пациентов с рецидивирующими-ремитирующими формами, некоторые из которых оставались без рецидивов на 6 месяцев после терапии (Racadot et al., J. Autoimmun., 6(6): 771-86, 1993). Сходные эффекты наблюдали Rumbach с соавторами (Mutt. Scler.; 1(4): 207-12, 1996).

При тяжелом заболевании Крона не наблюдали значимого улучшения у пациентов, получающих B-F5 в течение 7 последовательных дней (Canva-Delcambre et al., Aliment Pharmacol. Ther. 10(5): 721-7, 1996).

В случае профилактики отторжения аллотрансплантата сообщалось, что биодоступность B-F5 была недостаточной, чтобы обеспечить его применение для профилактики отторжения аллотрансплантата (Dantal et al. Transplantation, 27; 62(10): 1502-6, 1996).

На основании вышесказанного очевидно, что первой проблемой, которую необходимо решить, является потребность в применении более длительных доз мАт, чтобы получить клиническое улучшение. В общем, длительное применение модифицирующих заболевание терапевтических средств приводит к увеличению числа неблагоприятных событий или утрате клинических эффектов, что делает необходимым увеличение дозы («нарастание дозы») для поддержания ответа (Strand et al., Nature Reviews Drug Discovery 6: 75-92, (2007)) вследствие иммуногенности. Чем меньше и/или менее часто нужно вводить модифицирующие заболевание терапевтические средства, тем ниже будут такие неблагоприятные эффекты, плюс будет иметь место немедленный полезный эффект для пациентов, которым требуются более низкие и/или меньшее количество доз терапевтических средств.

Другой недостаток терапии моноклональными антителами у человека заключается в том, что такие антитела обычно получают из клеток мышей, и они вызывают реакции против Ig мышей у людей-реципиентов. Это приводит не только к более низкой эффективности данного лечения и еще более низкой эффективности любого лечения мышиными моноклональными антителами в будущем, но также и к повышенному риску анафилаксии.

В принципе такого недостатка можно избежать благодаря применению гуманизированных антител, получаемых в результате прививки определяющих комплементарность областей (CDR) мышиного моноклонального антитела, которые определяют специфичность связывания антигена, в каркасные области (FR) молекулы иммуноглобулина человека. Целью гуманизации является получение рекомбинантного антитела, обладающего такими же антигенсвязывающими свойствами, как и мышиное моноклональное антитело, из которого получены области CDR, и намного менее иммуногенного у человека.

В некоторых случаях замена областями CDR из мышиного антитела CDR человека в каркасах человека достаточна для переноса антигенсвязывающих свойств (включая не только специфичность, но также и аффинность по отношению к антигену). Однако во многих антителах некоторые остатки FR важны для связывания антигена, поскольку они непосредственно контактируют с антигеном в комплексе антитело-антиген или поскольку они влияют на конформацию CDR и, следовательно, их эффективность в связывании антигена.

Таким образом, в большинстве случаев также необходимо заменять одним или несколькими остатками каркаса из мышиного антитела соответствующие остатки FR человека. Так как количество заменяемых остатков должно быть небольшим, насколько это возможно, чтобы предотвратить реакции против Ig мыши, то проблема состоит в том, чтобы определить, какой аминокислотный остаток (остатки) важен для сохранения антигенсвязывающих свойств. Были предложены различные способы прогнозирования более подходящих сайтов для замены. Хотя такие способы предлагают общие принципы, которые могут оказать некоторую помощь на первых этапах гуманизации, конечный результат варьирует от одного антитела к другому. Таким образом, для данного антитела очень трудно предсказать, какие замены будут обеспечивать требуемый результат.

Ранее были предприняты попытки гуманизации мышиного B-F5, и был достигнут успех в получении гуманизированного B-F5 (далее называемого hB-F5), обладающего свойствами связывания CD4, сходными со свойствами исходного мышиного B-F5.

Таким образом, в заявке WO 2004/083247 указано, что было обнаружено, что гуманизированное антитело BT061 (гуманизированное B-F5 или просто hB-F5) применимо для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз и ревматоидный артрит. Указанное антитело представляет собой антитело, которое способно активировать регуляторные T-клетки CD4⁺CD25⁺. В заявке на выдачу патента раскрыты композиции для парентерального введения, приготовленные так, чтобы обеспечить введение дозы 0,1-10 мг, предпочтительно 1-5 мг. Предполагаемые схемы дозирования представляют собой внутривенное введение дозы 1 мг в сутки и дозы 5 мг через день пациентам с ревматоидным артритом в течение периода времени 10 дней.

Исследование также описано Wijdenes с соавторами в реферате и стендовом докладе, представленном на конференции EULAR в июне 2005. Описано лечение 11 пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Пациентов лечили с использованием 5 внутривенных инфузий по 5 мг BT061 через день с сопутствующим лечением 150 мг диклофенака.

Антитело, описанное в настоящем исследовании, не раскрыто как подходящее для применения в более высоких дозах или более длительных дозах, и все еще требуется найти средства лечения с использованием более длительно действующих доз, так чтобы лечить большее число пациентов.

Регуляторные T-клетки CD4⁺CD25⁺ способны поддерживать периферическую толерантность и регулировать аутоиммунитет, ингибируя пролиферацию и продукцию цитокинов антигенспецифичных T-клеток CD4⁺ и CD8⁺.

Предыдущие исследования на мышах показали, что мышиные T-клетки CD4⁺CD25⁺ супрессируют как пролиферацию, так и продукцию IFN-γ T-клетками CD8⁺, индуцированными либо поликлональными, либо Аг-специфичными стимулами. Кроме того, T-клетки CD4⁺CD25⁺ ингибируют активацию клеток-респондеров CD8⁺ как посредством ингибирования продукции IL-2, так и посредством повышающей регуляции экспрессии IL-2Rα-цепи (CD25) (Piccirillo et al., J. Immunol. 167: 1137-1140 (2001)). В отличие от регуляторных T-клеток обычные T-клетки экспрессируют CD25 только при активации иммуногенным стимулом.

У человека T-клетки CD4⁺CD25⁺, предварительно активированные анти-CD3- или анти-CD28-антителом, влияют на T-клетки CD8⁺, приводя к пониженной пролиферации в ответ на поликлональную и аллогенную стимуляцию и к пониженной продукции IFN-γ. Супрессированные T-клетки CD8⁺ сохраняют свой анергический фенотип, несмотря на многократные повторные стимуляции родственным антигеном и IL-2 в течение периода времени, составляющего до 3 недель (Camara et al., Eur. J. Immunol. 33: 3473-3483 (2003), Dieckman et al., Immunology. 115(3): 305-14 (2005)).

Учитывая описанный выше уровень техники, целью настоящего изобретения является лечение пациентов, имеющих аутоиммунные заболевания, меньшим количеством и/или более низкими дозами. В частности, целью настоящего изобретения является поиск средств лечения, которые можно применять на пациентах менее часто в ходе длительной терапии, чтобы минимизировать количество инъекций, необходимых для получения клинической пользы.

Удивительно, что авторы изобретении наблюдали, что BT061 специфично стимулирует T-рег CD4⁺CD25⁺, которые подавляют пролиферацию T-клеток CD8⁺ посредством ингибирования продукции IL-2 и IFN-γ аллореактивными T-клетками CD8⁺. Кроме того, предварительно BT061-активированные T-рег CD4⁺CD25⁺ делают супрессированные T-клетки CD8⁺ неспособными экспрессировать CD25 при рестимуляции вплоть до 10 дней, впервые обеспечивая возможность долговременного терапевтического эффекта при лечении пациентов таким антителом, так как экспрессия CD25 является одним из признаков активации таких T-клеток CD8⁺. Следовательно, неспособность экспрессировать CD25 приводит к уменьшению нежелательной активации иммунной системы.

Соответственно, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного заболевания, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и средство, способное активировать регуляторные T-клетки CD4⁺CD25⁺, при этом композицию вводят субъекту не чаще, чем каждые 3 дня.

Предпочтительно период между введениями составляет по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 12 недель, по меньшей мере двадцать четыре недели, по меньшей мере 6 календарных месяцев или по меньшей мере год. В одном варианте период лечения составляет более чем один год, и композицию вводят ежегодно в течение периода времени, составляющего 1, 2, 3, 4 или 5 лет.

В частности, композицию необходимо вводить не больше чем каждые 6 дней, предпочтительно не больше чем каждые 10 дней. Обычно лекарственное средство можно вводить субъекту каждые 3-31 день, более предпочтительно каждые 3-10 дней или каждые 3-6 дней.

Долговременный характер терапии особым образом не ограничен при условии, что терапия продолжается не дольше, чем период времени, необходимый для немедленного/острого лечения данного пациента. Однако предусмотрены периоды времени, составляющие по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 18 месяцев, 2 года и 5 лет, а также неопределенные периоды (например, в течение жизни пациента, или вплоть до исцеления пациента, или до тех пор, пока симптомы больше не будут проявляться).

При лечении пациентов средством, способным активировать регуляторные T-клетки CD4⁺CD25⁺, может быть продемонстрирован как немедленный эффект, так и долговременный терапевтический эффект. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, предполагают, что это является следствием того факта, что средство стимулирует T-рег CD4⁺CD25⁺, которые не только непосредственно ингибируют T-клетки CD8⁺, но также делают T-клетки CD8⁺ не способными экспрессировать CD25 при рестимуляции. Читается, что долговременные эффекты дополнительно опосредованы сочетанием эффективности при низких уровнях и медленным снижением эффективной концентрации антитела, получаемого в клинической ситуации, приводящим к более длительным периодам наличия эффективного уровня средства.

Из приведенных выше схем будет понятно, что авторы изобретения неожиданно обнаружили, что гуманизированное антитело BT061 (гуманизированное B-F5 или просто hB-F5) по существу не модулирует и не индуцирует высвобождение провоспалительных цитокинов по сравнению с другими взаимодействующими с T-клетками антителами (например, анти-CD3-антителами), а стимулирует T-рег CD4⁺CD25⁺, которые непосредственно ингибируют T-клетки CD8⁺ плюс также делают T-клетки CD8⁺ не способными экспрессировать CD25 при рестимуляции. На основании проведенного авторами изобретения исследования дозы могут быть введены с большими интервалами и в течение намного более длительного периода, чем описано ранее в WO 2004/083247.

Концентрация средства особым образом не ограничена, при условии что оно присутствует в концентрации, которая является подходящей для пациента. Однако в случае высоких доз предпочтительно концентрация средства составляет от 10 до 150 мг/мл, от 15 до 150 мг/мл, от 15 до 100 мг/мл, от 15 (или больше, чем 10) до 75 мг/мл или от 20 до 60 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация средства имеет (примерно) любое одно из следующих значений: 10 мг/мл, 12,5 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл или 100 мг/мл.

В альтернативных предпочтительных вариантах в случае более низких доз концентрация средства составляет от 0,1 мкг/мл до 30 мг/мл или от 0,1 до 1000 мкг/мл и более предпочтительно 1-500 мкг/мл и 2-250 мкг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация средства имеет (примерно) любое одно из следующих значений 15 мкг/мл, 25 мкг/мл, 125 мкг/мл, 250 мкг/мл или 500 мкг/мл, 1 мг/мл, 12,5 мг/мл или 25 мг/мл. Изобретение также относится к применению средства, которое определено в настоящем описании, для производства лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания, при этом средство необходимо вводить субъекту по схеме дозирования, описанной в настоящей публикации. Кроме того, изобретение относится к средству, которое определено в настоящем описании, для применения при лечении аутоиммунного заболевания, при этом средство необходимо вводить субъекту по схеме дозирования, описанной в настоящей публикации.

Объем дозы, применяемый для субъекта при использовании композиции, особым образом не ограничен при условии, что ее доставляют в течение длительного периода времени по сравнению с уже известными схемами, и, следовательно, она подходит для лечения людей, которым может быть полезна длительная терапия, таким как, без ограничения, пациенты с тяжелыми случаями с длительной историей болезни и неудовлетворительной реакцией на современную терапию. Концентрация средства в определенных объемах доз может варьировать, чтобы обеспечить требуемые дозы, которые описаны в настоящей заявке.

Объем дозы будет варьировать в зависимости от способа введения. Предпочтительно парентеральное введение. Примерами парентерального введения являются внутримышечное введение, внутривенное введение или подкожное введение. В том случае, когда композицию необходимо ввести посредством внутривенной инфузии, объем дозы может составлять от 0,1 или 0,5 мл до 500 мл, предпочтительно от 15 до 25 мл и обычно около 20 мл. В том случае, когда композицию необходимо ввести путем подкожной или внутримышечной инъекции, объем дозы может составлять от 0,1 до 3 мл, предпочтительно от 0,5 до 1,5 мл и, обычно, около 1 мл.

Однако в некоторых вариантах композиция может быть представлена в концентрированной форме и разбавлена в такой степени, которая необходима для пациентов, подвергаемых лечению. Предпочтительно, в таких ситуациях композиция представлена в сравнительно небольших объемах около 1, 2, 3, 4 или 5 мл. В альтернативных вариантах композиция представлена в требуемой концентрации и объеме дозы, описанной выше (т.е., в готовой для введения форме). В одном конкретном варианте фармацевтические композиции для подкожного введения приготовлены в готовой для введения форме, которая не требует разбавления, так что их без труда может ввести немедицинский персонал.

Как указано ранее, не было известно, что средства, способные лечить аутоиммунные заболевания, можно вводить в ходе длительной терапии с низкой частотой, как предполагается в настоящем изобретении. Хотя известные дозы средств, способных лечить аутоиммунное заболевание, эффективны у некоторых людей или при определенных типах заболевания, реализация того, что они могут быть эффективны в течение более длительных периодов времени и переносимы в течение более длительных периодов, открыла путь для более эффективного лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и классов пациентов.

Изобретение будет проиллюстрировано только в виде примера со ссылкой начертежи, на которых показано следующее:

На фигуре 1 показано влияние BT061 на синтез цитокинов в культуре цельной крови, полученной от 3 здоровых доноров. Культуры стимулировали в нескольких экспериментах 4 разными типами активаторов: CD3 = анти-CD3-антитела; LPS = липополисахарид; ФГА = фитогемагглютинин + анти-CD28-антитела; SEB = стафилококковый энтеротоксин B + анти-CD28-антитела. Определяли разные цитокины, чтобы измерить влияние на разные субпопуляции лейкоцитов: T-рег-клетки (CD3: TGF-β, IL-10); моноциты/макрофаги (LPS: IL-10, TNFα, IL-1β); Th2-клетки (PHA: IL-4, IL-5, IL-13); Th1-клетки (SEB: IL-2, IFNγ).

На фигуре 2 показано влияние BT061 в культурах цельной крови человека (доноры с ревматоидным артритом) на синтез цитокинов, запускаемый разными стимулами.

На фигуре 3 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая V_H-область мышиного B-F5 (SEQ ID NO: 5).

На фигуре 4 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая V_κ-область мышиного B-F5 (SEQ ID NO: 6).

На фигуре 5 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3) фрагмента плазмиды, кодирующего V_H-область гуманизированного BF-5. Последовательность, кодирующая V-область, подчеркнута, и соответствующая полипептидная последовательность (SEQ ID NO: 17) показана под нуклеотидной последовательностью.

На фигуре 6 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 4) фрагмента плазмиды, кодирующей V_K-области гуманизированного BF-5. Последовательность, кодирующая V-область, подчеркнута, и соответствующая полипептидная последовательность (SEQ ID NO: 2) показана под нуклеотидной последовательностью.

На фигуре 7 показано, что активированные BT061 (анти-CD4-мАт) клетки T-рег CD25⁺ подавляют синтез цитокинов и реэкспрессию CD25 T-клеток CD8⁺. Вверху: CD4-активированные T-рег CD25⁺ подавляют синтез цитокинов коактивированных T-клеток CD8⁺. Внизу: CD4- активированные T-рег. CD25⁺ подавляют реэкспрессию CD25 T-клеток CD8⁺. На диаграмме показаны только пропускаемые при сортировке T-клетки CD8⁺. Показан типичный результат из трех. Числами указано процентное содержание позитивных клеток.

На фигурах 8A и 8B соответственно показано высвобождение TFNα и IL-6, наблюдаемое в клиническом испытании BT061 (однократная внутривенная инфузия или подкожная инъекция) у здоровых добровольцев по сравнению с уровнями, сообщенными для случая использования моноклональных анти-CD3-антител. На фигурах представлены уровни доз и время для восстановления. Результаты для TRX4, обозначенные на фигурах в виде «2)», описаны в Keymeulen et al., 2005 N. Engl. J. Med. Пациенты с диабетом типа 1. Результаты для теплизумаба, обозначенные на фигурах в виде «3)», описаны в Herold et al., 2002 N. Engl. J. Med. Пациенты с диабетом типа I. Нормальные значения, указанные на фигурах в виде «4)», описаны в Straub et al., 2007, Athr. & Rheumat. «*)» означает однократную дозу, «**)» означает суммарную дозу, инъецированную вплоть до достижения пиковой концентрации.

На фигуре 9 показаны уровни в плазме IL-2 и IFN-γ после введения однократной внутривенной или подкожной дозы BT061 у здоровых добровольцев. ULN = верхняя граница нормы; LLN = нижняя граница нормы.

На фигуре 10 показана кинетика подсчета клеток CD4 (клеток в миллилитре плазмы) у добровольцев, которых лечили с использованием однократной внутривенной дозы BT061. Показаны средние значения для 3 пациентов на группу дозирования. Пунктирные линии показывают верхнюю границу нормы (ULN) и нижнюю границу нормы (LLN).

На фигуре 11 показана кинетика подсчета клеток CD4 (клеток в миллилитре плазмы) у добровольцев, которых лечили с использованием однократной подкожной дозы BT061. Показаны средние значения для 3 пациентов на группу дозирования. Пунктирные линии показывают верхнюю границу нормы (ULN) и нижнюю границу нормы (LLN).

На фигуре 12, части A-H, представлены графики, показывающие данные клинических испытаний на пациентах с псориазом группы дозирования I, которые описаны в примере 8, в которых пациентов лечили с использованием внутривенной инъекции 0,5 мг BT061 или плацебо. Части A-H фигуры 8 представляют собой графики оценки индекса охвата и тяжести псориаза (PASI) у пациентов 1-8 группы дозирования I, соответственно.

На фигуре 13, части A-H, представлены графики, показывающие данные клинических испытаний на пациентах с псориазом группы дозирования II, которые описаны в примере 8, в которых пациентов лечили с использованием внутривенной инъекции 2,5 мг BT061 или плацебо. Части A-H фигуры 9 представляют собой графики оценки PASI у пациентов 1-8 группы дозирования II, соответственно.

На фигуре 14, части A и B, представлены фотографии, сделанные при клинических испытаниях на пациентах с псориазом, которые описаны в примере 8. Фотографии одного и того же пациента, который был представителем группы дозирования II. Фотография, показанная в части A, была сделана до лечения. Фотография, показанная в части B, была сделана через 28 дней после лечения.

На фигуре 15 представлены результаты клинического испытания на пациентах с ревматоидным артритом, которое описано в примере 9. На фигуре показана гистограмма процента пациентов из групп дозирования, подкожно получавших 1,25 мг, 6,25 мг, 12,5 мг и 25 мг BT061, достигающих, по меньшей мере, ответа ACR20. Шесть пациентов в каждой группе получали дозу антитела, а два пациента получали плацебо.

На фигуре 16A и 16B представлены результаты клинического испытания на пациентах с ревматоидным артритом, которое описано в примере 9. На фигуре 16A показана гистограмма количества болезненных суставов у пациентов из группы дозирования, получавшей 25 мг BT061 подкожно. На фигуре 16B показана гистограмма количества распухших суставов у пациентов из той же самой группы дозирования. Шесть пациентов в каждой группе получали дозу антитела, а два пациента получали плацебо.

На фигуре 17A и 17B представлены результаты клинического испытания на пациентах с ревматоидным артритом, которое описано в примере 9. На фигурах показаны изменения индивидуальных параметров (в %) для одного отвечающего пациента (фигура 17A) и одного не отвечающего пациента (фигура 17B) из группы, получавшей дозу 25 мг подкожно. На фигурах обозначения «ГО пациента» и «ГО врача» относятся к глобальной оценке пациентом и глобальной оценке врачом соответственно. Термин «ОП боли» относится к оценке боли пациентом.

На фигуре 18A и 18B представлены дополнительные результаты клинического испытания на пациентах с ревматоидным артритом, которое описано в примере 9. На фигурах показано количество болезненных суставов у пациентов из группы, получавшей дозу 1,25 мг подкожно (фигура 18A), и из группы, получавшей дозу 6,25 мг подкожно (фигура 18B).

На фигуре 19A и 19B представлены дополнительные результаты клинического испытания на пациентах с ревматоидным артритом, которое описано в примере 9. На фигурах показано количество болезненных суставов у пациентов из группы, получавшей подкожную дозу 50 мг (фигура 19A), и из группы, получавшей внутривенную дозу 6,25 мг (фигура 19B).

На фигуре 20 показано выравнивание полипептидных последовательностей V_K мышиного B-F5 (SEQ ID NO: 8), FK-001 (SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12), L4L (SEQ ID NO: 18) и L4M (SEQ ID NO: 2) при конструировании гуманизированной формы B-F5 (т.е. BT061).

На фигуре 21 показано выравнивание полипептидных последовательностей V_H мышиного B-F5 (SEQ ID NO: 7), M26 (SEQ ID NO: 13, 14, 15 и 16), H37L (SEQ ID NO: 1) и H37V (SEQ ID NO: 17) при конструировании гуманизированной формы B-F5.

Далее изобретение будет описано более подробно.

Средствами, которые являются подходящими для применения в настоящем изобретении, являются средства, которые способны активировать регуляторные T-клетки CD4⁺CD25⁺. Средство может представлять собой полипептид, белок или антитело. В том случае, когда средство представляет собой антитело, оно может быть моноклональным антителом. Предпочтительно антитело является моноклональным анти-CD4-антителом. Антитело также предпочтительно может представлять собой IgG1-антитело и может быть немодифицированным IgG1-антителом.

В предпочтительном аспекте изобретения средство не вызывает зн