Молекула, специфически связывающаяся с rsv

Молекула, специфически связывающаяся с rsv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к областям биологии и медицины.

Респираторный синцитиальный вирус (respiratory syncytial virus, RSV) представляет собой вирус простуды, принадлежащий к семейству парамиксовирусов. RSV вирулентен, легко передается и является наиболее распространенной причиной заболеваний нижних дыхательных путей у детей младше двух лет. За один сезон RSV инфицирует до 98% детей, посещающих детские сады. Госпитализация требуется 0,5-3,2% детей, инфицированных RSV. В США зарегистрировано примерно 90000 госпитализаций и 4500 смертей в год. Основными факторами риска госпитализации по причине RSV являются преждевременные роды, хроническое заболевание легких, врожденное заболевание сердца, сниженный иммунитет и возраст менее 6 недель у детей, не имеющих других заболеваний. Не существует эффективного лечения RSV-положительного бронхиолита, помимо поддерживающей терапии в виде адекватного питания и кислородной терапии. Эффективность противовирусных терапий, таких как рибавирин, в случае инфекции RSV показана не была. Для профилактики инфекции RSV зарегистрировано одно моноклональное антитело паливизумаб (также называемое Синагис). Паливизумаб представляет собой генетически сконструированное (гуманизированное) моноклональное антитело к слитому белку (белок F) RSV. Белок F RSV представляет собой мембранный белок вируса, отвечающий за слияние вириона с клеткой-хозяином после прикрепления. Кроме того, белок F способствует инфекции соседних клеток путем образования синцития. Считается, что его функция зависит от исходной олигомерной структуры белка. Однако паливизумаб не всегда оказывается эффективным. Таким образом, в области техники существует потребность в альтернативных и/или дополнительных антителах и терапиях против RSV.

Целью настоящего изобретения является разработка улучшенных антител против RSV или функциональных аналогов таких антител. Другой целью является разработка дополнительных антител против RSV, обеспечивающих синергический эффект в комбинации с существующими антителами, специфичными к RSV. Дальнейшей целью изобретения является разработка человеческих или гуманизированных антител или функциональных эквивалентов против белка F RSV, направленных против эпитопа, отличающегося от эпитопа, против которого направлены известные антитела, специфичные к RSV.

Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу, способному специфически связываться с респираторным синцитиальным вирусом и содержащему:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности KLSIH (SEQ ID NO: 4), и/или

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO: 8), и/или

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO: 12), и/или

- последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO: 20), и/или

- последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GASSRAT (SEQ ID NO: 24), и/или

- последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности LSSDSSI (SEQ ID NO: 28).

Настоящее изобретение относится к антителу, обозначенному "AM22", у которого последовательность тяжелой и легкой цепей представлены на фиг.2. В частности, последовательности областей CDR АМ22, определяющих антигенсвязывающие свойства АМ22, также представлены на фиг.2. Антитело АМ22 полностью человеческое, способно специфически связываться с RSV (фиг.3) и, таким образом, является предпочтительным для терапевтического и/или профилактического применения в отношении индивидов-людей.

Как указано выше, паливизумаб является единственным клинически используемым антителом против RSV. Паливизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против эпитопа в антигенном сайте белка F RSV. Однако гуманизированные антитела все же содержат часть мышиного антитела, и хотя их иммуногенные свойства снижены по сравнению с мышиными антителами, тем не менее при введении человеку гуманизированных антител могут наблюдаться побочные эффекты. Авторам настоящего изобретения удалось получить и культивировать В-клетки человека, продуцирующие RSV-специфичные антитела, так что представленные RSV-специфичные антитела человека обладают сильно пониженной или вообще не обладают иммуногенной активностью из-за полностью человеческой последовательности. Как показано в примерах, антитела, представленные в изобретении, превосходят по своим характеристиками паливизумаб (фиг.1 и таблица 1). Авторы настоящего изобретения показали, что у хлопковых крыс (Sygmodon hispidus), получавших антитела по изобретению путем внутримышечной инъекции с последующей интраназальной нагрузкой RSV-X, наблюдался более низкий индекс патологии, чем у хлопковых крыс, получавших паливизумаб с последующей нагрузкой RSV-X (фиг.4С и таблица 2). Индекс патологии, используемый в настоящем документе, представляет собой сумму величин трех индивидуальных показателей повреждения легких. Эти три показателя представляют собой гипертрофию эпителия бронха и бронхиол, воспаление, вокруг бронхов и бронхиол (перибронхит/перибронхиолит) и воспаление в альвеолах (альвеолит). Кроме того, у хлопковых крыс, получавших внутримышечно антитела по изобретению с последующей нагрузкой RSV-X, наблюдался более низкий титр вируса, чем у хлопковых крыс, получавших паливизумаб с последующей нагрузкой RSV-X (фиг.4В). Титр вируса определяли с помощью теста TCID₅₀ (доза, инфицирующая 50% клеточной культуры). Таким образом, по сравнению с паливизумабом, АМ22 является предпочтительным.

Помимо паливизумаба, известны еще несколько RSV-специфичных антител. В WO 2008/147196 описаны последовательности молекул, связывающих RSV, в частности антител D25, AM14, AM16 и AM23. Как подробно описано в примере 1 настоящей заявки, RSV-специфичное антитело AM22 было получено от того же донора, что и антитела D25, AM14, AM16 и AM23. Однако оказалось, что АМ22 распознает RSV более эффективно, чем все остальные антитела, полученные от того же донора. Значение IC₅₀ для АМ22, равное 1,15 нг мл^-1, ниже такового для паливизумаба, D25, AM14, AM16 или AM23. Следовательно, применение АМ22 для лечения и/или профилактики нарушения, связанного с RSV, является предпочтительным по сравнению с использованием других RSV-специфичных антител. Для достижения эффекта, сравнимого с эффектом других антител, необходимо меньшее количество АМ22. Следовательно, для лечения и/или профилактики нарушения, связанного с RSV, индивиду потребуется вводить меньшее количество АМ22. Альтернативно, при использовании того же количества АМ22, что и других антител, достигается более эффективное лечение и/или профилактика нарушения, связанного с RSV.

Далее, эпитоп, распознаваемый RSV-специфичным антителом по настоящему изобретению, отличается от эпитопов, распознаваемых ранее раскрытыми молекулами, связывающимися с RSV. АМ22, так же как и ранее описанные антитела (WO 2008/147196), способно связываться с белком F RSV (фиг.3А). Однако АМ22 не связывается с мономерным белком F RSV (фиг.3В, левая и правая панели). В отличие от АМ22, известные антитела паливизумаб и АМ16 (раскрытые в WO 2008/147196 и на фиг.3В) способны связываться с мономерной формой белка F. Следует отметить, что В-клетки линии АМ22, экспрессирующие антиген-специфический В-клеточный рецептор (BCR), не распознают рекомбинантную форму белка F (фиг.3С). Таким образом, эпитоп белка F для АМ22 отличается от эпитопов для паливизумаба, D25, AM23 и АМ16. При экспрессии белка F в векторе, содержащем мотив тримеризации "изолейциновой молнии" и 8 HIS-тагов (ILZ-8xHIS), АМ22 распознавало эту структуру, зависимую от тримерной конформации (фиг.3D). В то же время, АМ14 не распознавало ни мономерную форму белка F, ни белок ILZ-8xHIS. Таким образом, эпитоп, с которым связывается АМ22, отличается и от эпитопа, с которым связывается АМ14. Было также обнаружено, что АМ22 не нарушало связывания D25 или паливизумаба с клетками Hep2, инфицированными RSV. Таким образом, эпитоп белка F, с которым связывается АМ22, отличается от эпитопов, с которыми связываются D25, AM14, AM16, AM23 и паливизумаб. Следовательно, предпочтительно, комбинировать RSV-специфичные антитела или их функциональные эквиваленты по настоящему изобретению с уже известными RSV-специфичными антителами, такими как паливизумаб, D25, AM14, AM16 и AM23. При комбинировании антитела по настоящему изобретению с известным RSV-специфичным антителом в одной и той же схеме терапии распознаются два или более различных эпитопов RSV. В таком случае, возможно получить более сильный иммуногенный ответ на RSV. Далее, при комбинировании одного из известных RSV-специфичных антител с антителом АМ22 по изобретению можно добиться более высокой специфичности антител против RSV. При использовании такой комбинации, способной вызывать более сильный иммуногенный ответ и обладающей повышенной специфичностью к RSV, терапия и/или профилактика нарушения, связанного с RSV, будет более эффективной. Наконец, потребуется более низкая общая дозировка антител, поскольку АМ22 обладает повышенной способностью связываться с белком F по сравнению с паливизумабом, D25, AM14, AM16 и AM23, о чем свидетельствует его низкое значение IC₅₀, равное примерно 1,15 нг/мл.

Таким образом, в одном варианте осуществления представлены антитело или его функциональный эквивалент по изобретению, чье значение IC₅₀ составляет менее 1,25 нг/мл по данным теста нейтрализации in vitro, в котором клетки HEp-2 инфицируют вирусом RSV-A2. Предпочтительно, если значение IC₅₀ для указанного антитела или функционального эквивалента составляет менее 1,2 нг/мл, предпочтительно, от 0,5 нг/мл до 1,2 нг/мл. Кроме того, предпочтительно, если значение IC₅₀ для антитела или функционального эквивалента по изобретению ниже по меньшей мере в 120 раз, более предпочтительно, ниже по меньшей мере в 130 раз, чем значение IC₅₀ для паливизумаба по данным теста нейтрализации in vitro, в котором клетки HEp-2 инфицируют вирусом RSV-A2. Предпочтительно, если значение IC₅₀ для указанного антитела или функционального эквивалента составляет примерно 1,15 нг/мл. Таким образом, использование RSV-специфичного антитела или его функционального эквивалента по настоящему изобретению в комбинации с по меньшей мере одним доступным RSV-специфичным антителом приводит к более эффективному лечению и/или профилактике нарушения, связанного с RSV.

Функциональным эквивалентом антитела в настоящем документе называется функциональная часть, производное или аналог антитела. Функциональный эквивалент антитела, предпочтительно, представляет собой искусственное связывающее соединение, содержащее по меньшей мере одну последовательность CDR антитела.

Функциональной частью антитела называется часть, обладающая по меньшей мере одним таким же свойством, что и указанное антитело, качественно, но не обязательно количественно. Указанная функциональная часть способна связываться с тем же антигеном, что и указанное антитело, но не обязательно также сильно. Предпочтительно, если функциональная часть антитела содержит однодоменное антитело, одноцепочечное антитело, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), Fab-фрагмент или F(ab')₂-фрагмент.

Функциональным производным антитела называется антитело, измененное так, что по меньшей мере одно свойство - предпочтительно, антигенсвязывающее свойство - полученного соединения практически не меняется качественно, но не обязательно количественно. Производное можно получить различными способами, например, путем замены консервативных аминокислот, при которой аминокислотный остаток заменяют на другой остаток со сходными свойствами (размер, гидрофобность и др.) таким образом, что функционирование в целом не претерпевает значительных изменений.

Специалист в области техники может получить различные аналоги антитела, например, с использованием библиотеки пептидов или фагового дисплея. Такой аналог обладает по меньшей мере одним таким же свойством, как и указанное антитело, качественно, не необязательно количественно.

Антитело по изобретению, предпочтительно, представляет собой антитело человека. При использовании антител человека для профилактики и лечения человека снижается вероятность побочных эффектов из-за иммунологической реакции у индивида-человека на последовательности, не являющиеся человеческими. В другом варианте осуществления антитело, функциональная часть, производное или аналог по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. Гуманизированные антитела получают путем введения гипервариабельных доменов, не являющихся доменами человека, в антитела человека, что уменьшает иммуногенные свойства полученных антител по сравнению с антителами, которые являются полностью не человеческими. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело или функциональная часть, производное или аналог по изобретению представляет собой химерное антитело. Таким образом, искомые последовательности, например, искомый сайт связывания, может быть введен в антитело или функциональный эквивалент по изобретению.

Специалисту в области техники хорошо известно, что тяжелая цепь антитела представляет собой большую из двух видов цепей, составляющих молекулу иммуноглобулина. Тяжелая цепь содержит константные домены, а также вариабельный домен, который участвует в связывании с антигеном. Легкая цепь антитела представляет собой меньшую из двух видов цепей, составляющих молекулу иммуноглобулина. Легкая цепь содержит константный домен и вариабельный домен. Вариабельный домен вместе с вариабельным доменом тяжелой цепи участвует в связывании с антигеном.

Области, определяющие комплементарность (CDR), представляют собой гипервариабельные области, присутствующие в вариабельных доменах тяжелых цепей и легких цепей. Области CDR тяжелой цепи и связанной с ней легкой цепи антитела вместе образуют сайт связывания антигена.

Поскольку в настоящем изобретении дано представление о том, что последовательности CDR, приведенные на фиг.2, определяют желаемые характеристики связывания, для специалиста не представляет трудности сконструировать варианты, содержащие по меньшей мере одну измененную последовательность CDR. Например, используется замена консервативных аминокислот. Также можно изменить по меньшей мере одну последовательность CDR, приведенную на фиг.2, для получения варианта антитела или его функционального эквивалента, по меньшей мере одно свойство которого будет отличаться от такового у АМ22. Предпочтительно, у полученного антитела или функционального эквивалента, содержащего последовательность CDR, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR, приведенной на фиг.2 положительные характеристики связывания АМ22 отчасти сохраняются или даже улучшаются. Последовательность CDR, приведенную на фиг.2, предпочтительно, изменяют так, чтобы полученное антитело или функциональный эквивалент обладал по меньшей мере одним улучшенным свойством, например, повышенной стабильностью и/или сродством связывания по сравнению с АМ22. Предпочтительно, специфичность связывания сохраняется (качественно, не обязательно количественно). Таким образом, настоящее изобретение относится к вариантам антитела или их функциональным фрагментам, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR, приведенной на фиг.2. Из уровня техники известны различные способы изменения аминокислотной последовательности. Например, можно искусственно синтезировать последовательность тяжелой цепи или легкой цепи с желаемой последовательностью CDR. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность CDR, содержит мутации, например, в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза.

Для определения эффективности профилактических, терапевтических, диагностических и исследовательских способов, включающих использование антител к RSV по настоящему изобретению, предпочтительно, используют измерение константы сродства и специфичности связывания антигена и антитела. "Сродство связывания" в общем случае означает суммарную силу нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и его партнером (например, антигеном). Если не указано иначе, в настоящем документе "сродство связывания" означает внутреннее сродство связывания, относящееся к взаимодействию 1:1 членов пары связывания (например, антитела и антигена). Это сродство может быть в общем представлено константой равновесной диссоциации (Kd), которая равна отношению k_off/k_on (см., например, Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Сродство можно измерить способами, известными из уровня техники, таких как, например, способ поверхностного плазмонного резонанса (SPR), с помощью инструмента BiaCore или IBIS-iSPR в IBIS Techonologies BV (Hengelo, the Netherlands) или жидкофазным способом, таким как Kinexa.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления, антитела к RSV по изобретению обладают сродством связывания с эпитопом в составе белка F RSV, имеющем константы диссоциации (Kd) ниже 1×10^-2 М, 1×10^-3 М, 1×10^-4 М, 1×10^-5 М, 1×10^-6 М, 1×10^-7 М, 1×10^-8 М, 1×10^-9 М, 1×10^-10 М, 1×10^-11 М, 1×10^-12 М, 1×10^-13 М, 1×10^-14 М или ниже 1×10^-15 М. В одном варианте осуществления антитела к RSV имеют Kd ниже 10^-7 М, ниже 5×10^-8 М, ниже 10^-8 М, ниже 5×10^-9 М, ниже 10^-9 М, ниже 5×10^-10 М, ниже 10^-10 М, ниже 5×10^-11 М, ниже 10^-11 М, ниже 5×10^-12 М, ниже 10^-12 М, ниже 5х10^-13 М, ниже 10^-13 М, ниже 5×10^-14 М, ниже 10^-14 М, ниже 5×10^-15 М или ниже 10^-15 М.

Настоящее изобретение также относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу, содержащему:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности KLSIH (SEQ ID NO:4), и/или

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO:8), и/или

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO:12), и/или

- последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO:20), и/или

- последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GASSRAT (SEQ ID NO:24), и/или

- последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности LSSDSSI (SEQ ID NO:28).

Предпочтительно, антитело или функциональный эквивалент по изобретению содержит последовательность CDR, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична по меньшей мере одной из последовательностей CDR, приведенных на фиг.2. Наиболее предпочтительно, антитело или функциональный эквивалент по изобретению содержит последовательность CDR, которая по меньшей мере на 95% идентична по меньшей мере одной из последовательностей CDR, приведенных на фиг.2. В особенности предпочтительное антитело АМ22, описанное выше, содержит последовательности CDR, состоящие из последовательностей CDR, приведенных на фиг.2. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления по изобретению представлено выделенное, синтетическое или рекомбинатное антитело или его функциональный фрагмент, способное специфически связываться с RSV и которое содержит:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность KLSIH (SEQ ID NO:4), и/или

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO:8), и/или

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO:12), и/или

- последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO:20), и/или

- последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность GASSRAT (SEQ ID NO:24), и/или

- последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность LSSDSSI (SEQ ID NO:28).

В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу или функциональному эквиваленту, содержащему последовательности тяжелой цепи CDR1 и CDR2 и последовательности легкой цепи CDR1 и CDR2, приведенные на фиг.2, или последовательности, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно, по меньшей мере на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 85% идентичны им. Кроме того, изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу, содержащему последовательность тяжелой цепи CDR1, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности KLSIH (SEQ ID NO:4), последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO:8), последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO:20), и последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GASSRAT (SEQ ID NO:24). Предпочтительно, указанное антитело или функциональный эквивалент содержит последовательности CDR, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичны вышеуказанным последовательностям CDR тяжелых и легких цепей. Предпочтительно, указанное антитело или функциональный эквивалент также содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO:12), и/или последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности LSSDSSI (SEQ ID NO:28). Также изобретение относится к антителу или функциональному эквиваленту, содержащему вышеупомянутые последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, а также вышеупомянутые последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи.

Необязательно, по меньшей мере одна из указанных последовательностей CDR человека может быть оптимизирована, предпочтительно, для повышения эффективности связывания или стабильности. Например, для этого можно использовать мутагенез с последующим предпочтительным анализом стабильности и/или эффективности связывания полученных соединений и выбором улучшенного антитела или функционального эквивалента.

Помимо оптимизирования последовательностей CDR, также может быть полезно оптимизировать по меньшей мере одну последовательность в по меньшей мере одной каркасной области. Это делается, как правило, для повышения эффективности связывания или стабильности. Например, последовательности каркасных областей оптимизируют путем мутирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую последовательность каркасных областей с последующим предпочтительным анализом свойств полученного антитела или функциональной части, что дает возможность получить улучшенные антитела или функциональные части. Таким образом, изобретение также относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам или их функциональным частям, производным и/или аналогам, содержащим аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности тяжелой цепи, приведенной на фиг.2. Такая последовательность тяжелой цепи придает желаемые свойства связывания, как видно для антитела АМ22. Кроме того, аминокислотные последовательности легких цепей, которые по меньшей мере на 70% идентичны последовательностям легких цепей, приведенным на фиг.2, также придают желаемые свойства связывания, как видно для антитела АМ22. Таким образом, далее изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу по изобретению, последовательность тяжелой цепи которого содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16), и/или последовательность легкой цепи которого по меньшей мере на 70% идентична последовательности EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK (SEQ ID NO:32).

Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональная часть, производное и/или аналог по изобретению, предпочтительно, содержит последовательность тяжелой цепи и/или последовательность легкой цепи, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичны последовательности тяжелой цепи и/или последовательности легкой цепи, приведенным на фиг.2. Чем больше степень гомологии, тем ближе указанное антитело или функциональный эквивалент к антителу АМ22. Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональная часть, производное или аналог по изобретению, предпочтительно, содержит как тяжелую, так и легкую цепи, близкие к тяжелой и легкой цепи АМ22. Таким образом, далее представлено выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональная часть, производное и/или аналог, содержащее последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи, которые по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичны последовательности тяжелой цепи и последовательности легкой цепи, соответственно, представленным на фиг.2. В одном варианте осуществления представлено антитело или функциональный эквивалент, последовательность тяжелой цепи которого приведена на фиг.2 и последовательность легкой цепи которого приведена на фиг.2.

В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу, содержащему последовательность тяжелой цепи, состоящую из последовательности тяжелой цепи, приведенной на фиг.2, и/или содержащему последовательность легкой цепи, состоящую из последовательности легкой цепи, приведенной на фиг.2. Альтернативно, специалисту в области техники хорошо известно, что возможно сконструировать укороченную последовательность тяжелой цепи или легкой цепи с аналогичным искомым свойством связывания. Предпочтительно, конструируют укороченную тяжелую цепь или легкую цепь, у которой укорочена константная область по сравнению с исходной тяжелой или легкой цепью. Предпочтительно, вариабельный домен сохраняется. Например, получают Fab-фрагмент или F(ab')₂-фрагмент, или однодоменное антитело, или одноцепочечное антитело, или нанотело, или "unibody", или фрагмент scFv на основе последовательности тяжелой цепи или последовательности легкой цепи, приведенной на фиг.2. Таким образом, также представлена функциональная часть антитела, содержащая по меньшей мере функциональную часть последовательности, приведенной на фиг.2. Указанная функциональная часть имеет длину не менее 20 аминокислот и содержит по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR1 тяжелой цепи, приведенной на фиг.2, последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR2 тяжелой цепи, приведенной на фиг.2, последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR3 тяжелой цепи, приведенной на фиг.2, последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR1 легкой цепи, приведенной на фиг.2, последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR2 легкой цепи, приведенной на фиг.2, последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR3 легкой цепи, приведенной на фиг.2.

Как указано ранее, антитела и функциональные эквиваленты по настоящему изобретению распознают уникальный эпитоп тримера белка F RSV. Таким образом, представлены антитела и функциональные эквиваленты, специфически распознающие этот эпитоп. Антитела и их функциональные эквиваленты, специфически распознающие указанный уникальный эпитоп, предпочтительно, комбинируют с известными RSV-специфичными антителами, такими как паливизумаб, D25, АМ14, АМ16 и АМ23. При сочетании антитела или его функционального эквивалента по изобретению, специфически распознающего указанный уникальный эпитоп, с известным RSV-специфическим антителом, в ходе одной и той же терапии распознаются два или более различных эпитопов RSV. Это позволяет получить более сильный иммунный ответ на RSV и/или повышенную специфичность антител к RSV. Такая комбинация, приводящая к более сильному иммуногенному ответу и повышенной специфичности против RSV, позволяет достигнуть более эффективного лечения и/или профилактики нарушения, связанного с RSV.

Таким образом, изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинатному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу, способному специфически связываться с эпитопом, распознаваемым антителом, которое содержит:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность KLSIH (SEQ ID NO:4), и/или

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO:8), и/или

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO:12), и/или

- последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO:20), и/или

- последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность GASSRAT (SEQ ID NO:24), и/или

- последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность LSSDSSI (SEQ ID NO:28).

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному антителу или его функциональной части, производному и/или аналогу, способному специфически связываться с эпитопом, распознаваемым антителом АМ22, которое содержит:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность KLSIH (SEQ ID NO:4), и

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO:8), и

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO:12), и

- последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO:20), и

- последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность GASSRAT (SEQ ID NO:24), и

- последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность LSSDSSI (SEQ ID NO:28).

В другом варианте осуществления изобретения рассматривают определенные модификации константной области (Fc), влияющие на эффекторную функцию. Например, увеличивают время полужизни в сыворотке белков, содержащих область Fc, путем повышения сродства связывания области Fc с FcRn. Термин "время полужизни антитела", употребляемый в настоящем документе, означает факмакокинетическое свойство антитела, измеряемое как среднее время выживаемости молекул антитела после введения. Время полужизни антитела может выражаться в виде времени, требуемого для выведения 50% известного количества иммуноглобулина из организма пациента (или другого млекопитающего) или из его определенного отдела, например, при измерении концентрации антител в сыворотке, т.е. время полужизни в кровотоке, или в других тканях. Время полужизни может варьировать от одного иммуноглобулина или класса иммуноглобулинов к другому. В целом, увеличение времени полужизни антитела приводит к увеличению среднего времени пребывания (mean residence time, MRT) в кровотоке для введенного антитела.

Увеличение времени полужизни позволяет уменьшить количество лекарственного средства, вводимого пациенту, а также понизить частоту введения. Для увеличения времени полужизни антитела по изобретению в сыворотке, можно ввести в антитело эпитоп, связывающийся с рецептором спасения (salvage receptor), как описано, например, в Патенте США № 5739277. Употребляемый в настоящем документе термин "эпитоп, связывающийся с рецептором спасения" означает эпитоп в области Fc молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), отвечающий за увеличения времени полужизни в сыворотке молекулы IgG. Альтернативно, антитела по изобретению с увеличенным временем полужизни можно получить с помощью модификации аминокислотных остатков, участвующих во взаимодействии Fc с рецептором FcRn (см., например, Патенты США №№ 6821505 и 7083784). Кроме того, время полужизни антител по изобретению можно увеличить путем конъюгирования с PEG или альбумином с помощью способов, широко применяемых в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления время полужизни антител, содержащих варианты области Fc по изобретению, больше на примерно 5%, примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 100%, примерно 125%, примерно 150% или более по сравнению с антителом, содержащим нативную область Fc. В некоторых вариантах осуществления время полужизни антител, содержащих варианты области Fc, больше примерно в 2 раза, примерно в 3 раза, примерно в 4 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 20 раз, примерно в 50 или более раз или в 2-10 раз, или в 5-25 раз, или в 15-50 раз по сравнению с антителом, содержащим нативную область Fc. Таким образом, изобретение относится к антителу, функциональной части, производному или аналогу по изобретению, содержащему эпитоп, связывающийся с рецептором спасения, и/или модифицированные остатки аминокислот, участвующие во взаимодействии Fc с рецептором FcRN, и/или аминокислотные остатки не природного происхождения. В другом предпочтительном варианте осуществления представлено антитело или функциональный эквивалент по изобретению, конъюгированное с PEG или альбумином.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам Fc по изобретению, где область Fc содержит модификацию (например, замену аминокислоты, вставку аминокислоты, делецию аминокислоты) в одном или более положениях, выбираемых из группы, состоящей из 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 и 443 согласно индексу EU, введенному в Kabat et al. (J Immunol. 1991; 147(5):1709-19). Область Fc необязательно содержит аминокислотные остатки не природного происхождения в дополнительных и/или альтернативных положениях, известных специалисту в области техники (см., например, 5624821; 6277375; 6737056; 7083784; 7317091; 7217797; 7276585; 7355008; 2002/0147311; 2004/0002587; 2005/0215768; 2007/0135620; 2007/0224188; 2008/0089892; WO 94/29351 и WO 99/58572).

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу с вариантом Fc по изобретению, где область Fc содержит по меньшей мере одну аминокислоту не природного происхождения в одном или более положениях, выбираемых из группы, состоящей из 252, 254 и 256. В одном варианте осуществления аминокислоты не природного происхождения выбирают из группы, состоящей из 252Y, 254T и 256E.

Настоящее изобретение относится к антителам, специфичным к RSV, и их функциональным фрагментам с улучшенными свойствами по сравнению с антителами, известными из уровня техники. Авторам изобретения удалось получить антитела, специфичные к RSV, с наименьшим значением IC₅₀, известным на сегодняшний день. Такие ант