Дихлорацетат 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина, его стабильная кристаллическая форма и способ ее получения

Дихлорацетат 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина, его стабильная кристаллическая форма и способ ее получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к новому биологически активному веществу - дихлорацетату 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина, которое обладает антиатеросклеротическим, гиполипидемическим, антигипоксическим, ноотропным, анксиолитическим и адаптогенным действием при низкой токсичности (LD₅₀=30000 мг/кг, крысы, внутрижелудочно), стабильности при хранении и отсутствии гигроскопичности.

Уровень техники

2-Этил-6-метил-3-гидроксипиридин (далее ЭМГП) - аналог витамина Вб, изучение его и его солей было начато в 80-х годах прошлого столетия, в частности хлоргидрат ЭМГП был предложен в качестве геропротектора [Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов // Успехи химии. - 1983. - Т. 52. - С.353-372; Emanuel L.M., Obukhova L.K. Types of experimental delay in aging patterns // Exp. Gerontol. - 1978. - Vol.13. - P.25-29], регулятора роста растений с антистрессовым эффектом [RU 801829, опубл. 07.02.1981].

В настоящее время предложены соли ЭМГП с гликолевой, малоновой, винной и др. органическими карбоновыми кислотами [RU 2246486, опубл. 20.02.2005; RU 2284993, опубл. 10.10.2006; RU 2357955, опубл. 10.06.2009; RU 2365582, опубл. 27.08.2009; RU 2377237, опубл. 27.12.2009; RU 2394815, опубл. 20.07.2010; RU 2442774, опубл. 20.02.2012; RU 2454406, опубл. 27.06.2012.

Наиболее широко применяются гидрохлорид ЭМГП (эмоксипин) [РЛС. Энциклопедия лекарств. - 16-й вып. / Гл. ред. Г.Л. Вышковский. - М.: «РЛС-2008», 2007. - С.1014], янтарнокислая соль ЭМГП (мексидол, мексикор) [http://medi.ru/doc/a070196.htm, РЛС. Энциклопедия лекарств. - 16-й вып. / Гл. ред. Г.Л. Вышковский. - М.: «РЛС-2008», 2007. - С.537] и малонат ЭМГП [http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/etoxydol.htm].

Соли ЭМГП обладают антиоксидантной [http://www.stm-journal.ru/_resources/item/77/fields/File/STM_2_2010_p22_25.pdf; RU 2444358, опубл. 10.03.2012; RU 2398583, опубл. 10.09.2010; RU 325908, опубл. 10.06.2008], антигипоксической [RU 2284993, опубл. 10.10.2006; RU 2442774, опубл. 20.02.2012; RU 2440132, опубл. 20.01.2012; RU 2398583, опубл. 10.09.2010; RU 2326665, опубл. 20.06.2008], гипогликемической, гиполипидемической, нейропротекторной [RU 2454406, опубл. 27.06.2012], метаболической и кардиопротекторной [RU 2365582, опубл. 27.08.2009], анксиолитической [RU 2284993, опубл. 10.10.2006] активностью.

Поиск новых солей ЭМГП отражает желание усилить и расширить биологические эффекты ЭМГП введением физиологически активного аниона в состав используемой соли ЭМГП.

Дихлорацетаты как препараты известны давно. В 70-е годы в виде соли 2-изопропиламинопиримидина он был предложен для использования при невропатии [GB 1351535, опубл. 01.05.1974]; в виде соли бигуанидина он был показан при метаболических нарушениях [GB 1473256, опубл. 11.05.1977; US 4801597, опубл. 31.01.1989]. Дихлорацетат натрия в US 4112188, опубл. 05.09.1978 предложен к использованию как гиполипидемический агент.

В 80-е годы был изучен дихлорацетат диизопропиламмония. В терапии эмбрионально-дистрессового синдрома он был предложен в DE 3712239, опубл. 09.06.1988. Соль диизопропиламмония, а также натрия и калия, были представлены в качестве активного вещества при лечении ишемии мозга US 4631294, опубл. 23.12.1986. В US 4558050, опубл. 10.12.1985, натриевая соль предложена для использования при метаболических нарушениях.

В 90-е годы велось дальнейшее изучение натриевой и диизопропиламмониевой солей. Дихлорацетат натрия предложен к использованию в области сердечнососудистых заболеваний [US 5587397, опубл. 24.12.1996; US 6011017, опубл. 04.01.2000; WO 9917763, опубл. 15.04.1999], дихлорацетат диизопропиламмония - в дерматологии [JP 6100430, опубл. 12.04.1994; JP 10330252, опубл. 15.12.1998].

В FR 2663508, опубл. 27.12.1991, как антидот, в качестве добавки к гербициду предложен метилдихлорацетат. Кроме того, начиная с 1997 года, Япония активно занимается разработкой косметических средств для волос и кожи на основе дихлорацетата.

В 2000 году дихлорацетат амлодипина представлен в качестве агента при терапии анемии и гипертензии [CN 1343663, опубл. 10.04.2002]. Было продолжено изучение дихлорацетата натрия как гиполипидемического агента, начатое еще в 70-е годы [WO 2005063761, опубл. 14.07.2005; WO 2005063761, опубл. 14.07.2005], а позднее он был представлен как гипогликемический агент [CN 102058569, опубл. 18.05.2011].

В течение последнего десятилетия продолжается исследование дихлорацетата диизопропиламмония. В 2007 году он предложен для использования при терапии раковых заболеваний, как антибластомный агент [JP 2007016008, опубл. 25.01.2007]; позднее представлен в качестве активного вещества при лечении острого и хронического гепатита [CN 101422438, опубл. 06.05.2009] и очистке печени и желчного пузыря [CN 101757315, опубл. 30.06.2010].

В качестве противораковых агентов исследуются и соли калия и натрия [WO 2006108276, опубл. 19.10.2006; US 2008221211, опубл. 11.09.2008; US 2009028791, опубл. 11.09.2007], а уже в 2012 году для использования в этой области предложены дихлорацетат иматиниба [US 2012295917, опубл. 22.11.2012] и эрлотиниба [WO 2012101846, опубл. 19.01.2012]. В России для лечения онкологических заболеваний предложены фармацевтические композиции, содержащие дихлорацетат натрия и теофилин [RU 2463053, опубл. 10.10.2012] и дихлорацетат натрия и ксантин (теобромин, кофеин, параксантин) [RU 2484814, опубл. 20.06.2013].

Следует отметить, что дихлорацетат натрия чрезвычайно гигроскопичен, вследствие чего изготовление удобных пероральных лекарственных форм (таблеток) очень затруднено. На практике, большей частью, используют концентрированные водные растворы, но они трудно дозируются из-за значительной вязкости и имеют очень неприятный вкус.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения являлось получение новой стабильной при хранении и негигроскопичной соли ЭМГП и дихлоруксусной кислоты, технологически удобной, пригодной к применению в экспериментальной медицине, обладающей спектром биологической активности, свойственной ЭМГП и дихлорацетат-аниону. Задача была решена путем синтеза новой соли дихлорацетата ЭМГП формулы:

Синтезированная соль обладает очень хорошими технологическими свойствами: отсутствие гигроскопичности, хорошие сыпучесть и прессуемость при таблетировании; при этом является химически стабильной.

Синтез заявляемого вещества проводят взаимодействием дихлоруксусной кислоты и ЭМГП в присутствии растворителя. Реакцию эквимолярных количеств реагентов проводят при перемешивании при комнатной температуре; для полноты кристаллизации выдерживают в течение 12-18 часов.

В качестве растворителя применяют протонный или апротонный растворитель, в качестве протонного растворителя используют воду или этанол, или 2-пропанол; в качестве апротонного растворителя используют ацетон или 2-бутанон, или диоксан, или ацетонитрил, или диэтиловый эфир, или тетрагидрофуран.

Полученная стабильная кристаллическая форма дихлорацетата ЭМГП характеризуется спектром рентгеновской дифракции порошка (см. Фиг.1), выражаемой в терминах: межплоскостное расстояние d, угол 2θ Брагга (Bragg′s), интенсивность и относительная интенсивность:

Угол (2θ±0,2)°	Межплоскостное расстояние d, А	Интенсивность, c-1	Относительная интенсивность, %
8,1200	10,87978	454	4
8,2800	10,66990	886	8
11,8938	7,43485	2572	23
15,8610	5,58302	373	3
16,3800	5,40728	3409	30
16,6423	5,32264	10853	96
16,8275	5,26447	1564	14
17,8471	4,96595	1383	12
18,2200	4,86514	653	6
18,5400	4,78189	379	3
18,7200	4,73631	398	4
20,2000	4,39251	1289	11
20,4200	4,34568	2093	18
20,6600	4,29574	668	6
22,5759	3,93532	925	8
23,0800	3,85050	639	6
24,0000	3,70494	1040	9
24,3624	3,65064	2032	18
25,1812	3,53376	11361	100
25,5600	3,48224	1045	9
26,1200	3,40884	1286	11
26,5800	3,35088	824	7
29,3000	3,04570	525	5
29,5600	3,01950	342	3
29,9200	2,98399	354	3
32,4000	2,76102	405	4
32,6922	1,73701	2411	21
33,1200	2,70262	814	7
33,4600	2,67594	376	3
33,6800	2,65896	568	5
33,8400	2,64675	1159	10
36,5800	2,45454	573	5
36,9200	2,43271	935	8
39,9682	2025393	368	3
42,6733	2,11710	378	3

Спектр рентгеновской дифракции порошка измеряли в условиях:

- дифрактометр Thermo ARL X′TRA, детектор полупроводниковый;

- излучение CuK_a напряжением 40 кВ, интенсивность 30 мА;

- съемка в режиме θ-2θ;

- диапазон измерения от 6,02° до 50,02°;

- прирост между каждым измерением 0,02°;

- скорость измерения 0,25°/мин;

- отклоняющая щель трубки 1,0°;

- рассеивающая щель трубки 1,0°;

- рассеивающая щель детектора 0,3 мм.

Продукты, полученные в результате синтезов, охарактеризованы с помощью ИК-, ЯМР¹³C-, ¹H-спектроскопии, элементного и термического анализов.

Результаты исследования биологической активности показывают, что заявляемое вещество обладает гиполипидемическим, антиатеросклеротическим, антигипоксическим, ноотропным, адаптогенным и анксиолитическим действием (см. примеры 8, 9). Дихлорацетат ЭМГП защищает центральную нервную систему от наиболее распространенных травмирующих воздействий - гипоксии и психоэмоционального перенапряжения и позволяет корригировать расстройства высшей нервной деятельности (когнитивных функций), вызываемые патологическими факторами (см. пример 8). При этом оказалось, что заявляемое вещество проявляет на порядок меньшую острую токсичность (LD₅₀=30000 мг/кг, крысы, внутрижелудочно), чем другие известные соли ЭМГП и соли дихлорацетата (см. пример 10). В сравнении, для широко известного Мексидола® (сукцинат ЭМГП) LD₅₀ более 3000 мг/кг [Воронина Т.А. Отечественный препарат нового поколения мексидол: основные эффекты, механизм действия, применение. - М.: 2004. - 248 с.], для Этоксидола® (малат ЭМГП) LD₅₀=3566 мг/кг [Березовская И.В., Рымарцев В.И., Волкова Л.И. Доклиническое исследование общетоксического действия Этоксидола // Токсикологический вестник. - 2010. - №5, С.42-45], для Эмоксипина® (гидрохлорид ЭМГП) LD₅₀=360 мг/кг [http://www.rusnauka.com/ 21_DNIS_2009/Biologia/49568.doc], для дихлорацетата натрия LD50=5281 мг/кг [http://datasheets.scbt.com/sc-203275.pdf]. Можно предположить, что способность дихлорацетат-аниона подавлять внутриклеточный молочный ацидоз [http://med-books.info/vnutrennie-bolezni_718/laktat-atsidoz.html. Stacpoole P.W., Lorenz A.C., Thomas R.G.. Dichloroacetateinthetreatmen toflacticacidosis. // Ann. Intern. Med. - 1988. - Vol.108 - P.58-63] защищает ткани внутренних органов при нарушении кровоснабжения, вызванного токсическими дозами ЭМГП.

Таким образом, заявляемое вещество обладает свойствами солей ЭМГП (антигипоксическим, ноотропным, гиполипидемическим, анксиолитическим, адаптогенным) и является в то же время удобным источником дихлорацетат-иона, используемого в экспериментальной онкологии, для купирования молочно-кислого ацидоза. Поскольку предлагаемая соль стабильна при хранении и негигроскопична, она может быть использована в качестве замены неудобного в применении дихлорацетата натрия. Учитывая низкую токсичность заявляемого вещества (на порядок ниже применяемых в настоящее время антиоксидантов-солей ЭМГП), его с успехом можно использовать в кардиологии, сосудистой хирургии, неврологии, гериатрии, а также комплексной терапии заболеваний различного генеза.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - Дифрактограмма дихлорацетата ЭМГП

Фиг.2 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 1)

Кривая 1 - кривая термогравиметрическоо анализа (TG)

Кривая 2 - кривая дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)

Кривая 3 - кривая дифференциального термогравиметрического анализа (DTG)

Фиг.3 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 2)

Кривая 1 - кривая TG

Кривая 2 - кривая DSC

Кривая 3 - кривая DTG

Фиг.4 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 3)

Кривая 1 - кривая TG

Кривая 2 - кривая DSC

Кривая 3 - кривая DTG

Фиг.5 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 4)

Кривая 1 - кривая TG

Кривая 2 - кривая DSC

Кривая 3 - кривая DTG

Фиг.6 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 5)

Кривая 1 - кривая TG

Кривая 2 - кривая DSC

Кривая 3 - кривая DTG

Фиг.7 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 6)

Кривая 1 - кривая TG

Кривая 2 - кривая DSC

Кривая 3 - кривая DTG

Фиг.8 - Термический анализ дихлорацетата ЭМГП (пример 7)

Кривая 1 - кривая TG

Кривая 2 - кривая DSC

Кривая 3 - кривая DTG

Осуществление изобретения Пример 1. Получение дихлорацетата ЭМГП из воды дистиллированной. В химический стакан, снабженный фторопластовой мешалкой с электромеханическим приводом, загружают 25 мл воды дистиллированной, 5 г ЭМГП (0,036 моль) и 4,58 г (0,036 моль) дихлоруксусной кислоты, включают мешалку. Реакционную массу перемешивают в течение получаса при комнатной температуре. Образовавшуюся суспензию выдерживают в течение 12-18 часов. Фильтруют на фильтре Шотта, сушат. Получают 8,8 г продукта (0,033 моль). Выход 91,9% от теории.

Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,10; H 5,01; N 5,30; O 18,01; Cl 26,58.

ЯМР¹H (ДМСО d⁶), δ, ppm: 1,17 (-CH₃, t, 3H); 2,45 (CH₃ -C₆, s, 3H); 2,80 (-CH₂-, k, 2H); 6,34 (-CHCl₂, s, 1H); 7,24 (C₄-H, d, 1H); 7,50 (C₅-H, d, 1H).

ЯМР¹³C (ДМСО d⁶), δ, ppm: 12,95 (-CH₃); 20,87 (CH₃ -C₆); 23,68 (-CH₂-); 68,60 (-CHCl₂); 123,74 (C₅); 126,86 (C₄); 144,84 (C₆); 147,90 (C₂); 150,87 (C₃); 166,36 (-COO^-).

ИК-спектр (см^-1): 3250-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2860-2973 (валентн. -CH₂-, -CH₃); 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1820, 1650 (валентн. СОО^-); 1630 (валентн. C=N⁺ пиридин, кольцо); 1600, 1550, 1455 (-С=С- пиридин, кольцо); 1391 (дефор. ассим. -CH₃); 1430 (ножнич. -CH₂); 1380 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1308 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1233 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1000, 1150, 1177, 1050, 950 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 837 (деформ. COO^-); 710 (маятн. -CH₂-); 772, 800, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 624 (валентн. C-Cl); 509 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,14; 8,28; 11,68; 11,88; 12,03; 16,28; 16,58; 16,90; 17,85; 18,18; 18,58; 19,48; 19,74; 20,39; 22,54; 23,06; 23,26; 23,98; 24,38; 25,19; 25,58; 25,76; 26,08; 26,36; 26,54; 27,03; 29,52; 32,68; 33,14; 33,75; 36,74; 37,00.

Термический анализ (Фиг.2):

При температуре 120,0°C наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 183,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 256,0°C). При температуре 289-342°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 327,0°C). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 2. Получение дихлорацетата ЭМГП из этанола.

Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя используют 25 мл этанола. Получают 3,3 г продукта (0,012 моль). Выход 34,4% от теории. Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,07; H 4,95; N 5,30; O 17,98; Cl 26,70.

ИК-спектр (см^-1): 3250-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2870-2976 (валентн. -CH₂-, -CH₃); 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1819, 1650 (валентн. COO^-); 1630 (валентн. С=N⁺ пиридин, кольцо); 1600, 1551, 1460 (-С=С- пиридин, кольцо); 1400 (дефор. ассим. -CH₃); 1430 (ножнич. -CH₂); 1381 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1300 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1237 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1170, 1150, 1047, 1000, 950 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 830 (деформ. COO^-); 713 (маятн. -CH₂-); 775, 805, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 630 (валентн. C-Cl); 509 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,10; 8,28; 11,88; 16,10; 16,32; 16,64; 17,06; 17,85; 18,22; 18,58; 20,22; 20,42; 20,68; 22,64; 22,92; 23,06; 24,02; 24,35; 24,98; 25,18; 25,58; 25,80; 26,06; 26,42; 26,58; 29,38; 31,54; 32,69; 33,10; 33,81; 36,56; 36,89; 39,97; 42,68.

Термический анализ (Фиг.3):

При температуре 121,0°C наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 188,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 258,0°C). При температуре 290-346°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 328,0°C). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 3. Получение дихлорацетата ЭМГП из 2-пропанола.

Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя используют 25 мл 2-пропанола. Получают 7,7 г продукта (0,029 моль). Выход 80,4% от теории.

Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,12; H 4,96; N 5,25; O 17,99; Cl 26,68.

ИК-спектр (см^-1): 3250-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2860-2976 (валентн. -CH₂-, -CH₃) 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1826, 1650 (валентн. COO^-); 1630 (валентн. С=N⁺ пиридин, кольцо); 1598, 1550, 1460 (-C=C- пиридин, кольцо); 1400 (дефор. ассим. -CH₃); 1430 (ножнич. -CH₂); 1382 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1304 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1250 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1178, 1150, 1047, 1000, 950 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 830 (деформ. COO^-); 710 (маятн. -CH₂-); 775, 800, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 630 (валентн. C-Cl); 509 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,12; 8,28; 11,89; 15,86; 16,38; 16,64; 16,83; 17,85; 18,22; 18,54; 18,72; 20,20; 20,42; 20,66; 22,58; 23,08; 24,00; 24,36; 25,18; 25,56; 26,12; 26,58; 29,30; 29,56; 29,92; 32,40; 32,69; 33,12; 33,46; 33,68; 33,84; 36,58; 36,92; 39,97; 42,67.

Термический анализ (Фиг.4): При температуре 115,0°С наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 191,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 256,0°C). При температуре 281-304°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 289,0°С). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 4. Получение дихлорацетата ЭМГП из ацетона.

Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя используют 25 мл ацетона. Получают 8,9 г продукта (0,033 моль). Выход 92,9% от теории.

Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,20; H 4,99; N 5,26; O 18,02; Cl 26,53.

ИК-спектр (см^-1): 3200-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2870-2976 (валентн. -CH₂-, -CH₃) 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1823, 1650 (валентн. COO^-); 1630 (валентн. C=N⁺ пиридин, кольцо); 1600, 1553, 1460 (-C=C- пиридин, кольцо); 1396 (дефор. ассим. -CH₃); 1441 (ножнич. -CH₂); 1380 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1308 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1230 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1180, 1150, 1044, 1000, 956 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 830 (деформ. COO^-); 710 (маятн. -CH₂-); 775, 800, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 630 (валентн. C-Cl); 509 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,14; 8,28; 11,90; 15,43; 15,84; 16,39; 16,67; 16,86; 17,86; 18,18; 18,73; 20,42; 20,72; 22,50; 22,77; 22,99; 23,08; 24,01; 24,24; 24,39; 25,18; 25,58; 25,80; 26,07; 26,43; 26,59; 28,18; 28,92; 29,40; 29,89; 32,68; 33,13; 33,82; 34,12; 36,92; 37,16; 40,07; 41,28; 42,68; 49,99.

Термический анализ (Фиг.5):

При температуре 120,0°C наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 185,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 257,0°C). При температуре 302-348°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 329,0°C). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 5. Получение дихлорацетата ЭМГП из 2-бутанона.

Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя берут 25 мл 2-бутанона. Получают 8,8 г продукта (0,033 моль). Выход 91,9% от теории.

Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,20; H 4,90; N 5,28; O 18,02; Cl 26,60.

ИК-спектр (см^-1): 3250-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2879-2976 (валентн. -CH₂-, -CH₃) 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1826, 1650 (валентн. COO^-); 1630 (валентн. C=N⁺ пиридин, кольцо); 1600, 1550, 1460 (-C=C- пиридин, кольцо); 1393 (дефор. ассим. -CH₃); 1438 (ножнич. -CH₂); 1380 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1308 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1234 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1177, 1150, 1050, 1000, 952 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 840 (деформ. COO^-); 710 (маятн. -CH₂-); 774, 800, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 627 (валентн. C-Cl); 509 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,16; 8,30; 11,89; 15,84; 16,30; 16,64; 16,88; 17,85; 18,22; 18,64; 20,20; 20,40; 20,64; 22,58; 22,90; 23,10; 24,04; 24,40; 25,19; 25,58; 25,76; 26,02; 26,16; 26,46; 26,60; 28,16; 28,90; 29,26; 29,54; 32,68; 33,00; 33,16; 33,82; 36,60; 36,78; 36,94; 40,25; 42,69.

Термический анализ (Фиг.6): При температуре 121,0°C наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 198,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 252,0°C). При температуре 290-332°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 313,0°С). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 6. Получение дихлорацетата ЭМГП из диоксана.

Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя используют 25 мл диоксана. Получают 9,3 г продукта (0,035 моль). Выход 97,1% от теории.

Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,17; H 5,00; N 5,32; O 17,96; Cl 26,55.

ИК-спектр (см^-1): 3250-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2870-2979 (валентн. -CH₂-, -CH₃); 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1816, 1650 (валентн. COO^-); 1630 (валентн. C=N⁺ пиридин, кольцо); 1604, 1551, 1460 (-C=C- пиридин, кольцо); 1400 (дефор. ассим. -CH₃); 1430 (ножнич. -CH₂); 1388 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1308 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1230 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1174, 1150, 1047, 1000, 950 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 843 (деформ. COO^-); 710 (маятн. -CH₂-); 772, 800, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 633 (валентн. C-Cl); 512 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,04; 8,18; 11,89; 15,83; 16,40; 16,63; 17,85; 18,64; 19,92; 20,36; 22,56; 23,00; 24,07; 24,36; 25,18; 25,76; 26,09; 26,50; 28,21; 28,90; 29,47; 32,74; 33,08; 33,79; 34,26; 35,96; 36,91; 40,08; 40,64; 41,28; 42,67; 43,80; 43,99; 49,99.

Термический анализ (Фиг.7): При температуре 121,0°C наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 182,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 254,0°C). При температуре 227-297°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 283,0°C). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 7. Получение дихлорацетата ЭМГП из ацетонитрила.

Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя используют 25 мл ацетонитрила. Получают 8,9 г продукта (0,033 моль). Выход 92,9% от теории.

Элементный анализ:

Вычислено, %: C 45,13; H 4,93; N 5,26; O 18,04; Cl 26,64.

Найдено, %: C 45,23; H 4,98; N 5,25; O 17,95; Cl 26,59.

ИК-спектр (см^-1): 3250-3700 (валентн. -OH, ассоцииров. группа); 3000 (валентн. Ar-H); 2870-2979 (валентн. -CH₂-, -CH₃); 2000-2800 (валентн. NH⁺); 1823, 1650 (валентн. COO^-); 1630 (валентн. C=N⁺ пиридин, кольцо); 1600, 1550, 1460 (-C=C- пиридин, кольцо); 1390 (дефор. ассим. -CH₃); 1430 (ножнич. -CH₂); 1388 (деформ. симм. -CH₃); 1350, 1330 (веер, крутильн. -CH₂-); 1311 (валентн. -C-O- пиридин, кольцо); 1233 (деформ. -C-OH пиридин, кольцо); 1177, 1150, 1050, 1000, 949 (плоск, деформ. C-H пиридин, кольцо); 900, 840 (деформ. COO^-); 710 (маятн. -CH₂-); 775, 800, 820 (неплоск. деформ. C-H пиридин, кольцо); 627 (валентн. C-Cl); 509 (деформ. C-Cl).

Рентгенфазовый анализ:

Характеристические пики при (2θ±0,2)°: 8,06; 8,28; 11,89; 15,86; 16,30; 16,62; 16,84; 17,84; 18,26; 18,58; 18,70; 19,86; 20,20; 20,40; 22,55; 23,04; 24,00; 24,36; 25,18; 25,44; 25,58; 25,72; 25,98; 26,08; 26,36; 26,52; 28,24; 28,90; 29,26; 29,40; 29,90; 32,70; 33,12; 33,80; 34,06; 36,42; 36,58; 36,94; 37,14; 40,13; 49,96.

Термический анализ (Фиг.8): При температуре 121,0°C наблюдается выраженный эндотермический эффект, отвечающий плавлению образца (образец плавится без разложения). При температуре выше 181,0°C начинается процесс разложения соли, сопровождающийся эндотермическим эффектом (максимум при 256,0°C). При температуре 289-337°C происходит дальнейшее разложение образующихся продуктов при выраженном эндотермическом эффекте (максимум при 325,0°C). При дальнейшем росте температуры образец окисляется и выгорает.

Пример 8. Антигипоксическая активность дихлорацетата ЭМГП на модели гипоксии гермообъема.

Поскольку известные соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина обладают антигипоксическим действием вероятно предположить такое же действие и у новой соли.

Антигипоксическую активность дихлорацетата ЭМГП изучали на модели гипоксии гермообъема [Бобков Ю.Г., Лосев А.С. и др. Методические рекомендации по скринингу и доклиническому испытанию антигипоксических средств. - М., 1989. - 20 с.], на фоне гипоксической травмы оценивали влияние препарата на функциональное состояние животных, а именно на:

- ориентировочно-исследовательское поведение в условиях методики "открытого поля" [Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. / Под ред. Батуева А.С. - М.: Высшая школа, 1991. - 398 с., Walsh R.N., Cummins R.A. The open-field test: A critical review. // Psychol. Bull. - 1976. - V.83. - P.482-504];

- эмоциональную реакцию по методу Brady & Nauta [Brady J.V., Nauta WJ.H. Subcortical mechanisms in emotional behavioral affective changes following septal forebrain lesions in albino rat. // J. Comparative And Phisiol. Psychol. - 1953. - V.46. - N 3. - P.339-341] в модификации для мышей [Суслов Н.И. Патогенетическое обоснование психофармакологических эффектов препаратов природного происхождения (экспериментальное исследование): Дисс. д-ра мед. наук. / Ин-т фармакологии. - Томск, 1995. - 406 с.].

- способность к выработке и воспроизведению условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. / Под ред. Батуева А.С.. - М.: Высшая школа, 1991. - 398 с.].

Методика эксперимента:

Модель гипоксии гермообъема:

Животных помещали в термокамеру, представляющую собой стеклянный сосуд с выверенным объемом в 500 мл (±<1,0%), с герметически закрывающейся крышкой. При появлении первого атонального вздоха или предсмертного судорожного припадка животных извлекали и давали "раздышаться". Функциональные нарушения со стороны центральной нервной системы, вызванные гипоксическим воздействием, оценивались по изменению ориентировочно-исследовательского поведения в «открытом поле» и сохранности УРПИ.

1. Изучение ориентировочно-исследовательского поведения

Экспериментальная установка "открытое поле" представляла собой камеру размером 40×40×20 см. Стенки камеры белого цвета; пол камеры разделен на 16 квадратов, в каждом из которых круглое отверстие диаметром 3 см. Сверху камера освещалась электрической лампой накаливания мощностью 100 ватт, расположенной на высоте 1 м от пола. Животное помещалось в один из углов экспериментальной установки. Регистрировали количество перемещений с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество обследований отверстий (норковый рефлекс), количество умываний (груминг) и количество актов дефекации (по количеству фекальных шариков) в первую минуту и в две последующие. Результаты первой и двух последующих минут эксперимента оценивались отдельно и в сумме. Активность на первой минуте характеризует инстинктивно-обусловленное поведение, на двух последующих минутах

- степень адаптации животного к изменившимся условиям.

На основании результатов исследования рассчитывали коэффициенты соотношения активности животных в первую и две последующие минуты эксперимента: коэффициент суммарной двигательной активности (К_СДА), коэффициент горизонтальной активности (К_ГОР), коэффициент норкового рефлекса (К_НОР), представляющие собой отношение показателя активности животных в первую минуту эксперимента к его активности в две последующие минуты по соответствующим показателям. Рассчитывали коэффициенты асимметрии поведения за первый (К_АСС(1)) и второй (К_АСС(2)) периоды наблюдения в виде отношения количества горизонтальных перемещений к суммарной двигательной активности, выраженный в процентах.

Количество пересеченных квадратов характеризует спонтанную двигательную активность животных, сумма стоек и заглядываний в отверстия - суммарную ориентировочно-исследовательскую активность. Поведение животного при груминге отражает степень его эмоционального напряжения: частый кратковременный (до 5 с)

- тревожное состояние, редкий и продолжительный - состояние комфорта. Вегетативные показатели стресса (число болюсов дефекации и уринаций) также характеризуют эмоциональное напряжение животных.

2. Эмоциональная реакция по методу Brady & Nauta

Эмоциональная реакция регистрировалась каждый день дважды - до изучения ориентировочно-исследовательского поведения и после.

Оценивались следующие показатели:

- сопротивление захвату в клетке, где животное постоянно живет;

- реакция на захват рукой (при выполнении этого теста животное помещалось на плоскую поверхность и захватывалось в ладонь);

- мышечный тонус (оценивали при взятии животного в ладонь);

- реакция на приближение пинцета (при выполнении этого теста животное помещалось на плоскую поверхность, после чего к его носу подносили пинцет на расстояние до 0,5 см, так, чтобы животное могло видеть его приближение);

- реакция на толчок пинцетом (при выполнении этого теста животное помещалось на плоскую поверхность, после чего его толкали пинцетом; пинцет подносили так, чтобы животное не видело его приближение);

- дефекация и мочеиспускание (регистрировали на всем протяжении эксперимента);

- вокализация (регистрировали на всем протяжении эксперимента);

- характерное движение хвостом.

Вся процедура выполнялась для каждого животного отдельно. Каждый показатель оценивался по четырехбальной системе (0 баллов - отсутствие писка и дефекации с мочеиспусканием). Показателем служила сумма баллов по всем тест-воздействиям без дифференцировки по отдельным тестам, которая давала общую оценку эмоциональной реакции.

3. Выработка и воспроизводство УРПИ

Данная методика основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов.

Экспериментальная установка представляла собой камеру, состоящую из двух отсеков: большого - освещенного и малого - темного. Животное помещалось в светлый отсек и вскоре (через 10-20 с), в силу врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, переходило в темный отсек. После этого дверка, соединяющая оба отсека, перекрывалась, и на пол темного отсека, состоящего из параллельно чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 Мс, частотой 5 Гц и амплитудой 50 мА. Через 10 секунд дверку открывали, и животное могло выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животных вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. При проверке воспроизводимости рефлекса животных помещали в светлый отсек в угол противоположный от входа в темный отсек и наблюдали за ними в течение трех минут. Рефлекс считался выработанным, если в течение трех минут наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек или время первого захода (латентное время захода) превышало 150 с. О качестве рефлекса судили по доле животных с наличием рефлекса. Животные, которые после помещения в светлый отсек сохраняли неподвижность и не приближались ко входу в темный отсек, при подсчете результатов не учитывались.

Проверку рефлекса осуществляли через 48 часов после выработки. В день проверки сохранности рефлекса животным вводили препарат, чтобы исключить влияние феномена диссоциации. При проверке воспроизводимости рефлекса животных помещали в светлый отсек в угол противоположный от входа в темный отсек и наблюдали за ними в течение трех минут. Регистрировали латентное время захода и суммарное время пребывания в темном отсеке (время темного отсека). Кроме того, регистрировалось количество животных, сохранивших выработанный рефлекс (не заходивших в темный отсек в течение 150 с) (Табл.1).

В эксперименте сравнивали показатели, определяющие степень обученности животных и состояние памяти - чем значительнее увеличивается латентный период захода животного в темный отсек, тем больше обученность и сохранение памятного следа. Общее время нахождения в темном отсеке, регистрируемое при воспроизведениях навыка, также отражает сохранность памятного следа у животного, чем меньше времени животное проводит в темном отсеке, тем лучше оно помнит о нанесенном ему здесь электроболевом раздражении.

В качестве препарата сравнения использовали сукцинат ЭМГП, известный как препарат Мексидол.

Исследования были проведены на 100 белых беспородных мышах обоего пола. Экспериментальные животные содержались в клетках по 6-8 шт. на подстилке из опилок хвойных деревьев при естественном световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Животные получали стандартный виварный корм. За 2 часа до введения исследуемых соединений корм из клеток убирался. Исследовались две действующие дозы в 50 мг/кг и в 100 мг/кг. Взвеси, получаемые из двух порошкообразных рецептур путем растворения в 1% крахмальной слизи, вводили внутрижелудочно с помощью атравматического зонда ежедневно на протяжении 4 дней. Последнее введение осуществляли на 5 день за час пред гипоксией.

О достоверности различий судили проверкой вероятности нулевой гипотезы по методу Стьюдента-Фишера и по методу Вилкинсона.

Количественные значения коэффициентов и показателей, характеризующих функциональное состояние животных после гипоксической травмы, представлены в таблицах 1-4.

Таблица 1
Влияние исследуемых веществ на ориентировочную реакцию и сохранность условного рефлекса пассивного избегания беспородных мышей-самцов после перенесенной гипоксической травмы ( X ¯ ± m ; n=10)
Группы наблюдения, доза	Проверка (через 48 часов)
Латентное время захода, с	Время темного отсека, с	Наличие рефлекса
Контроль интактный	149,0±19,6#	8,9±5,4	0,8±0,13#
Контроль гипоксический	76,6±12,2 *	10,5±4,1	0,1±0,1*
Сукцинат ЭМГП, 50 мг/кг	126,4±19,2	15,2±8,3	0,5±0,17#
Сукцинат ЭМГП, 100 мг/кг	105,5±14,5	29,5±12,8	0,б±0,16#
Заявляемое вещество, 50 мг/кг	126,0±12,1	20,2±12,6	0,5±0,17*
Заявляемое вещество, 100 мг/кг	158,1±13,2#	6,44±3,03	0,9±0,1*
* - различия достоверны в отношении интактного контроля при P≤0,05
# - различия достоверны в отношении гипоксического контроля при P≤0,05

- в первую минуту наблюдения

- во вторую и третью минуты наблюдения

Таблица 3
Значения коэффициентов норкового рефлекса, горизонтальной активности, суммарной двигательной активности и асимметрии поведения
Группы наблюдений	КАСС(1), %	КАСС(2), %	КГОР	КНОР	КСДА
Контроль интактный	62,4	54,8	0,52	0,32	0,45
Контроль гипоксический	73,8	58,7	1,11	0,75	0,89
Сукцинат ЭМГП, 50 мг/кг	82,6	57,6	0,73	0,30	0,50
Сукцинат ЭМГП, 100 мг/кг	73,2	55,8	0,82	0,29	0,62
Заявляемое вещество, 50 мг/кг	66,0	57,5	0,64	0,46	0,56
Заявляемое вещество, 100 мг/кг	68,5	57,2	0,57	0,33	0,47

Таблица 4
Показатели эмоциональной реакции беспородных мышей по методу Brady & Nauta после перенесенной гипоксической травмы в условных единицах (усредненный показатель четырех дней наблюдения; X ¯ ± m ; n=12)
Группы наблюдения	Суммарный показатель реакции	Реакция на захват в клетке	Реакция на захват на ровной плоской поверхности	Мышечный тонус	Реакция наприближение пинцета	Реакция на толчок пинцетом	Писк	Дефекация	Хво