Способы модификации антител и модифицированные антитела с улучшенными функциональными свойствами

Способы модификации антител и модифицированные антитела с улучшенными функциональными свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки США за номером 60/937,112, озаглавленной "Инженерия и оптимизация одноцепочечных антител на основе последовательности", поданной 25 июня 2007 г. Настоящая заявка также претендует на приоритет предварительной заявки США за номером 61/069,056, озаглавленной "Способы модификации антител и модифицированные антитела с улучшенными функциональными свойствами", поданной 12 марта 2008 г.

Уровень техники

Антитела оказались очень эффективными и успешными терапевтическими средствами при лечении рака, аутоиммунных заболеваний и других заболеваний. Хотя в клинике обычно использовались полноразмерные антитела, однако применение фрагментов антител может обеспечить ряд преимуществ, как то: повышение тканевой проницаемости, отсутствие Fc-эффекторной функции в сочетании со способностью к добавлению других эффекторных функций и вероятностью уменьшения системных побочных эффектов вследствие более короткого времени полужизни in vivo при системном введении. Фармакокинетические свойства фрагментов антител свидетельствуют, что они могут особенно хорошо подойти для локального терапевтического применения. Кроме того, в некоторых системах экспрессии фрагменты антител легче получить, чем полноразмерные антитела.

Одним из типов фрагментов антител являются одноцепочечные антитела (scFv), которые состоят из вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), конъюгированного с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) через последовательность линкера. Таким образом, у scFvs отсутствуют все домены константной области антител, а аминокислотные остатки на бывшей границе раздела вариабельных/константных доменов (пограничные остатки) контактируют с растворителем. Антитела scFv могут быть получены из полноразмерных антител (например, молекул IgG) стандартными методами рекомбинантной инженерии. Однако превращение полноразмерного антитела в scFv зачастую приводит к ухудшению стабильности и растворимости белка, снижению выхода продукции и сильной тенденции к агрегации, что повышает риск иммуногенности.

Соответственно, делались попытки улучшить такие свойства, как растворимость и стабильность антител scFv. Например, Nieba L. et al. (Prot. Eng. (1997) 10:435-444) выбрали три аминокислотных остатка, известных как пограничные остатки, и подвергли их мутагенезу. Они наблюдали возрастание экспрессии мутированных scFv в периплазме бактерий, а также снижение скорости термальной агрегации, хотя термодинамическая стабильность и растворимость существенно не менялись. Были и другие исследования, в которых проводился направленный мутагенез по определенным аминокислотным остаткам scFv (например, см. Tan P.H. et al. (1988) Biophys. J. 75: 1473-1482; Worn A. and Pluckthun A. (1998) Biochem. 37: 13120-13127; Worn A. and Pluckthun A. (1999) Biochem. 38: 8739-8750). В этих различных исследованиях выбранные для мутагенеза аминокислотные остатки отбирали исходя из их известного положения в структуре scFv (например, из опытов по молекулярному моделированию).

В других подходах пересаживали определяющие комплементарность участки (CDRs) из очень плохо экспрессирующихся scFv в каркасные участки такого scFv, которое проявляло хорошие свойства (Jung S. and Pliickthun A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966). Полученные при этом scFv проявляли улучшение растворимой экспрессии и термодинамической стабильности.

Прогресс в инженерии антител scFv для улучшения функциональных свойств рассматривается, к примеру, в обзоре Worn A. and Pluckthun А. (2001) J. Mol. Biol. 305:989-1010. Тем не менее по-прежнему нужны новые подходы, которые позволят рациональную разработку антител scFv с лучшими функциональными свойствами, в частности такие подходы, которые будут содействовать специалистам в выборе потенциально проблематичных аминокислотных остатков для инженерии. Кроме того, по-прежнему нужны такие способы инженерии антител scFv и других типов антител, с помощью которых можно им придавать улучшенные функциональные свойства, как то: большую стабильность и/или растворимость.

Раскрытие изобретения

Настоящим изобретением предусмотрены способы инженерии иммуносвязывающих молекул типа антител scFv на основе анализа последовательности каркасных участков стабильных и растворимых антител scFv, что позволяет идентифицировать аминокислотные остатки в последовательности scFv, потенциально проблематичные в отношении стабильности и/или растворимости, и идентифицировать предпочтительные замены аминокислотных остатков в таких положениях. Так, можно отобрать для мутагенеза аминокислотные остатки, идентифицированные в соответствии со способами изобретения, и получить прошедшие мутагенез искусственные иммуносвязывающие молекулы типа антител scFv, и подвергнуть их скринингу на предмет улучшения таких функциональных свойств, как стабильность и/или растворимость. Изобретение обеспечивает и демонстрирует преимущество подхода "функционального консенсуса" для идентификации предпочтительных замен аминокислотных остатков в каркасных участках scFv на основе использования базы данных по функционально отобранным последовательностям scFv.

Соответственно, изобретением предусмотрены способы инженерии иммуносвязывающих молекул (например, антител scFv) путем мутагенеза определенных каркасных положений аминокислот на определенные аминокислотные остатки, установленные с помощью описанного в нем подхода "функционального консенсуса". Более того, изобретением предусмотрены каркасные остовы scFv, разработанные на основе описанного в нем подхода "функционального консенсуса", которые можно использовать в качестве таких каркасных последовательностей, в которые можно вставить нужные последовательности CDR для получения иммуносвязывающей молекулы, например scFv, против представляющего интерес антигена мишени.

Предпочтительно иммуносвязывающие молекулы, используемые в или полученные с помощью способов инженерии по изобретению, представляют собой scFv, но в способах инженерии можно использовать и другие иммуносвязывающие молекулы, как то: полноразмерные иммуноглобулины, Fab-фрагменты, однодоменные антитела (например, Dabs) и нанотела. Изобретение также охватывает иммуносвязывающие молекулы, полученные с помощью способов инженерии, а также композиции, содержащие иммуносвязывающие молекулы и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте изобретения предусмотрен способ инженерии иммуносвязывающих молекул, причем иммуносвязывающая молекула включает (i) вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасные остатки V_H, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, при этом вариабельная область легкой цепи содержит каркасные остатки V_L, а способ включает:

A) выбор для мутагенеза одного или нескольких положений аминокислот в каркасных участках V_H, каркасных участках V_L или каркасных участках V_H и V_L; и

B) проведение мутагенеза по одному или нескольким положениям аминокислот, выбранных для мутагенеза, причем положения аминокислот, выбранные для мутагенеза, и аминокислотные остатки, вставленные в выбранные положения, более подробно описаны ниже.

При нижеприведенной нумерации положений аминокислот используется система нумерации АНо; соответствующие положения по системе нумерации Кабата описаны далее, а переводные таблицы для нумерации по системе АНо и по системе Кабата приведены в примере 1. Аминокислотные остатки сокращенно обозначаются по стандартной однобуквенной кодировке.

В одном воплощении, если при этом для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области тяжелой цепи, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(a) Q или Е в положении аминокислоты 1;

(b) Q или Е в положении аминокислоты 6;

(c) Т, S или А, более предпочтительно Т или А, еще более предпочтительно Т в положении аминокислоты 7;

(d) А, Т, Р, V или D, более предпочтительно Т, Р, V или D в положении аминокислоты 10;

(e) L или V, более предпочтительно L в положении аминокислоты 12;

(f) V, R, Q, M или K, более предпочтительно V, R, Q или М в положении аминокислоты 13;

(g) R, M, Е, Q или K, более предпочтительно R, М, Е или Q, еще более предпочтительно R или Е в положении аминокислоты 14;

(h) L или V, более предпочтительно L в положении аминокислоты 19;

(i) R, Т, K или N, более предпочтительно R, Т или N, еще более предпочтительно N в положении аминокислоты 20;

(j) I, F, L или V, более предпочтительно I, F или L, еще более предпочтительно I или L в положении аминокислоты 21;

(k) R или K, более предпочтительно К в положении аминокислоты 45;

(l) Т, Р, V, А или R, более предпочтительно Т, Р, V или R, еще более предпочтительно R в положении аминокислоты 47;

(m) K, Q, Н или Е, более предпочтительно K, Н или Е, еще более предпочтительно K в положении аминокислоты 50;

(n) М или I, более предпочтительно I в положении аминокислоты 55;

(о) K или R, более предпочтительно K в положении аминокислоты 77;

(р) А, V, L или I, более предпочтительно А, L или I, еще более предпочтительно А в положении аминокислоты 78;

(q) Е, R, Т или А, более предпочтительно Е, Т или А, еще более предпочтительно Е в положении аминокислоты 82;

(r) Т, S, I или L, более предпочтительно Т, S или L, еще более предпочтительно Т в положении аминокислоты 86;

(s) D, S, N или G, более предпочтительно D, N или G, еще более предпочтительно N в положении аминокислоты 87;

(t) A, V, L или F, более предпочтительно А, V или F, еще более предпочтительно V в положении аминокислоты 89;

(u) F, S, Н, D или Y, более предпочтительно F, S, И или D в положении аминокислоты 90;

(v) D, Q или Е, более предпочтительно D или Q, еще более предпочтительно D в положении аминокислоты 92;

(w) G, N, Т или S, более предпочтительно G, N или Т, еще более предпочтительно G в положении аминокислоты 95;

(x) Т, А, Р, F или S, более предпочтительно Т, А, Р или F, еще более предпочтительно F в положении аминокислоты 98;

(y) R, Q, V, I, М, F или L, более предпочтительно R, Q, I, М, F или L, еще более предпочтительно Y или L в положении аминокислоты 103; и

(z) N, S или А, более предпочтительно N или S, еще более предпочтительно N в положении аминокислоты 107.

В другом воплощении, если при этом для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области легкой цепи, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(аа) Q, D, L, Е, S или I, более предпочтительно L, Е, S или I, еще более предпочтительно L или Е в положении аминокислоты 1;

(bb) S, A, Y, I, Р или Т, более предпочтительно А, Y, I, Р или Т, еще более предпочтительно Р или Т в положении аминокислоты 2;

(ее) Q, V, Т или I, более предпочтительно V, Т или I, еще более предпочтительно V или Т в положении аминокислоты 3;

(dd) V, L, I или М, более предпочтительно V или L в положении аминокислоты 4;

(ее) S, Е или Р, более предпочтительно S или Е, еще более предпочтительно S в положении аминокислоты 7;

(ff) Т или I, более предпочтительно I в положении аминокислоты 10;

(gg) А или V, более предпочтительно А в положении аминокислоты 11;

(hh) S или Y, более предпочтительно Y в положении аминокислоты 12;

(ii) Т, S или А, более предпочтительно Т или S, еще более предпочтительно Т в положении аминокислоты 14;

(jj) S или R, более предпочтительно S в положении аминокислоты 18;

(kk) Т или А, более предпочтительно А в положении аминокислоты 20;

(ll) R или Q, более предпочтительно Q в положении аминокислоты 24;

(mm) H или Q, более предпочтительно Н в положении аминокислоты 46;

(nn) K, R или I, более предпочтительно R или I, еще более предпочтительно R в положении аминокислоты 47;

(оо) R, Q, K, Е, Т или М, более предпочтительно Q, K, Е, Т или М в положении аминокислоты 50;

(рр) K, Т, S, N, Q или Р, более предпочтительно Т, S, N, Q или Р в положении аминокислоты 53;

(qq) I или М, более предпочтительно М в положении аминокислоты 56;

(rr) Н, S, F или Y, более предпочтительно Н, S или F в положении аминокислоты 57;

(ss) I, V или Т, более предпочтительно V или Т, еще более предпочтительно Т в положении аминокислоты 74;

(tt) R, Q или K, более предпочтительно R или Q, еще более предпочтительно R в положении аминокислоты 82;

(uu) L или F, более предпочтительно F в положении аминокислоты 91;

(vv) G, D, Т или А, более предпочтительно G, D или Т, еще более предпочтительно Т в положении аминокислоты 92;

(xx) S или N, более предпочтительно N в положении аминокислоты 94;

(yy) F, Y или S, более предпочтительно Y или S, еще более предпочтительно S в положении аминокислоты 101; и

(zz) D, F, Н, Е, L, А, Т, V, S, G или I, более предпочтительно Н, Е, L, А, Т, V, S, G или I, еще более предпочтительно А или V в положении аминокислоты 103.

В одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи или ее фрагмент относится к семейству V_H3, поэтому, если для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области тяжелой цепи из семейства V_H3, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(i) Е или Q в положении аминокислоты 1, более предпочтительно Q;

(ii) Е или Q в положении аминокислоты 6, более предпочтительно Q;

(iii) Т, S или А в положении аминокислоты 7, более предпочтительно Т или А, еще более предпочтительно Т;

(iv) А, V, L или F в положении аминокислоты 89, более предпочтительно А, V или F, еще более предпочтительно V; и

(v) R, Q, V, I, L, М или F в положении аминокислоты 103, более предпочтительно R, Q, I, L, М или F, еще более предпочтительно L.

В другом воплощении вариабельная область тяжелой цепи или ее фрагмент относится к семейству V_H1a, поэтому если для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области тяжелой цепи из семейства V_H1a, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(i) Е или Q в положении аминокислоты 1, более предпочтительно Е;

(ii) Е или Q в положении аминокислоты 6, более предпочтительно Е;

(iii) L или V в положении аминокислоты 12, более предпочтительно L;

(iv) М или K, в положении аминокислоты 13, более предпочтительно М;

(v) Е, Q или K в положении аминокислоты 14, более предпочтительно Е или Q, еще более предпочтительно Е;

(vi) L или V в положении аминокислоты 19, более предпочтительно L;

(vii) I или V в положении аминокислоты 21, более предпочтительно I;

(viii) F, S, H, D или Y в положении аминокислоты 90, более предпочтительно F, S, Н или D;

(ix) D, Q или Е в положении аминокислоты 92, более предпочтительно D или Q, еще более предпочтительно D;

(х) G, N, Т или S в положении аминокислоты 95, более предпочтительно G, N или Т, еще более предпочтительно G; и

(xi) Т, А, Р, F или S в положении аминокислоты 98, более предпочтительно Т, А, Р или F, еще более предпочтительно F.

В следующем воплощении вариабельная область тяжелой цепи или ее фрагмент относится к семейству V_H1b, поэтому если для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области тяжелой цепи из семейства V_H1b, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(i) Е или Q в положении аминокислоты 1, более предпочтительно Е;

(ii) А, Т, Р, V или D в положении аминокислоты 10, более предпочтительно Т, Р, V или D;

(iii) L или V в положении аминокислоты 12, более предпочтительно L;

(iv) K, V, R, Q или М в положении аминокислоты 13, более предпочтительно V, R, Q или М;

(v) Е, K, R или М в положении аминокислоты 14, более предпочтительно Е, R или М, еще более предпочтительно R;

(vi) R, Т, K или N в положении аминокислоты 20, более предпочтительно R, Т или N, еще более предпочтительно N;

(vii) I, F, V или L в положении аминокислоты 21, более предпочтительно I, F или L, еще более предпочтительно L;

(viii) R или K в положении аминокислоты 45, более предпочтительно K;

(ix) Т, Р, V, А или R в положении аминокислоты 47, более предпочтительно Т, Р, V или R, еще более предпочтительно R;

(х) K, Q, Н или Е в положении аминокислоты 50, более предпочтительно K, Н или Е, еще более предпочтительно K;

(xi) M или I в положении аминокислоты 55, более предпочтительно I;

(xii) K или R в положении аминокислоты 77, более предпочтительно K;

(xiii) А, V, L или I в положении аминокислоты 78, более предпочтительно А, L или I, еще более предпочтительно А;

(xiv) Е, R, Т или А в положении аминокислоты 82, более предпочтительно Е, Т или А, еще более предпочтительно Е;

(xv) Т, S, I или L в положении аминокислоты 86, более предпочтительно Т, S или L, еще более предпочтительно Т;

(xvi) D, S, N или G в положении аминокислоты 87, более предпочтительно D, N или G, еще более предпочтительно N; и

(xvii) N, S или А в положении аминокислоты 107, более предпочтительно N или S, еще более предпочтительно N.

В другом воплощении вариабельная область легкой цепи или ее фрагмент относится к семейству Vκ1, поэтому если для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области легкой цепи из семейства Vκ1, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(i) D, Е или I в положении аминокислоты 1, более предпочтительно Е или I, еще более предпочтительно Е;

(ii) Q, V или I в положении аминокислоты 3, более предпочтительно V или I, еще более предпочтительно V;

(iii) V, L, I или М в положении аминокислоты 4, более предпочтительно V, L или I, еще более предпочтительно L;

(iv) R или Q в положении аминокислоты 24, более предпочтительно Q;

(v) K, R или I в положении аминокислоты 47, более предпочтительно R или I, еще более предпочтительно R;

(vi) K, R, Е, Т, М или Q в положении аминокислоты 50, более предпочтительно K, Е, Т, М или Q;

(vii) Н, S, F или Y в положении аминокислоты 57, более предпочтительно Н, S или F, еще более предпочтительно S;

(viii) L или F в положении аминокислоты 91, более предпочтительно F; и

(ix) Т, V, S, G или I в положении аминокислоты 103, более предпочтительно V, S, G или I, еще более предпочтительно V.

В следующем воплощении вариабельная область легкой цепи или ее фрагмент относится к семейству Vκ3, поэтому если для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области легкой цепи из семейства Vκ3, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(i) I или Т в положении аминокислоты 2, более предпочтительно Т;

(ii) V или Т в положении аминокислоты 3, более предпочтительно Т;

(iii) Т или I в положении аминокислоты 10, более предпочтительно I;

(iv) S или Y в положении аминокислоты 12, более предпочтительно Y;

(v) S или R в положении аминокислоты 18, более предпочтительно S;

(vi) Т или А в положении аминокислоты 20, более предпочтительно А;

(vii) I или М в положении аминокислоты 56, более предпочтительно М;

(viii) I, V или Т в положении аминокислоты 74, более предпочтительно V или Т, еще более предпочтительно Т;

(ix) S или N в положении аминокислоты 94, более предпочтительно N;

(х) F, Y или S в положении аминокислоты 101, более предпочтительно Y или S, еще более предпочтительно S; и

(xi) V, L или А в положении аминокислоты 103, более предпочтительно L или А, еще более предпочтительно А.

В следующем воплощении вариабельная область легкой цепи или ее фрагмент относится к семейству VU, поэтому если для мутагенеза выбрано одно или несколько положений аминокислот из вариабельной области легкой цепи из семейства VU, то мутагенез включает одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из:

(i) L, Q, S или Е в положении аминокислоты 1, более предпочтительно L, S или Е, еще более предпочтительно L;

(ii) S, А, Р, I или Y в положении аминокислоты 2, более предпочтительно А, Р, I или Y, еще более предпочтительно Р;

(iii) V, М или L в положении аминокислоты 4, более предпочтительно V или М, еще более предпочтительно V;

(iv) S, Е или Р в положении аминокислоты 7, более предпочтительно S или Е, еще более предпочтительно S;

(v) А или V в положении аминокислоты 11, более предпочтительно А;

(vi) Т, S или А в положении аминокислоты 14, более предпочтительно Т или S, еще более предпочтительно Т;

(vii) Н или Q в положении аминокислоты 46, более предпочтительно Н;

(viii) K, Т, S, N, Q или Р в положении аминокислоты 53, более предпочтительно Т, S, N, Q или Р;

(ix) R, Q или K в положении аминокислоты 82, более предпочтительно R или Q, еще более предпочтительно R;

(х) G, Т, D или А в положении аминокислоты 92, более предпочтительно G, Т или D, еще более предпочтительно Т; и

(xi) D, V, Т, Н или Е в положении аминокислоты 103, более предпочтительно V, Т, Н или Е, еще более предпочтительно V.

В следующем воплощении мутагенез дополнительно включает одну или несколько (предпочтительно все) замен в тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из:

(i) серина (S) в положении аминокислоты 12 по системе АНо или Кабата;

(ii) серина (S) в положении аминокислоты 103 по нумерации АНо (в положении аминокислоты 85 по нумерации Кабата); и

(iii) серина (S) или треонина (Т) в положении аминокислоты 144 по нумерации АНо (в положении аминокислоты 103 по нумерации Кабата).

В следующем аспекте изобретения предусмотрены выделенные каркасные остовы антител (например, каркасы scFv). Так, в различных воплощениях изобретения предусмотрены выделенные каркасные остовы тяжелой цепи, включающие аминокислотные последовательности, приведенные на фиг.9 (SEQ ID NO:1), фиг.10 (SEQ ID NO:2) или фиг.11 (SEQ ID NO:3). В других типичных воплощениях изобретения предусмотрены выделенные каркасные остовы легкой цепи, включающие аминокислотные последовательности, приведенные на фиг.12 (SEQ ID NO:4), фиг.13 (SEQ ID NO:5) или фиг.14 (SEQ ID NO:6). Такие каркасы можно использовать для инженерии иммуносвязывающих молекул, как то: антител scFv. Соответственно, в другом аспекте изобретения предусмотрен способ инженерии иммуносвязывающих молекул, содержащих последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и/или легкой цепи, который включает встраивание последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и/или легкой цепи соответственно в каркасный остов тяжелой цепи. В некоторых типичных воплощениях каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.9 (SEQ ID NO:1), фиг.10 (SEQ ID NO:2), фиг.11 (SEQ ID NO:3), SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9. В предпочтительном воплощении каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.9 (SEQ ID NO:1). В другом предпочтительном воплощении каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.10 (SEQ ID NO:2). В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.11 (SEQ ID NO:3). В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7. В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. В других типичных воплощениях каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.12 (SEQ ID NO:4), фиг.13 (SEQ ID NO:5), фиг.14 (SEQ ID NO:6), SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В предпочтительном воплощении каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.11 (SEQ ID NO:4). В другом предпочтительном воплощении каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.12 (SEQ ID NO:5). В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.13 (SEQ ID NO:6). В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:10. В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11. В следующем предпочтительном воплощении каркасный остов легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:12. Предпочтительно иммуносвязывающая молекула представляет собой антитело scFv, хотя в соответствии со способами изобретения можно создавать и другие описанные в нем иммуносвязывающие молекулы (например, полноразмерные антитела, Fabs, Dabs или нанотела). Изобретением также предусмотрены композиции иммуносвязывающих молекул, как то: антител scFv, созданных в соответствии со способами изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена блок-схема, излагающая общий принцип анализа антител scFv на основе последовательности в соответствии со способами изобретения.

На первой стадии берется последовательность scFv, подлежащего улучшению по растворимости и стабильности (блок 1), которая затем подвергается сравнению с последовательностями антител в базах данных (блок 2), как то: открытых базах данных по гаметным последовательностям (например, VBase, IMGT; блок 3), открытых базах данных по последовательностям зрелых антител (например, KDB; блок 4) или базах данных по чисто человеческим стабильным и растворимым фрагментам scFv (например, QC; блок 5).

Применение открытых баз данных по гаметным последовательностям типа приведенных в блоке 3 позволяет идентифицировать сильно консервативные положения, которые подвергались отбору в процессе эволюции и поэтому должны способствовать стабильности вариабельных доменов в контексте полноразмерных антител (блок 3'). Сравнение против открытых баз данных по последовательностям зрелых антител 4 позволяет идентифицировать структуры, представляющие улучшение стабильности, растворимости и/или связывания независимо от соответствующих участков CDR (блок 4'), Более того, сравнение против баз данных по чисто человеческим стабильным и растворимым фрагментам scFv (блок 5) приводит к идентификации остатков, критических для стабильности и/или растворимости конкретно в формате scFv, а также идентификации структур, представляющих улучшение стабильности, растворимости и/или связывания независимо от соответствующих участков CDR конкретно в формате scFv, например, комбинаций V_L и V_H (блок 5').

На следующей стадии (блок 6) проводится замена критических остатков наиболее частыми подходящими аминокислотами, идентифицированными в соответствующей базе данных.

Наконец (блок 7), может проводиться случайный или неслучайный мутагенез критических остатков и последующий скрининг на предмет улучшения стабильности и/или растворимости в дрожжевой системе QC. Мутанты могут быть снова подвергнуты вышеописанной процедуре (стрелка на блок 2).

На фиг.2 представлена блок-схема типичного многостадийного способа анализа антител scFv на основе последовательности.

На первой стадии (блок 1) определяется частота каждого остатка в каркасе путем сравнения встречаемости различных аминокислот в каждом положении на основе результатов, полученных методами биоинформатики. На второй стадии определяется степень консервативности по каждому положению, например, с помощью индекса Симпсона по формуле D=Σn_i(n_i-1)/N(N-1). На третьей стадии определяется наилучшая замена, которая сводит к минимуму суммарную свободную энергию (например, по закону Больцмана: ΔΔG_th=-RTln(f_{исходно}/f_{консенсус}). Наконец (стадия 4), определяется роль потенциальных стабилизирующих мутаций. При этом принимаются во внимание такие факторы, как локальные и нелокальные взаимодействия, канонические остатки, границы раздела, степень доступности и склонность к образованию β-структур.

На фиг.3 представлена схема типичной системы контроля качества (QC) для отбора стабильных и растворимых антител scFv в дрожжевых клетках. В этой системе происходит отбор клеток хозяина, способных экспрессировать стабильные и растворимые антитела scFv в восстановительной среде благодаря присутствию конструкции с индуцибельным репортером, экспрессия которого зависит от присутствия стабильного и растворимого слитого белка scFv-AD-Gal11p. При взаимодействии слитого белка с Gal4 (1-100) образуется функциональный фактор транскрипции, который активирует экспрессию селективного маркера (см. фиг.3А). Нестабильные и нерастворимые scFvs не способны образовать функциональный фактор транскрипции и индуцировать экспрессию селективного маркера, поэтому они исключаются из отбора (фиг.3В). Прошедшие отбор scFvs способны образовать структуру стабильного и растворимого белка даже в восстановительных условиях, при которых не образуются дисульфидные связи, тогда как нестабильные и/или нерастворимые scFvs обычно разворачиваются, подвергаются агрегации и/или деградации. А в окислительных условиях прошедшие отбор антитела scFv проявляют лучшие характеристики растворимости и стабильности.

На фиг.4 представлена схема другой типичной системы контроля качества (QC). Общая концепция отбора растворимых и стабильных scFv такая же, как и для фиг.3, но в этой версии scFv непосредственно сливается с функциональным фактором транскрипции, содержащим домен активации (AD) и ДНК-связывающий домен (DBD). На фиг.4А представлено типичное растворимое и стабильное антитело scFv, которое при слиянии с функциональным фактором транскрипции не мешает транскрипции селективного маркера. Напротив, на фиг.4В представлена такая ситуация, когда с фактором транскрипции слит нестабильный scFv, порождая нефункциональную слитую конструкцию, которая неспособна активировать транскрипцию селективного маркера.

На фиг.5 представлена схема анализа вариабельности по определенным каркасным (FW) положениям в нативных гаметных последовательностях до соматического мутагенеза (фиг.5А) и по соответствующим FW-положениям в последовательностях зрелых антител после соматического мутагенеза при отборе в системе QC (фиг.5В). Соответствующим FW-положениям (например, очень вариабельным каркасным остаткам ("hvFR")) в гаметных и QC-последовательностях можно поставить в соответствие различные значения вариабельности (т.е. значения "G" и "Q" соответственно). Если для определенного положения G>Q, то в этом положении имеется ограниченное число подходящих стабильных FW-остатков. Если же для определенного положения G<Q, то это может означать, что данный остаток прошел естественный отбор на оптимальную растворимость и стабильность.

На фиг.6 представлен профиль денатурации, наблюдавшийся у вариантов ESBA-105 после теплового воздействия в диапазоне температур от 25 до 95°C. Варианты ESBA-105 с обратными мутациями на гаметные консенсусные остатки (V3Q, R47K или V103T) указаны пунктиром. Варианты, содержащие предпочтительные замены, идентифицированные способами изобретения (QC11.2, QC15.2 и QC23.2), указаны сплошными линиями.

На фиг.7 представлено сравнение термостабильности у набора вариантов ESBA-105, содержащих консенсусные обратные мутации (S-2, D-2, D-3), обратную мутацию на аланин (D-1) или QC-остаток (QC7.1, QC11.2, QC15.2, QC23.2). Представлена термостабильность каждого варианта (в произвольных единицах разворачивания).

На фиг.8 представлен профиль денатурации, наблюдавшийся у вариантов ESBA-212 после теплового воздействия в диапазоне температур от 25 до 95°C. Варианты ESBA-212 с обратными мутациями на гаметные консенсусные остатки (V3Q или R47K) указаны пунктиром. Исходная молекула ESBA-212 указана сплошной линией.

На фиг.9 представлен каркасный остов scFv для семейства V_H1a. В первом ряду приведена нумерация вариабельной области тяжелой цепи по системе Кабата. Во втором ряду приведена нумерация вариабельной области тяжелой цепи по системе АНо. В третьем ряду приведена последовательность каркасного остова scFv (SEQ ID NO:1), причем в положениях, отмеченных как "X", данное положение может быть занято любым из аминокислотных остатков, приведенных под "X". Положения, отмеченные как "x", и участки, обозначенные как CDR H1, CDR H2 и CDR Н3, могут быть заняты любыми аминокислотами.

На фиг.10 представлен каркасный остов scFv для семейства V_H1b. В первом ряду приведена нумерация вариабельной области тяжелой цепи по системе Кабата. Во втором ряду приведена нумерация вариабельной области тяжелой цепи по системе АНо. В третьем ряду приведена последовательность каркасного остова scFv (SEQ ID NO:2), причем в положениях, отмеченных как "X", данное положение может быть занято любым из аминокислотных остатков, приведенных под "X". Положения, отмеченные как "x", и участки, обозначенные как CDR H1, CDR H2 и CDR Н3, могут быть заняты любыми аминокислотами.

На фиг.11 представлен каркасный остов scFv для семейства V_H3. В первом ряду приведена нумерация вариабельной области тяжелой цепи по системе Кабата. Во втором ряду приведена нумерация вариабельной области тяжелой цепи по системе АНо. В третьем ряду приведена последовательность каркасного остова scFv (SEQ ID NO:3), причем в положениях, отмеченных как "X", данное положение может быть занято любым из аминокислотных остатков, приведенных под "X". Положения, отмеченные как "x", и участки, обозначенные как CDR H1, CDR H2 и CDR Н3, могут быть заняты любыми аминокислотами.

На фиг.12 представлен каркасный остов scFv для семейства Vκ1. В первом ряду приведена нумерация вариабельной области легкой цепи по системе Кабата. Во втором ряду приведена нумерация вариабельной области легкой цепи по системе АНо. В третьем ряду приведена последовательность каркасного остова легкой цепи scFv (SEQ ID NO:4), причем в положениях, отмеченных как "X", данное положение может быть занято любым из аминокислотных остатков, приведенных под "X". Положения, отмеченные как ".", и участки, обозначенные как CDR L1, CDR L2 и CDR L3, могут быть заняты любыми аминокислотами.

На фиг.13 представлен каркасный остов scFv для семейства Vκ3. В первом ряду приведена нумерация вариабельной области легкой цепи по системе Кабата. Во втором ряду приведена нумерация вариабельной области легкой цепи по системе АНо. В третьем ряду приведена последовательность каркасного остова легкой цепи scFv (SEQ ID NO:5), причем в положениях, отмеченных как "X", данное положение может быть занято любым из аминокислотных остатков, приведенных под "X". Положения, отмеченные как ".", и участки, обозначенные как CDR LI, CDR L2 и CDR L3, могут быть заняты любыми аминокислотами.

На фиг.14 представлен каркасный остов scFv для семейства Vλ1. В первом ряду приведена нумерация вариабельной области легкой цепи по системе Кабата. Во втором ряду приведена нумерация вариабельной области легкой цепи по системе АНо. В третьем ряду приведена последовательность каркасного остова легкой цепи scFv (SEQ ID NO:5), причем в положениях, отмеченных как "X", данное положение может быть занято любым из аминокислотных остатков, приведенных под "X". Положения, отмеченные как ".", и участки, обозначенные как CDR L1, CDR L2 и CDR L3, могут быть заняты любыми аминокислотами. В некоторых предпочтительных воплощениях положения 58 и 67-72 по АНо в CDR L1 соответственно заняты следующими остатками: D и NNQRPS.

На фиг.15 представлены графики растворимости при осаждении с помощью PEG для ESBA-105 дикого типа и его вариантов по растворимости.

На фиг.16 представлены профили тепловой денатурации для ESBA-105 дикого типа и его вариантов по растворимости при измерении после тепловой обработки в широком диапазоне температур (25-96°C).

На фиг.17 представлен гель SDS-PAGE, на котором видны проявления деградации у различных мутантов по растворимости ESBA-105 после 2-недельной инкубации в условиях теплового воздействия.

Раскрытие изобретения

Изобретение касается способов инженерии и оптимизации свойств иммуносвязывающих молекул на основе последовательности, в частности свойств антител scFv, в том числе стабильности, растворимости и/или аффинности. Более конкретно в настоящем изобретении раскрыты способы оптимизации антител scFv с помощью анализа последовательности антител для идентификации подлежащих мутагенезу положений аминокислот с тем, чтобы улучшить одно или несколько физических свойств scFv. Изобретение также касается искусственных иммуносвязывающих молекул, например, антител scFv, полученных или получаемых в соответствии со способами изобретения.

Изобретение основывается, по крайней мере частично, на анализе частоты аминокислот в каждом каркасном положении тяжелых и легких цепей во множественных базах данных по последовательностям антител. В частности, анализ частоты в базах данных по последовательностям антител (например, по гаметным или последовательностям зрелых антител, например, в базе данных Кабата) подвергается сравнению с анализом частоты в базе данных по последовательностям scFv, отобранным как обладающие требуемыми функциональными свойствами. Каждому каркасному положению ставится в соответствие степень вариабельности (например, с помощью индекса Симпсона) и проводится сравнение степени вариабельности по каждому каркасному положению в базах данных по последовательностям различных типов антител, что дает возможность идентифицировать каркасные положения, важные для функци