Антиоксидантное и мембраностабилизирующее средство

Антиоксидантное и мембраностабилизирующее средство

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано как антиоксидантное и мембраностабилизирующее средство, обладающее гепатотропным, липотропным (гиполипидемическим и антисклеротическим) действием, при лечении ряда заболеваний: хронических гепатитов (воспаление ткани печени) и жировой дистрофии печени (заболевание, связанное с нарушением обмена жиров); атеросклерозе сосудов сердца и головного мозга с нарушением мозгового кровообращения и наличием неврологической и психопатологической симптоматики; облитерирующем эндартериите с микроциркуляторными нарушениями (заболеваниями артерий конечностей с уменьшением их просвета). Заявителями средству дано название «ДИРОНАКС».

Многочисленные мембранные структуры клеток организма выработаны в процессе длительной эволюции форм организации клеточного пространства, фиксирования ферментных систем и регуляции метаболизма. Доказано, что при многих болезнях в первую очередь страдают именно клеточные мембраны, особенно их липидный компонент, в норме обеспечивающий жидкостность мембран, оптимальные условия для функционирования встроенных в мембрану ферментов, транспортных белков, многочисленных рецепторов. Повреждение липидного компонента мембран эпителия пораженного органа приводит к нарушению клеточного гомеостаза, что является причиной избыточного активирования процессов свободнорадикального окисления, сопровождающего различную патологию. В связи с этим эффективность комплексной терапии во многом зависит от степени защиты структуры и функции клеточных мембран и ограничении активности процессов свободнорадикального окисления, поэтому при любой патологии обосновано включение в лечебный комплекс мембраностабилизирующих и антиоксидантных средств. Данные средства могут быть использованы как монотерапия для лечения и профилактики болезней, в основе которых лежит первичное повреждение клеточных мембран и усиление свободнорадикального окисления, так и в качестве защиты от различных повреждающих воздействий (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений. // Проблемы эндокринологии. - 2000. - №6. - С.29-34; Никитин И.Г., Сторожаков Г.И, Федоров И.Г. и др. Состояние кишечной микрофлоры у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - №5. - С.40-44; Яковенко Э.П., Григорьев П.Я. Хронические заболевания печени: диагностика и лечение // Рус. мед. жур. - 2003. Т.11. - №5. С.291). К сожалению, на сегодняшний день, несмотря на обширный арсенал современных мембраностабилизирующнх и антиоксидантных средств, поиск, разработка и внедрение в медицинскую практику новых препаратов данного направления продолжает оставаться актуальным. Это обусловлено тем, что разработка терапии, направленной на восстановление утраченных функций органов, оставляет актуальной потребность в препаратах, обладающих эффективными фармакологическими свойствами, низкой токсичностью и незначительным побочным действием (Оковитый С.В. и др., Анохин Б.М., Кузьминова Е.В., Семененко М.П. и др., 2011. «Клиническая фармакология антиоксидантов». // Клиническая фармакология. Избранные лекции. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 602 с.).

Аналогом предполагаемого средства является «Пангамовая кислота» (синонимы VitB15, «Кальгам» «Кальция пангамат»). Витаминное, гепатотропное, липотропное мембраностабилизирующее средство.

Кальция пангамат (витамин В15) - кальция пангамат белый аморфный порошок характерного аминного запаха и горького вкуса, хорошо растворимый в воде (1:1), нерастворимый в спирте, эфире и ацетоне. Разрушается в щелочной среде. Термоустойчив.

Производитель: Вектор ГНЦ вирусологии и биотехнологии (Россия) Регистрационный номер: 95/335/839. Дата регистрации: 29.11.1995. Состав: смесь кальциевой соли эфира глюконовой кислоты и диметилглицина с глюконатом кальция и хлоридом кальция в соотношении не более 70%, не менее25%.

Наиболее характерным для кальция пангамата является метилирующее влияние на нормализацию окислительных процессов в клеточных структурах и повышение детоксицирующих реакций в организме. Одно из интересных свойств кальция пангамата - его способность передавать метальные радикалы другим молекулам. Дело в том, что пангамат кальция может образовывать многометильные соединения, которые, в свою очередь, могут являться метальным донатором в биосинтезе липидных структур клеточных мембран и многих важных для организма соединений. Кроме того, он активизирует ферменты дыхания Кребса, благодаря чему восстанавливается нарушенная обменная активность клеточной мембраны (Машковский М.Д. «Лекарственные средства» в двух томах, т.2. - М.: «Издательство Новая волна», 2000, стр.90-91; или «Химическая энциклопедия», т.1. - М.: «Советская энциклопедия»; или «Микронутриенты и их взаимодействие», Российский медицинский журнал, т.16, №7, 2008 г.). Недостатки: пангамовая кислота может вызвать (особенно у пожилых людей) следующие явления: общее ухудшение состояния, сильные головные боли, прогрессирование адинамии, бессонницу, раздражительность, тахикардию и нарушения в работе сердца, категорически противопоказана при глаукоме и артериальной гипертонии. Чем больше применяется пангамовая кислота, тем яснее, что она помогает лишь в сочетании с другими более действенными лечебными средствами.

Ближайшим аналогом предлагаемого средства является препарат «Триотриозолин». Международное название - Thiotriazoline. Антиоксидантный и мембраностабилизирующий препарат. Владелец рег. удостоверения: Галичфарм АО (Украина). Регистрационный номер: ЛСР-002170/10.

Предупреждает повреждение и гибель клетки, снижает степень жировой инфильтрации и распространенность центролобулярного некроза, активирует процессы репаративной регенерации поврежденных клеток, нормализует в них белковый, углеводный, липидный и пигментный обмен. Тиотриазолин активирует антиоксидантную систему и тормозит процессы окисления липидов в поврежденных клетках, стабилизирует и уменьшает размеры зоны некроза и ишемии поврежденных воспалением тканях. Улучшает реологические свойства крови за счет активации фибринолитической системы.

Антиоксидантные свойства проявляются благодаря наличию в структуре молекулы тиотриазолина тиола серы, который обладает окислительно-восстановительными свойствами третичного азота, связывающего избыток ионов водорода. Тиотриазолин реагирует с активными формами кислорода и липидными радикалами за счет выраженных восстановительных свойств тиольной группы и предупреждает инициирование активных форм кислорода путем реактивации антирадикальных ферментов - супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы.

Недостатками данного препарата являются его побочные действия:

Со стороны пищеварительной системы: тошнота, сухость во рту, вздутие живота.

Со стороны ЦНС: общая слабость, головокружение, шум в ушах.

Со стороны сердечнососудистой системы: тахикардия, повышение АД, боль в области сердца, аритмии.

Со стороны дыхательной системы: редко - одышка. Приступы удушья.

Задачи предлагаемого средства:

- улучшение абсорбции;

- уменьшение выраженного воспаления;

- стимуляция регенерации печени;

- обеспечение метаболизма при патологии печени;

- исключение токсичности и побочных действий препарата.

Сущностью предполагаемого антиоксидантного и мембраностабилизирующего средства является то, что оно представляет собой композицию активных действующих веществ, включающего в качестве целевых ингредиентов следующие вещества, в %:

Диизопропиламмоний дихлорацетат - 9,63-9,64;

микрокристаллическая целлюлоза МКЦ (MCC SANAQ burst 100) - 28,90-28,92;

лактоза (200 mech) - 57,8-57,86;

и наполнители:

аэросил - 0,58-0,60;

примогель - 2,51-2,40;

кальция стеарил фумарат - 0,58 - -0,58.

Технический результат от использования данного средства определяется действием веществ, входящих в его состав:

- Диизопропиламмоний дихлорацетат. Эмпирическая формула C₈H₁₇Cl₂NO_2. Молекулярная масса: 230.13. Белый кристаллический порошок горького вкуса. Легко растворим в воде и спирте. Получают путем гидролиза этилового эфира дихлоруксусной кислоты. Технология получения разработана ООО «Поливит» (г. Уфа). Метаболическое влияние диизопропиламмония дихлорацетата обусловлено улучшением функционального состояния печени, липидного обмена, направлено на восстановление гомеостаза в печени, повышение ее устойчивости к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию в печени процессов регенерации, повышением активности эндотермических реакций с нормализацией окислительно-восстановительных процессов и микроциркуляции при синдроме периферической ишемии. Оказывает липотропное действие, благоприятно влияет на антитоксическую и пигментную функцию печени, повышает устойчивость организма к гипоксии и различного рода интоксикациям.

Механизм действия диизопропиламмония дихлорацетата обусловлен его антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием. Он ингибирует процессы перекисного окисления липидов, повышает активность супероксидоксидазы, повышает соотношение липид-белок, уменьшает вязкость мембраны, увеличивает ее текучесть. Модулирует активность мембраносвязанных ферментов (кальций-независимой фосфодиэстеразы, аденилатциклазы, ацетилхолинэстеразы), рецепторных комплексов (бензодиазепинового, ацетилхолинового), что усиливает их способность связывания, способствует сохранению структурно-функциональной организации биомембран. Вызывает активацию энергосинтезирующих функций митохондрий, стабилизацию клеточных мембран.

Диизопропиламмоний дихлорацетат способствует улучшению реологических свойств крови, в частности препарат увеличивает способность мембран эритроцитов к деформации и снижает адгезию эритроцитов к эндотелию сосудов, уменьшает агрегацию тромбоцитов, снижает уровень фибриногена, уменьшая, таким образом, вязкость крови. Препарат устраняет спазм гладкомышечного слоя сосудов, улучшает микроциркуляцию в органах.

Мембраностабилизирующий эффект препарата осуществляется за счет снижения микровязкости мембран и нормализации проницаемости фосфолипидного слоя мембран.

Гепатотропное и липидотропное действие препарата осуществляется за счет снижения степени жировой инфильтрации, уменьшения распространения центролобулярных некрозов печени и повышения способности тканей печени к регенерации. Кроме того, приводит к улучшению липидного, белкового, углеводного и пигментного обмена в клетках печени и препятствует их гибели. Препарат повышает компенсаторную активность анаэробного гликолиза, стимулирует процессы окисления в цикле Кребса, сохраняя при этом внутриклеточный фонд АТФ. Все эти свойства данного вещества способствуют подавлению фиброгенеза печеночной ткани при острых и хронический гепатитах.

Показания к применению. Диизопропиламмоний дихлорацетат используют в комплексной терапии заболеваний периферических артерий конечностей смикроциркуляторными нарушениями; атеросклероза венечных сосудов I-II-III стадии с нарушением ритма и расстройством кровообращения; атеросклероза сосудов головного мозга с нарушением мозгового кровообращения наличием неврологической и психопатологической симптоматики; хронических заболеваний легких с нарушением газообмена I-II-III степени; жировой дистрофии печени и хронических гепатитов.

- Микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) в композиции предполагаемого средства является ингредиентом действующего начала.

МКЦ - порошкообразная не волокнистая модификация природной целлюлозы является пищевым ингредиентом, с помощью которого можно уменьшать калорийность пищи, не теряя при этом ее органолептические свойства. МКЦ устраняет энергетическую избыточность диеты, что способствует нормализации обмена веществ, снижению риска инфаркта миокарда и инсульта. Микрокристаллическая целлюлоза снижает уровень сахара и холестерина в крови; способствует стабильному снижению массы тела; связывает токсины и уменьшает нагрузку на органы детоксикации; снижает риск развития злокачественных образований; повышает общий уровень физической работоспособности.

Микрокристаллическая целлюлоза это - очищенная, частично деполимеризованная альфа-целлюлоза, получаемая в результате обработки древесной пульпы минеральными кислотами (обычно соляной кислотой) с последующей нейтрализацией, многократной промывкой, фильтрацией и высушиванием. В результате получается белый порошок без вкуса и запаха, состоящий из пористых агломерированных частиц. Целлюлоза микрокристаллическая представляет собой легкосыпучий белоснежный порошок со степенью кристалличности 70-85% и средней длиной кристаллов 7-10 нм. Химическая формула: (С₆Н₁₀О₅)n. Действие микрокристаллической целлюлозы при поступлении в организм включает несколько взаимосвязанных этапов: связывание токсических веществ, поступающих в просвет кишечника из крови, и предупреждение, таким образом, их обратного всасывания; очищение пищеварительных соков, содержащих значительное количество токсических веществ; модификация липидного и аминокислотного спектров содержимого кишечника за счет избирательной сорбции некоторых аминокислот, свободных жирных кислот и др.; биотрансформация высокотоксичных продуктов в менее токсичные или даже нетоксичные вещества. МКЦ выступает в качестве катализатора ферментов, способствует лучшему взаимодействию продуктов жизнедеятельности организма, ферментов, витаминов и других веществ, ускоряя процесс их биотрансформации и уменьшая количество промежуточных метаболитов. Это ускорение происходит за счет увеличения поверхности границы раздела "твердое вещество - жидкость" (сорбент-содержимое кишечника). При этом имеет значение геометрическая поверхность МКЦ, с которой взаимодействуют крупные белковые молекулы, например ферменты, а удельная поверхность средних и малых пор (мезо- и микропор) не играет роли, поскольку для крупных молекул доступны только макропоры. Таким образом, МКЦ выступает в роли активатора каталитических процессов биотрансформации токсических веществ в менее токсичные метаболиты. Токсические метаболиты, в первую очередь молекулы средней молекулярной массы (так называемые средние молекулы), деструктируют или существенно нарушают функциональное состояние плазматической мембраны гепато- и кардиоцитов, эритроцитов и других клеток. Роль непосредственного катализатора за счет активации окислительных реакций, дезактивации пероксидных соединений, трансформирования молекул играет содержащийся в порах кислород. Немаловажным для оценки эффективности микрокристаллической целлюлозы следует считать нормализацию липидного спектра, снижение уровня свободного холестерола, липопротеинов низкой и очень низкой плотности. При этом МКЦ не оказывает никакого побочного действия, характерного для других липид-снижаюших лекарственных средств.

Поскольку в реакциях такого типа катализатор остается неизмененным, эти процессы наблюдаются в течение всего времени нахождения МКЦ в кишечнике, т.е. по механизму действия, является химически инертным соединением и не вступает в химические реакции с веществами, которые на нем адсорбируются.

Элиминация токсических веществ, образующихся в кишечнике, оказывает положительное воздействие на печень и сердечно-сосудистую систему, улучшая их функциональное состояние.

Показания:

МКЦ применяют при: ожирении; сахарном диабете; атеросклерозе, ишемической болезни сердца; микробной и химической интоксикации, при отравлении тяжелыми металлами (для выведения их из организма); для нормализации функции пищеварения (при гастроэнтерологических заболеваниях); для профилактики новообразований, инфаркта миокарда и инсульта.

Лактоза (Lactochem) молочный сахар - основная часть молочной сыворотки. Лактоза нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта, участвует в процессе кроветворения и в синтезе белков печени, способствует усилению деятельности ферментов; улучшает работу почек и нормализует функции печени, выводит из организма лишнюю жидкость, тем самым способствуя оптимальному выводу шлаков и токсинов, помогает при ревматизме, гипертонии, улучшает кровообращение и предотвращает развитие атеросклероза, уменьшает воспалительные процессы (на коже, слизистой, в желудке и кишечнике), действует успокаивающе на нервную систему. Также способствует нормализации и оздоровлению микрофлоры кишечника, устранению гнилостных процессов, вызываемых недоброкачественными продуктами.

Лактоза - дисахарид, состоящий из остатков D-галактозы и D-глюкозы, существует в нескольких полиморфных модификациях. Получают лактозу из сыворотки молока. Лактоза по современной номенклатуре углеводов относится к классу олигосахаридов, а именно дисахаридов. Молекула лактозы состоит из остатков молекул глюкозы и галактозы. Химическая формула лактозы C₁₂H₂₂O₁₁. При кипячении с разбавленной кислотой происходит гидролиз лактозы при взаимодействии с раствором щелочи окисляется до сахариновых кислот. Лактоза сравнительно легко подвергается воздействию ферментов продуцируемых микроорганизмами. Распад лактозы осуществляется под действием лактазы, продуцируемой стенками кишечника и микроорганизмами. Лактоза реализует свое действие только в толстой кишке, где служит источником энергии и питательным субстратом, главным образом для бифидо- и лактобактерий. Конечными продуктами метаболизма лактозы является молочная кислота, которая обладает гипохолестеринемическим, гиполипидемическим, антипролиферативным, осмотическим действием и соответствующим послабляющим эффектом. В толстом кишечнике Лактоза является пищевым субстратом сахаролитической микрофлоры: бифидо- и лактобактерий, которые относятся к полезной микрофлоре. Активно развиваясь, бифидобактерии и лактобактерий продуцируют органические кислоты, что ведет к угнетению жизнедеятельности патогенных микроорганизмов, в результате сокращается проникновение в кровь токсинов (нейротоксинов, канцерогенов и т.п.) - продуктов жизнедеятельности патогенных бактерий.

Расщепляясь, лактоза высвобождает ион водорода, который связывает свободный аммиак, увеличивает диффузию аммиака из крови в кишечник и способствует выделению аммиака из организма. При употреблении Лактозы осуществляется перевод аммиака в невсасываемый в кровь через стенку кишечника аммоний, предотвращая тем самым отравление организма и обеспечивая защиту ЦНС от нейротоксинов.

В толстом кишечнике под воздействием лактозы меняется осмотическое давление, что ведет к перераспределению воды из организма в просвет кишечника. В результате, лактоза оказывает слабительный эффект и нормализует работу кишечника.

Эффект лактозы достигается за счет следующих механизмов действия:

подавление протеолитических бактерий;

увеличение количества ацидофильных бактерий (например, лактобацилл);

поглощение аммиака толстым кишечником;

очищение кишечника благодаря низкому показателю рН;

наличие осмотического эффекта;

уменьшение азотосодержащих токсических веществ путем стимуляции бактерий, связывающих аммиак в процессе белкового синтеза.

Лактоза не уменьшает абсорбцию витаминов и не вызывает привыкания.

Аэросил - микронизированный порошок с выраженными адсорбционными свойствами. Адсорбционные свойства используют с целью стабилизации сухих экстрактов (уменьшается их гигроскопичность). Высокодисперсный, высокоактивный, аморфный, пирогенный диоксид кремния. Продукт пожаро- и взрывобезопасен, не оказывает общетоксического действия. При попадании в легкие Аэросил не вызывает силикоза. Он обладает хорошими адсорбционными свойствами, особенно к полярным веществам. Аэросил нашел многостороннее применение, которое полностью основано на таких свойствах, как чрезвычайно маленькие размеры частиц, их однородность, сферическая форма и высокая степень чистоты. Аэросил представляет собой очень чистый аморфный непористый диоксид кремния с размером частиц от 5 до 40 нм. Это чрезвычайно легкий белый порошок, который в тонком слое кажется полупрозрачным, голубоватым. Частицы Аэросила образуют физические хлопьевидные агрегаты, поэтому объем Аэросила фактически на 98% заполнен воздухом: если истинная плотность SiO₂ составляет 2,2 г/см³, то кажущаяся плотность Аэросила - 40-60 г/л. С химической точки зрения все свойства Аэросила определяются наличием на его поверхности силанольных Si-OH и силоксановых Si-O-Si групп, при помощи этих групп происходит десорбция ранее адсорбированных веществ, например лекарственных средств, что способствует их полному беспрепятственному всасыванию в просвете кишечника. Отвлекает на свои силановые и силоксановые группы окисляющие радикалы, сохраняя этим активность тиоловых групп различных биологически активных веществ, в частности глутатиона, и участвует в предотвращении перекисного окисления липидов (ПОЛ), что способствует стабилизации клеточных мембран («Клиническая фармакология антиоксидантов» // Оковитый С.В. // Клиническая фармакология. Избранные лекции. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 602 с.).

Примогель - высокоэффективный современный наполнитель при получения таблеток методом прямого прессования. Является особо привлекательным, так как обеспечивает стабильность действующих веществ в таблетках, дает хороший экономический эффект, экологическую чистоту производства, более высокую биодоступность лекарственных веществ. Примогель - натриевая соль карбоксиметилированного крахмала (Na гликолят крахмала) - это продукт частичной этерификации гидроксильных групп картофельного крахмала. Является отличным дезинтегрантом и солюбилизатором, широко применяемым в фармацевтической промышленности. Механизм дезинтеграции таблеток с примогелем обеспечивается за счет высокой степени набухания (поперечно сшитые молекулы), его высокой дезинтеграционной силы, а также воды, участвующей в процессе повреждения структуры таблетки. При этом происходит глубинное разрушение таблетки и высвобождение активных ингредиентов. Кроме того, Примогель обеспечивает хорошую сыпучесть и однородность порошкообразной массы, что особенно проявляется при работе на промышленном оборудовании.

Представляет собой легко сыпучий белый порошок без вкуса и запаха, быстро набухающий в воде, очень гигроскопичный. Вещество нетоксично и безопасно в использовании. Продукт отвечает требованиям Британской, Европейской и Немецкой Фармакопей и Фармакопеи США и его производство осуществляется в соответствии с правилами GMP (Емшанова С.В., Сафронова Н.А., Буракова М.А. и др. «К вопросу создания таблетированных лекарственных форм, содержащих влагопоглощающие лекарственные вещества», Всесоюзная юбилейная конференция ЛХФИ: Тез. докл. - Л., - 1990. - С.85) - Стеарил фумарат кальция (LubriSanaq) - наполнитель, высокоэффективный современный любрикант. Является альтернативой классическому любриканту - стеарату магния. Более высокая температура плавления делает его предпочтительным наполнителем, используемым при применении технологии высокоскоростного прямого прессования. Рекомендуется для шипучих и жевательных рецептур, так как не придает таблетке металлического вкуса. Стеарил фумарат кальция представляет собой белый порошок со средним размером частиц около 15 нм, относительно инертен, что приводит к улучшению стабильности рецептуры. Совместим со всеми включенными в состав Диронакса ингридиентами. Кальция стеарил фумарат гидрофилен, ускоряет распадаемость таблетки и скорость растворения, не придает неприятного металлического привкуса, обеспечивает хорошую твердость, требует меньшей силы сжатия, уменьшает износ оборудования, уменьшает необходимую силу выталкивания, менее чувствителен к увеличению времени перемешивания. Выпускается согласно Ph. Eur, NF, JP, код ТН ВЭД 2917199000. Процесс разрушения твердой формы при контакте с водой или желудочным соком очень важен и является необходимым условием для обеспечения высокой биодоступности и эффективности препарата. Кроме того, распадаемость таблеток относится к предшествующим для процесса растворения и всасывания активных компонентов средства. Относительно хорошая сыпучесть и достаточно высокий коэффициент прессуемости. Благодаря сочетанию технологических свойств примогель обладает хорошим дезинтегрирующим действием, повышающим прочность таблеток, обеспечивает получение таблеток с хорошими показателями.

Антиоксидантное, мембраностабилизирующее, гепатотропное, липотропное и антисклеротическое действие предлагаемого средства, а также его низкая токсичность и отсутствие побочных действий были обоснованы в результате апробации, проведенной на животных и группе волонтеров.

Заявленное средство испытано на белых крысах двух возрастных групп: молодые (6-8 мес.) и старые (26-28 мес.). Все подопытные животные были здоровы. При постановке опытов были использованы физиологические, клинические, токсикологические, морфологические, биохимические и другие методы исследований. Предлагаемое средство обеспечивает адсорбцию токсинов, снижает воспалительные процессы в организме, стимулирует регенерацию печени, обеспечивает метаболизм, нетоксично.

Изучение острой и хронической токсичности предлагаемого средства. Основной целью проведения апробации по определению токсичности препарата было установление LD при однократном внутрижелудочном введении средства. Исследуемый образец средства опытным группам лабораторных животных вводили в виде суспензии в желудок с помощью зонда в диапазоне доз от 20 мг до 300 мг.

Введение проводилось однократно, индивидуально. Животным контрольной группы в тех же объемах вводили дистиллированную воду. В течение 14 дней за животными велись наблюдения.

Показателями определения острой токсичности служили: внешний вид, состояние кожного покрова, поведение (возбуждение или угнетение, подвижность, изменение походки, реакции на внешние раздражения, выделения из глаз, рта, мышечные подергивания, тремор, судороги, параличи, парезы и т.д.), потребление корма, изменение массы тела, динамика морфологического состава крови.

Параметры субхронической токсичности изучались на белых крысах.

Опытным группам животных давали ежедневно средство в смеси с кормом в дозах 1/10, 1/20 и 1/50 от максимально введенных доз в течение 30 дней. Контрольные группы животных получали обычный рацион, без кормовой добавки.

При ежедневных наблюдениях учитывали клинические показатели: общее состояние, аппетит, показатели дыхания, пульса, температуры тела, функции органов пищеварения и мочеотделения, динамику прироста массы тела. Взвешивание животных осуществляли в начале опыта, через 20 и 30 дней. Кровь для исследований отбирали от 5 животных каждой группы на 1 и 30 сутки, в которой определяли морфологические и биохимические показатели.

По завершении апробации был произведен убой животных с целью проведения патологоанатомического анализа органов и тканей согласно Курсу патогистологической техники (Меркулов Г.А., 1969).

Проводили патологоанатомическую оценку внутренних органов и определение их весовых показателей. Из каждой группы было исследовано по пять животных.

Анатомический метод был использован для изучения формы, размеров и топографии органов. Органы и ткани подвергали препарированию и описывали. Гистологический метод использовали для изучения микроструктуры органов и тканей.

У животных опытных и контрольной групп определяли абсолютные и относительные массы внутренних органов, позволяющие проследить отклонения от существующих стандартных норм под воздействием средства. При гематологических исследованиях определяли количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, выводили лейкоформулу, содержание гемоглобина (гемоглобинцианидным методом), высчитывали цветовой показатель, СОЭ в аппарате Панченкова, гематокрит в капиллярах с центрифугой МЦГ-8.

Биохимические исследования состояли из определения в сыворотке крови общего белка (колориметрически), белковых фракций (нефелометрически), мочевины (цветной реакцией с диацетилмонооксимом и тиосемикарбазидом), общего кальция (с орто-кризолфталеином), неорганического фосфора (с ванадат-молибдатным реактивом), глюкозы (ферментативно). Активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, мочевую кислоту, билирубин, холестерин, общие липиды, креатинин оценивали с помощью наборов фирмы ДДС. Микроэлементный состав крови (железо, цинк, медь) исследовался атомно-абсорбционным методом.

Оценку гепатотропного действия предпологаемого средства проводили при повреждении печени на экспериментальной модели острого гепатита у крыс, вызванного CCl₄ (четырех хлористый углерод).

Оценку эффективности средства проводили по степени нормализации биохимических показателей основных патологических синдромов, наблюдающихся при поражениях печени: цитолиза - активности в сыворотке АлАт, АсАт; холестаза - активности в сыворотке крови ЩФ, содержанию билирубина; белково-синтетической (содержание общего белка); липидного (содержание холестерина) обменов, показателей перикисного окисления липидов (диеновых коньюгатов и малонового диальдегида).

В результате проведенных исследований отмечено, что однократное и длительное применение средства в различных дозах хорошо переносится лабораторными животными, не оказывая вредного влияния на организм. На протяжении всего срока эксперимента гибели не наблюдалось, крысы были клинически здоровы, с хорошо выраженным аппетитом. Визуально не выявлено каких-либо изменений в поведении опытных животных в сравнении с контролем. При длительном скармливании средства белым крысам была выявлена положительная динамика прироста массы тела в опытных группах на 10,5% (таблица №1).

Таблица №1
Динамика изменения массы тела крыс при применении средства
Группа животных	Время исследования
Начало опыта (масса тела в граммах)	30-й день эксперимента (масса тела в граммах)
1-опытная	154,3	192,3
2-опытная	153,6	195,7
3-опытная	152,7	199,7
Контрольная	155,4	193,5

Летальная доза предполагаемого средства не установлена.

Исследования крови (таблица 2) подтвердили вывод о малой токсичности препарата, поскольку все анализируемые показатели крови опытных животных существенно не отличались от таковых в контроле и находились в пределах границ нормы.

При этом количество эритроцитов во второй и третьей опытных группах отличалось более высокими значениями в сравнении с показателями первой опытной группы и контроля. Повышение данного показателя к окончанию опытного периода составило 2,9% и 5,8% соответственно. В крови крыс опытных групп наблюдалось увеличение гемоглобина (на 1,9-8,7% в среднем по группам). Однако это повышение проявлялось в пределах нормы, характерной для данного вида животных опытной группе.

В биохимических показателях крови опытных животных статистически значимых изменений в сравнении с контрольными аналогами также установлено не было. Постоянное клиническое наблюдение за животными при длительном скармливании средством показало, что состояние животных было удовлетворительным, аппетит сохранен, подвижность соответствовала физиологическому уровню, характерному для данного возраста. Нарушений в координации движений не отмечалось.

Таблица №2
Влияние средства на гематологические показатели в субхроническом опыте
Показатели	Фон	Группы животных
1-опытная	2-опытная	3-опытная	контрольная
Эритроциты 1012/л	7,0±0,02	6,8±0,09	7,0±0,07	7,2±0,11	6,8±0,05
Лейкоциты 109/л	14,7±0,92	13,9±0,58	14,6±0,70	15,6±0,84	14,9±0,92
Гемоглобин, г/л	160,2±7,21	162,1±5,1	167,5±9,20	173,0±6,5	159,1±7,33
Лейкоформула %:
базофилы	0	0	1,3±0,05	0	1,1±0,02
эозинофилы	3,1±0,06	2,4±0,07	2,0±0,02	3,5±0,04	3,1±0,03
Нейтрофилы:
юные	0	0	0	0	0
палочкоядерные	2,1±0,05	3,6±0,04	4,2±0,05	2,3±0,04	4,4±0,07
сегментоядерные	30,8±3,1	29,1±1,6	28,5±0,9	32,6±1,84	33,6±3,5
лимфоциты	61,9±5,3	62,5±7,1	62,3±3,8	59,7±5,2	55,4±4,7
моноциты	2,1±0,6	1,8±0,51	1,7±0,37	2,2±0,44	2,6±0,51

Результаты апробации по изучению влияния средства на функциональное состояние печени при длительном употреблении показали, что применение препарата в различных дозировках не вызывает угнетения ее активности.

При патоморфологическом и гистологическом исследовании органов и тканей экспериментальных животных отклонений и каких-либо особенностей в строении выявлено не было.

Абсолютные и относительные массы внутренних органов крыс, позволяющие проследить отклонения от существующих стандартных норм под воздействием средства, существенно не отличались от таковых показателей в контроле, что свидетельствует об отсутствии дополнительной нагрузки на органы, токсическом воздействия изучаемого средства и о его хорошей переносимости организмом.

В эксперименте установлено, что длительное применение средства не оказывает отрицательного влияния на функции органов пищеварения и мочеотделения.

Для оценки эффективности изучаемого препарата в качестве мембраностабилизирующего и антиоксидантного средства изучено влияние на следующие показатели:

- активность мембраносвязанных ферментов (транспортных АТФ-аз, оксидаз смешанной функции);

- внутри-внеклеточные перераспределения электролитов;

- содержание продуктов перекисного окисления липидов (гидроперекисей, малонового диальдегида).

Исследования выполнены на 60 белых крысах двух возрастных группах - молодые (6-7 мес.) и старые (24-26 мес.). Препарат вводили один раз в сутки орально в дозе 20 мг в течение 20 дней. После окончания опыта животных забивали декапитацией. Определялась активность транспортных (Na+/K+) АТФ-аз и Са+ АТФ-аз мембран миокарда, почек и активность ферментов эндоплазматического ретикулума печени (n-гидроксилазы, N-деметилазы, цитохрома Р-450).

Микросомальную фракцию печени, содержащую мембраны саркоплазматического ретикулума и плазматические мембраны, выделяли модифицированным методом Kidwal.

Для определения общей АТФ-азной активности состав инкубационной пробы был следующим: 2 ммоль NaCl - АТФ, 5 ммоль MgCl₂ 6Н₂О, 140 ммоль NaCl, 14 ммоль KCl, 20 моль трис HCl. Объем пробы составлял 2 мл. Конечная концентрация белка в пробе составляла 2,5-3,0 мг.

Для определения Mg²⁺ АТФ-азы в пробы добавляли не KCl, а строфантин. Активность Na+/K+ АТФ-азы определяли по разности между общей АТФ-азной активностью и активностью Mg²⁺ АТФ-азы. Пробы инкубировали в течение 15 мин при 37°С.

Для определения Са²⁺ АТФ-азы состав инкубационной среды был следующий: 5 ммоль АТФ, 5 ммоль трис HCl, 0,1 моль CaCl₂, 5 ммоль MgCl₂.

АТФ-азную активность определяли по количеству образовавшегося в пробе неорганического фосфата (ммоль на 1 мг белка за 1 ч инкубации).

Мембраны эндоплазматического ретикулума выделяли по методу И.И. Карузиной, А.А. Арчакова. Об активности N-деметилазы судили по количеству образовавшегося формальдегида. Реакция протекает при участии цитохрома Р-450 в присутствии НАДФ Н и кислорода. Образовавшийся формальдегид определяли методом Nash.

Осадок мембран цитоплазматической сети суспендировали для определения содержания цитохрома Р-450 в среде выделения трис HCl буфера (рН-7,4), а для определения n-гидроксилазной активности анилина - в 1,15% растворе KCl (рН-7,4).

Содержание цитохрома Р-450 измеряли на регистрирующем спектрофотометре фирмы "Perkin Elmer" (Англия) с расчетом по молярному коэффициенту экстинции.

Скорость анилин-n-гидроксилазы определяли по количеству образовавшегося пара-аминофенола.

Содержание электролитов