Композиции и способы лечения инфекций и опухолей

Композиции и способы лечения инфекций и опухолей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Испрашиваемый приоритет

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/877518, поданной 27 декабря 2006 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Родственные заявки

Раскрытый объект заявки также относится к предварительной заявке США № 60/688872, поданной 8 июня 2005 г., заявке № 11/449919, поданной 8 июня 2006 г., и заявке PCT № PCT/US2006/22423. Эти предшествующие заявки также включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Заявление о государственной поддержке

Это изобретение выполнено при поддержке правительства США грантами NIH AI39671 и CA84500. Правительство имеет определенные права на изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Эта заявка относится к использованию антагонистов, конкретно к использованию антагонистов PD-1, для лечения устойчивых инфекций и опухолей.

Известный уровень техники

Иммуносупрессия иммунного ответа хозяина играет роль в устойчивой инфекции и иммуносупрессии опухолей. Устойчивые инфекции представляют собой инфекции, при которых вирус не выводится, а остается в конкретных клетках инфицированных индивидуумов. Устойчивые инфекции часто включают стадии как латентной, так и продуктивной инфекции без быстрого уничтожения или даже с возникновением чрезмерного повреждения клеток хозяина. Существует три типа устойчивого взаимодействия вирус-хозяин: латентная, хроническая и медленная инфекции. Латентная инфекция характеризуется отсутствием выявляемого инфицирующего вируса между эпизодами рецидивов заболевания. Хроническая инфекция характеризуется продолжительным присутствием инфицирующего вируса после первичной инфекции и может включать хроническое или рецидивирующее заболевание. Медленная инфекция характеризуется продолжительным инкубационным периодом с последующим прогрессированием заболевания. В отличие от латентной и хронической инфекций медленная инфекция может не начинаться с острого периода размножения вируса. В процессе устойчивых инфекций вирусный геном может либо стабильно интегрироваться в ДНК клетки, либо поддерживаться эписомально. Устойчивая инфекция возникает при инфицировании такими вирусами, как вирусы Т-клеточного лейкоза, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус, вирусы герпеса, вирус ветряной оспы, вирус кори, паповавирусы, прионы, вирусы гепатита, аденовирусы, парвовирусы и вирусы папилломы.

Механизмы, с помощью которых поддерживаются устойчивые инфекции, могут включать модуляцию экспрессии генов вируса и клетки и модификацию иммунного ответа хозяина. Реактивация латентной инфекции может быть запущена различными стимулами, включая изменения в клеточной физиологии, суперинфекцию другим вирусом и физический стресс или травму. Иммуносупрессия у хозяина часто связана с реактивацией ряда устойчивых вирусных инфекций.

Во многих исследованиях продемонстрированы дефектные иммунные ответы у больных с диагностированным раком. Идентифицирован ряд опухолевых антигенов, которые связаны с конкретными типами рака. Многие опухолевые антигены определены как характерные для солидных опухолей: MAGE 1, 2 и 3, определенные иммунологически; MART-1/Melan-A, gp100, раковоэмбриональный антиген (CEA), HER-2, муцины (т.е. MUC-1), простатспецифический антиген (PSA) и кислая фосфатаза простаты (PAP). Кроме того, вирусные белки, такие как белки вирусов гепатита B (HBV), Эпштейна-Барр (EBV) и папилломы человека (HPV), как показано, имеют важное значение для развития гепатоклеточной карциномы, лимфомы и рака шейки матки соответственно. Однако из-за иммуносупрессии у больных с диагностированным раком, врожденная иммунная система этих больных часто не способна отвечать на опухолевые антигены.

Как пассивная, так и активная иммунотерапия, как предполагается, может использоваться при лечении опухолей. Пассивный иммунитет снабжает компонентом иммунного ответа, таким как антитела или цитотоксические Т-клетки, интересующего индивидуума. Активная иммунотерапия использует терапевтический агент, такой как цитокин, антитело или химическое соединение, для активации эндогенного иммунного ответа, когда иммунная система примирована для узнавания опухоли как чужеродной. Индукция как пассивного, так и активного иммунитета является успешной при лечении конкретных типов рака.

В целом существует потребность в обеспечении безопасными и эффективными терапевтическими методами лечения заболеваний, например аутоиммунных заболеваний, воспалительных нарушений, аллергий, отторжения трансплантата, рака, иммунодефицита и других нарушений, связанных с иммунной системой.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем описании раскрыто, что антиген-специфичные CD8+ Т-клетки становятся функционально толерантными («истощенными») в отношении инфекционного агента или опухолевого антигена после индукции полипептида-1 программируемой смерти (PD-1). Соответственно, с помощью снижения экспрессии или активности PD-1 иммунный ответ, специфичный в отношении инфекционного агента или опухолевых клеток, может быть увеличен. Индивидуумов с инфекциями, такими как устойчивые инфекции, можно лечить с использованием антагонистов PD-1. Индивидуума с опухолями также можно лечить с использованием антагонистов PD-1. Дополнительно индивидуумов можно лечить с помощью трансплантации терапевтически эффективного количества активированных Т-клеток, которые узнают интересующий антиген, в сочетании с терапевтически эффективным количеством антагониста PD-1.

В некоторых вариантах осуществления раскрыты способы индукции иммунного ответа на интересующий антиген у индивидуума, являющегося млекопитающим. Способ включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества активированных Т-клеток, где Т-клетки специфически распознают интересующий антиген, и терапевтически эффективного количества антагониста полипептида-1 программируемой смерти (PD)-1. Индивидуум может представлять собой любого интересующего индивидуума, включая индивидуума с вирусной инфекцией, такой как устойчивая вирусная инфекция, или индивидуума с опухолью.

В дополнительных вариантах осуществления раскрыты способы индукции иммунного ответа на интересующий антиген у реципиента млекопитающего. Способы включают введение в контакт популяции донорских клеток от того же вида млекопитающих, включающей Т-клетки, с антигенпрезентирующими клетками (APC), и предварительный отбор интересующего антигена, где предварительно отобранный антиген представляется с помощью APC Т-клеткам с получением популяции донорских активированных Т-клеток в присутствии антагониста PD-1. Терапевтически эффективное количество популяции донорских активированных Т-клеток трансплантируется реципиенту. Реципиенту также вводят терапевтически эффективное количество антагониста PD-1.

В некоторых вариантах осуществления раскрыты способы лечения индивидуума, инфицированного патогеном, такие как способы лечения устойчивой инфекции. Способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста полипептида-1 программируемой смерти (PD-1) и терапевтически эффективного количества антигенной молекулы из патогена. Примеры патогенов включают вирусные и грибковые патогены.

В дополнительных вариантах осуществления раскрыты способы лечения индивидуума с опухолью. Способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста полипептида-1 программируемой смерти (PD-1) и терапевтически эффективного количества опухолевого антигена или нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолевый антиген.

Представленные ниже и другие характеристики и преимущества станут более очевидными из последующего подробного описания некоторых вариантов осуществления, которые представлены со ссылкой на сопровождающие чертежи.

Краткое описание чертежей

Фиг.1A представляет собой гистограмму, показывающую уровни мРНК PD-1 в специфичных по D^bGP33-41 и/или D^bGP276-286 Т-клетках из незараженных трансгенных мышей, мышей, иммунизированных лимфоцитарным вирусом хориоменингита (LCMV) Армстронга (приблизительно через 30 дней после инфицирования), или мышей с недостаточностью CD-4, инфицированных LCMV-C1-13 (приблизительно через 30 дней после инфицирования), по результатам измерения с помощью метода генных матриц. Фиг.1B представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую поверхностную экспрессию PD-1 на содержащих CD8+тетрамер+ Т-клетках у мышей, иммунизированных LCMV Армстронга, и мышей с недостаточностью CD-4, инфицированных LCMV-C1-13, приблизительно через 60 дней после инфицирования. CD8+ Т-клетки с анергией экспрессируют высокие уровни полипептида PD-1 на клеточной поверхности приблизительно через 60 дней после хронического инфицирования вирусом LCMV-C1-13 (помечено «хроническое»), но специфичные в отношении вируса CD8+ Т-клетки не экспрессируют полипептид PD-1 после освобождения от острой инфекции LCMV Армстронга (помечено «иммунные»). Фиг.1C представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую присутствие PD-L1 на спленоцитах от хронически инфицированных и неинфицированных мышей. Это показывает, что экспрессия PD-L1 является наиболее высокой на спленоцитах, которые инфицированы вирусом.

Фиг.2A представляет собой серию диаграмм рассеяния, демонстрирующих, что когда мышей, инфицированных C1-13, лечат с 23 по 27 день после инфицирования, наблюдается приблизительно 3-кратное увеличение количества специфичных по DbNP396-404 и специфичных по DbGP33-41 CD8+ Т-клеток по сравнению с контрольными, не подвергаемыми лечению. Для того чтобы определить любые изменения в функции, измеряли продукцию IFN-γ и TNF-α в ответ на 8 различных эпитопов LCMV. Фиг.2B представляет собой диаграмму рассеяния, демонстрирующую, что когда все известные специфичные маркеры CD8+ Т-клеток измерены, наблюдается 2, 3-кратное увеличение суммарного количества специфичных по LCMV СВ8+ Т-клеток. Фиг.2C представляет собой серию схем проточной цитометрии, демонстрирующую продукцию IFN-γ и TNF-α в ответ на восемь различных эпитопов LCMV. Фиг.2D представляет собой диаграмму рассеяния, демонстрирующую, что у мышей, подвергнутых лечению, более высокое количество вирус-специфичных CD8+ Т-клеток обладает способностью продуцировать TNF-α. Фиг.2E представляет собой серию столбчатых гистограмм, демонстрирующих, что блокада PD-L1 также ведет к повышенному вирусному контролю в селезенке, печени, легком и сыворотке.

Фиг.3A представляет собой график, показывающий увеличение специфичных по DbGP33-41 и DbGP276-286 Т-клеток (отмечено «GP33» и «GP276») у мышей с недостаточностью CD-4, инфицированных C1-13, подвергавшихся лечению анти-PD-L1 (отмечено «αPD-L1») с 46 дня по 60 день после инфицирования по сравнению с контрольными (отмечено «untx»), что указывает на то, что мыши, подвергавшиеся лечению анти-PD-L1, содержали приблизительно в 7 раз больше специфичных по DbGP276-286 CD8+ Т-клеток селезенки и приблизительно в 4 раза больше специфичных по DbGP33-41 CD8+ Т-клеток селезенки, чем мыши, не подвергавшиеся лечению. Фиг.3B представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую повышенную встречаемость специфичных по DbGP33-41 и DbGP276-286 CD8+ Т-клеток в селезенке у мышей с недостаточностью CD-4, инфицированных C1-13, подвергавшихся лечению анти-PD-L1 (отмечено «αPD-L1 Tx») с 46 дня по 60 день после инфицирования по сравнению с контролем (отмечено «untx»). Фиг.3C представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую повышенную пролиферацию специфичных по DbGP276-286 CD8+ Т-клеток у мышей, подвергавшихся лечению анти-PD-L1, при измерении по включению BrdU и экспрессии Ki67. Фиг.3D представляет собой график, демонстрирующий, что мыши, обладающие высокими уровнями экспансии CD8+ Т-клеток, дают заметный ответ в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC), что показано путем сравнения специфичных по DbGP276-286 CD8+ Т-клеток в PBMC по сравнению со специфичными по DbGP276-286 CD8+ Т-клетками в селезенке.

Фиг.4A представляет собой серию графиков, показывающих увеличение продукции IFN-γ специфичными по DbGP276-286 и DbGP33-41 CD8+ Т-клетками у мышей, подвергавшихся лечению анти-PD-L1, по сравнению с контрольными. У мышей, подвергавшихся лечению анти-PD-L1, также наблюдалась более высокая встречаемость специфичных по DbNP396-404, KbNP205-212, DbNP166-175 и DbGP92-101 CD8+ Т-клеток. Фиг.4B представляет собой график, показывающий, что у мышей, подвергавшихся лечению анти-PD-L1, 50% специфичных по DbGP276-286 CD8+ Т-клеток продуцируют IFN-γ по сравнению с 20% специфичных по DbGP276-286 CD8+ Т-клеток у контрольных мышей. Фиг.4C представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую, что у подвергавшихся лечению анти-PD-L1 хронически инфицированных мышей продуцируются более высокие уровни TNF-α, чем у иммунизированных мышей, инфицированных вирусом LCMV Армстронга. Фиг.4D представляет собой график, демонстрирующий, что лечение анти-PD-L1 мышей, инфицированных LCMV-C1-13, восстанавливает литическую активность ex vivo вирус-специфичных Т-клеток по сравнению с не подвергавшимися лечению инфицированными мышами при измерении с использованием теста высвобождения ⁵¹Cr. Фиг.4E представляет собой серию графиков, демонстрирующих снижение титра вирусов в различных органах после лечения α-PD-L1 мышей, инфицированных LCMV-C1-13. Титры вирусов снижались приблизительно в 3 раза в селезенке, в 4 раза в печени, в 2 раза в легком и в 2 раза в сыворотке после лечения анти-PD-L1 в течение 2 недель по сравнению с не подвергавшимися лечению мышами.

Фиг.5A представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую поверхностную экспрессию PD-1 с использованием 10 тетрамеров ВИЧ, специфичных по доминантным эпитопам, направленным на таксон С хронической инфекции ВИЧ. Проценты отражают процент тетрамер⁺ клеток, которые являются PD-1⁺. Фиг.5B представляет собой серию графиков, демонстрирующих, что процент и MFI PD-1 существенно положительно регулируется на ВИЧ-специфичных CD8+ Т-клетках по сравнению с суммарной популяцией CD8+ Т-клеток (p<0,0001) при антиретровирусной терапии не подвергнутых лечению индивидуумов, и PD-1 увеличивается на суммарной популяции CD8+ Т-клеток у ВИЧ-инфицированных по отношению к ВИЧ-серонегативному контролю (p=0,0033 и p<0,0001 соответственно). В анализ включены 120 тетрамерных штаммов ВИЧ от 65 ВИЧ-инфицированных индивидуумов и 11 ВИЧ-серонегативных контролей. Фиг.5C представляет собой серию графиков, показывающих средний процент и MFI экспрессии PD-1 на тетрамер⁺ клетках по специфичности эпитопов. Фиг.5D представляет собой диаграмму, изображающую вариацию процента PD-1⁺ клеток на различных специфичных по эпитопам популяциях у индивидуумов с множественными определяемыми ответами. Горизонтальные отметки указывают медиану процента ВИЧ тетрамер⁺ PD-1⁺ клеток у каждого индивидуума.

Фиг.6А представляет собой серию графиков, показывающих, что не наблюдается корреляции между количеством ВИЧ-специфичных CD8+ Т-клеток при измерении с помощью окрашивания тетрамеров и вирусной нагрузкой плазмы, в то же время существует положительная корреляция между как процентом, так и MFI PD-1 на тетрамер⁺ клетках и вирусной нагрузкой плазмы (p=0,0013 и p<0,0001 соответственно). Фиг.6B представляет собой серию графиков, показывающих, что не наблюдается корреляции между количеством ВИЧ-тетрамер⁺ клеток и количеством CD4, в то же время существует обратная корреляция между процентом и MFI PD-1 на ВИЧ тетрамер⁺ клетках и количеством CD4 (p=0,0046 и p=0,015 соответственно). Фиг.6C представляет собой серию графиков, показывающих, что процент и MFI PD-1 на суммарной популяции CD8+ Т-клеток положительно коррелирует с вирусной нагрузкой плазмы (p=0,0021 и p<0,0001 соответственно). Фиг.6D представляет собой серию графиков, показывающих, что процент и MFI экспрессии PD-1 на суммарной популяции CD8+ Т-клеток отрицательно коррелирует с количеством CD4 (p=0,0049 и p=0,0006 соответственно).

Фиг.7A представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую типичное фенотипическое окрашивание B*4201 TL9-специфичных CD8+ Т-клеток от индивидуума SK222, у которого 98% B*4201 TL9-специфичных CD8+ Т-клеток являются PD-1⁺. Фиг.7B представляет собой график, иллюстрирующий суммарные фенотипические данные от индивидуумов, у которых >95% ВИЧ-специфичных CD8+ Т-клеток являются PD-1⁺. От семи до 19 образцов было проанализировано для каждого из указанных фенотипических маркеров. Горизонтальная отметка указывает медиану процента тетрамер⁺ PD-1⁺ клеток, которые были позитивными для указанного маркера.

Фиг.8A представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую типичные данные теста на пролиферацию от B*4201 позитивного индивидуума. После 6-дневной стимуляции пептидом процент B*4201 TL9-специфичных CD8+ Т-клеток повышался от 5,7% до 12,4% в присутствии анти-PD-L1 блокирующего антитела. Фиг.8B представляет собой линейный график, отражающий данные теста на суммарную пролиферацию, указывающий на значительное увеличение пролиферации ВИЧ-специфичных CD8+ Т-клеток в присутствии анти-PD-L1 блокирующего антитела (n=28, p=0,0006, парный t-тест). Фиг.8C представляет собой гистограмму, показывающую различные эффекты блокады PD-1/PD-L1 на пролиферацию ВИЧ-специфичных CD8+ Т-клеток, основанную на индивидуальных больных. Белые столбики указывают степень повышения тетрамер⁺ клеток в присутствии только пептида, черные столбики указывают степень повышения тетрамер⁺ клеток в присутствии пептида плюс анти-PD-L1 блокирующее антитело. Индивидуумы, у которых выполнялись тесты CFSE для более одного эпитопа, указаны символами в виде звездочки, квадрата или треугольника.

Фиг.9a-9d представляют собой диаграмму и серию графиков, демонстрирующих синергичный эффект терапевтической вакцины, объединенной с блокатором PD-L1, на частоту антиген-специфичных CD8-Т-клеток и титр вирусов у хронически инфицированных мышей. Фиг.9a представляет собой схематическую диаграмму экспериментального протокола. Инфицированных клоном-13 LCMV (CL-13) мышей вакцинировали вирусом коровьей оспы дикого типа (VV/WT) или вирусом коровьей оспы, экспрессирующим эпитоп LCMV GP33-41 (VV/GP33), через 4 недели после инфицирования. В то же время мышей лечили 5 раз каждые три дня анти-PD-L1 или без него. Фиг.9b представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую частоту GP33- и GP276-специфичных CD8-Т-клеток в PBMC через 1 неделю после лечения. Число представляет собой частоту тетрамер-позитивных клеток по отношению к CD8-Т-клеткам. Данные представляют результаты трех экспериментов. Фиг.9c-9d представляют собой графики частоты GP33- и GP276-специфичных CD8-Т-клеток (фиг.9c) и титры вирусов (фиг.9d) в крови после лечения. Изменения количества тетрамер-позитивных CD8-Т-клеток и титров вирусов прослеживали в крови с помощью окрашивания тетрамеров и анализа бляшкообразования соответственно в указанные временные точки. Количество тетрамер-позитивных CD8-Т-клеток и титры вирусов представлены у мышей индивидуально (верхние четыре панели) и в сводном виде (нижняя панель) после введения VV/WT или VV/GP33 (прямая линия) и лечения анти-PD-L1 (затененная область). Пунктирные линии представляют собой предел определения вирусов. Объединены результаты трех экспериментов.

Фиг.10a-10d представляют собой графики и цифровые изображения, показывающие повышение антиген-специфичных CD8-Т-клеток и повышенный контроль вирусов в различных тканях мышей, получавших терапевтическую вакцину в сочетании с блокадой PD-L1. Фиг.10a представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую частоту GP33-специфичных CD8-Т-клеток в различных тканях через 4 недели после лечения. Число представляет собой частоту тетрамер-позитивных клеток по отношению к CD8-Т-клеткам. Данные представляют результаты двух экспериментов. Фиг.10b представляет собой график зависимости числа GP33-специфичных CD8-Т-клеток в различных тканях через 4 недели после лечения. Фиг.10c представляет собой набор гистограмм, демонстрирующих титры вирусов в указанных тканях через 2 (закрашенные столбики) и через 4 (незакрашенные столбики) недели после лечения. Пунктирные линии представляют собой предел определения вирусов. N=6 мышей на группу. Объединены результаты двух экспериментов. Фиг.10d представляет собой цифровое изображение иммуноокрашивания селезенки антигенами aLCMV (красный) через 2 недели после лечения. Увеличение ×20.

Фиг.11a-11d представляют собой диаграммы и графики, показывающие усиленное восстановление функции истощенных CD8-Т-клеток с помощью терапевтической вакцины в сочетании с блокадой PD-L1. Фиг.11a представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую продукцию IFN-γ и дегрануляцию спленоцитов вакцинированных мышей через 4 недели после лечения. Спленоциты стимулировали указанными пептидами в присутствии αCD107a/b антител и затем совместно окрашивали на IFN-γ. Представленные диаграммы ограничены окном для CD8-Т-клеток и представляют два независимых эксперимента. Фиг.11b представляет собой график, показывающий процент IFN-γ⁺CD107⁺ клеток по отношению к CD8-Т-клеткам, конкретно для каждого из пептидов LCMV из фиг.11a, суммированных для многих мышей (n=6 для каждого ответа). Суммированы результаты двух экспериментов. Фиг.11c представляет собой серию диаграмм, демонстрирующих продукцию TNF-α CD8-Т-клетками, способными продуцировать IFN-γ у вакцинированных мышей. После стимуляции спленоцитов пептидом GP33-41 или GP276-286 происходила сортировка с окном для продуцирующих IFN-γ CD8-Т-клеток, и затем строилась диаграмма IFN-γ (ось x) против TNF-α (ось y). Верхние и нижние цифры на диаграммах указывают частоту TNF-α⁺ клеток среди IFN-γ⁺ клеток и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) IFN-γ⁺ клеток, соответственно. Данные представляют результаты двух независимых экспериментов. Фиг.11d представляет собой график, показывающий процент TNF-α⁺ клеток по отношению к TNF-γ⁺ клеткам для пептида GP33-41 или GP276-286 из фиг.11c, суммированный для многих мышей (n=6 для каждого ответа).

Фиг.12a-12b представляют собой серию диаграмм, показывающих, что действие терапевтической вакцины в сочетании с блокадой PD-L1 изменяет фенотип антиген-специфичных CD8-Т-клеток хронически инфицированных мышей. Фиг.12a представляет собой серию диаграмм, показывающих фенотип GP33 тетрамер-специфичных CD8-Т-клеток в PBMC в указанные временные точки после лечения. Гистограммы ограничивались окном для GP33⁺ CD8-Т-клеток. Частота популяции, экспрессирующей высокий уровень CD27 или CD127, указана в виде процента на диаграммах. Числа на гистограммах для Granzyme B представляют MFI экспрессии. Данные представляют результаты трех независимых экспериментов. Фиг.12b представляет собой серию диаграмм, показывающих фенотипические изменения GP33 тетрамер-специфичных CD8-Т-клеток в различных тканях через 4 недели после лечения. Гистограммы ограничивались окном для GP33⁺ CD8-Т-клеток. Частота популяции, экспрессирующей высокий уровень CD127 или PD-1, указана в виде процента на диаграммах. Числа на гистограммах для Granzyme B и Bcl-2 представляют MFI экспрессии. Данные представляют результаты двух независимых экспериментов.

Фиг.13a-13e представляют собой схематическую диаграмму, диаграммы и графики, демонстрирующие синергичный эффект терапевтической вакцины в сочетании с блокатором PD-L1 на восстановление функции «бесполезных» истощенных CD8 Т-клеток. Фиг.13a представляет собой схематическую диаграмму протокола. У мышей истощали CD4 Т-клетки и затем их инфицировали клоном-13 LCMV. Некоторых мышей вакцинировали вирусом коровьей оспы дикого типа (VV/WT) или вирусом коровьей оспы, экспрессирующим эпитоп LCMV GP33-41 (VV/GP33), через 7 недели после инфицирования. В то же время мышей лечили 5 раз каждые три дня αPD-L1 или его изотипом. Через две недели после первоначального лечения антителами мышей забивали для анализа. Фиг.13b представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией и гистограмму, демонстрирующие частоту GP33-специфичных CD8-Т-клеток в указанных тканях через 4 недели после лечения. Число представляет собой частоту GP33 тетрамер-позитивных клеток по отношению к CD8-Т-клеткам. Суммирована также частота GP33-специфичных клеток по отношению к CD8-Т-клеткам в различных тканях через 2 недели после лечения. Фиг.13c представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией и гистограмму, демонстрирующие результаты экспериментов, в которых спленоциты стимулировали пептидом GP33 в присутствии антител αCD107a/b и затем совместно окрашивали на IFN-γ. Представленные диаграммы ограничивались окном для CD8-Т-клеток. Процент IFN-γ⁺CD107⁺ клеток по отношению к CD8-Т-клеткам, специфичным для пептида GP33, суммирован для многих мышей. Фиг.13d представляет собой гистограмму процента IFN-γ⁺ клеток после стимуляции пептидом GP33 по отношению к клеткам, позитивным по Db-ограниченному GP33-41 тетрамеру, суммированному для многих мышей. Фиг.13e представляет собой гистограмму титров вирусов в указанных тканях через 2 недели после лечения. Все графики представляют результаты двух экспериментов, и все суммированные результаты двух экспериментов объединены (n=6 мышей на группу).

Фиг.14a-14b представляют собой диаграммы и графики, показывающие, что блокада сигнального пути PD1/PD-L1 повышает суммарное количество специфичных для антигена Т-клеток с последующим адоптивным переносом мышам - врожденным носителям. Целые спленоциты адаптивно переносили мышам - врожденным носителям с или без лечения анти-PD-L1. Фиг.14a представляет собой серию диаграмм типичной проточной цитометрии при конкретных временных точках с ограничением окна для CD8+ Т-клеток. Фиг.14b представляет собой графики, демонстрирующие кинетику экспансии Db GP33-специфичных CD8 Т-клеток в периферической крови из двух независимых экспериментов (n=4 животных на группу).

Фиг.15a-15e представляют собой диаграммы и графики, показывающие, что блокада пути PD-1/PDL1 после адоптивной Т-клеточной иммунотерапии повышает продукцию цитокинов антиген-специфичными CD8 Т-клетками. Спленоциты выделяли на 17 день после переноса и анализировали на экспрессию цитокинов при стимуляции антигенным пептидом. Фиг.15a представляет собой серию диаграмм типичной проточной цитометрии, показывающих экспрессию IFNγ, определяемую с помощью внутриклеточного окрашивания цитокина через 5 часов после стимуляции определенными эпитопами CD8 или в контролях без пептида. Фиг.15b и 15d представляют собой диаграммы, показывающие двойную экспрессию TNFα или 107ab и IFNγ (статистические значения в квадрантах представляют собой процент окна для CD8). Фиг.15c и 15e представляют собой гистограммы процента клеток, продуцирующих IFNγ и также продуцирующих TNFα или 107ab (n=3 животных на группу).

Фиг.16A-16B представляют собой график и диаграммы, показывающие повышенные уровни клеток, секретирующих антитела, у мышей, инфицированных клоном-13 LCMV. Суммарные уровни ASC измеряли у мышей, хронически инфицированных LCMV, после лечения αPD-L1 с помощью ELISPOT и окрашивания CD138. Фиг.16A представляет собой график суммарного количества ASC селезенки, объединенные результаты трех независимых экспериментов. Фиг.16B представляет собой серию диаграмм, демонстрирующих, что увеличение клеток, секретирующих антитела (ASC), в селезенке может быть измерено с помощью маркера CD138. Показана одна типичная диаграмма, ASC характеризуются как CD138+ и B220 низкие/промежуточные (окно ограничено лимфоцитами).

Фиг.17 представляет собой график, демонстрирующий, что лечение анти-PD-L1 мышей, хронически инфицированных LCMV, не ведет к повышенным уровням ASC костного мозга. Суммарное количество ASC подсчитано в селезенке и костном мозге мышей, хронически инфицированных LCMV, через 14 дней после лечения анти(α)PD-L1 с помощью ELISPOT. Линия представляет собой среднее геометрическое в группе.

Фиг.18 представляет собой график, демонстрирующий, что совместное введение αPD-L1 и αCTLA-4 ведет к синергичному увеличению ASC селезенки. Мышам, хронически инфицированным LCMV, вводили αPD-L1, αCTLA-4 или оба пептида в течение 14 дней и ASC в селезенке подсчитывали с помощью ELISPOT. Линия представляет собой среднее геометрическое в группе.

Фиг.19A-19B представляют собой диаграммы, показывающие повышенную пролиферацию и активность герминативного центра В-клеток и CD4 Т-клеток у мышей, подвергавшихся лечению αPD-L1. Фиг.19A представляет собой диаграмму анализа с помощью проточной цитометрии CD4 Т-клеток и В-клеток, показывающую повышенные уровни Ki-67 после лечения αPD-L1. Результаты ограничены окнами либо для CD4, либо для В-клеток, как показано вверху каждой колонки. Фиг.19B представляет собой серию диаграмм, показывающих увеличенную частоту В-клеток, экспрессирующих PNA, и высокие уровни FAS, что указывает на повышенную активность герминативного центра у мышей, подвергавшихся лечению αPD-L1. Диаграммы представляют собой одну типичную диаграмму, суммирующую результаты двух отдельных экспериментов.

Фиг.20A-20C представляют собой диаграммы и графики, показывающие экспрессию PD-1 на субпопуляциях CD8 и CD4 Т-клеток. Фиг.20A представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую поверхностную совместную экспрессию PD-1 и различных фенотипических маркеров среди CD8+/CD3+ лимфоцитов крови. Фиг.20B представляет собой серию графиков процента различных CD8+/CD3+ и (D) CD4+/CD3+ субпопуляций Т-клеток, которые экспрессируют PD-1. Горизонтальные линии указывают средний процент PD-1 на Т-клетках, которые позитивны (незакрашенные кружочки) и негативны (закрашенные треугольники) по указанному маркеру. Фиг.20C представляет собой серию графиков, представляющих фенотипические данные CD4+ Т-клеток, экспрессирующих PD-1, из одной субпопуляции.

Фиг.21A-B представляют собой диаграммы и графики, показывающие, что PD-1 экспрессируется на более высоком уровне на CD8 Т-клетках, специфичных для хронических инфекций. Фиг.21A представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую типичное окрашивание на PD-1 CD8 Т-клеток, специфичных для вируса Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловируса (CMV), вируса гриппа и вируса коровьей оспы. Указано среднее геометрическое интенсивности флуоресценции (GMFI) экспрессии PD-1 среди тетрамер⁺ клеток. Фиг.21B представляет собой график, показывающий суммарные данные о GMFI PD-1 на CD8 Т-клетках от здоровых добровольцев (n=35), специфичных для EBV, CMV, вируса гриппа и вируса коровьей оспы.

Фиг.22A-C представляют собой диаграммы и графики, показывающие, что блокада анти-PD-L1 повышает пролиферацию in vitro CD8 Т-клеток, специфичных для хронических инфекций. Фиг.22A представляет собой серию изображений эксперимента с проточной цитометрией, демонстрирующую лимфоциты, которые были помечены CFSE, затем культивировались в течение 6 дней в указанных условиях. В изображениях отражено типичное окрашивание от индивидуумов, позитивных в отношении EBV и CMV. Фиг.22B представляет собой гистограмму ответов, специфичных для антигенов EBV, CMV, вируса гриппа и вируса коровьей оспы, после блокады с помощью анти-PD-L1 блокирующего антитела. Столбики указывают степень увеличения тетрамер⁺ клеток в присутствии пептида плюс анти-PD-L1 блокирующее антитело по сравнению только с пептидом. Фиг.22C представляет собой линейный график, показывающий взаимоотношения между степенью увеличения тетрамер⁺ клеток после блокады анти-PD-L1 антителом и экспрессией PD-1 (перед культивированием).

Фиг.23B-23C представляют собой диаграммы и графики, показывающие, что CD8+ Т-клетки, специфичные для вируса гепатита С (HCV), экспрессируют PD-1 при хронической инфекции HCV человека. Фиг.23A представляет собой типичные диаграммы от пяти больных с хронической инфекцией HCV, демонстрирующие экспрессию PD-1 на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV. Цифры жирным шрифтом показывают частоту экспрессии PD-1 (ось x) на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV (ось y). На диаграммах цифры курсивом показывают частоту тетрамер-позитивных клеток среди суммарных CD8+ Т-клеток. На оси y 1073 и 1406 указывают специфичные эпитопы HCV тетрамера. Больные указаны как «Pt» с последующим номером больного. Клетки ограничивали окном для CD8+ лимфоцитов. Диаграммы построены в логарифмическом масштабе. Фиг.23B представляет собой сравнение экспрессии PD-1 на CD8+ Т-клетках от здоровых доноров (CD8 здоровые), больных, инфицированных HCV (CD8 HCV), и на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV (HCV tet+). Фиг.23C представляет собой график экспрессии PD-1 на CD8+ Т-клетках, специфичных для вируса гриппа (Flu tet+) от инфицированных HCV (HCV+) и здоровых доноров (здоровые), в сравнении с экспрессией PD-1 на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV (HCV tet+). Для сравнения различий экспрессии PD-1 у одного и того же больного на суммарных CD8+ Т-клетках по отношению к CD8+ Т-клеткам, специфичным для HCV, использовали непарный t-тест.

Фиг.24A-24D представляют собой диаграммы и графики, показывающие, что частота CD8+ Т-клеток, экспрессирующих PD-1, в печени выше, чем в периферической крови. Фиг.24A представляет собой типичные диаграммы от пяти больных с хронической инфекцией HCV, демонстрирующие экспрессию PD-1 на суммарных CD8+ Т-клетках из периферической крови против них в печени. Цифры жирным шрифтом на диаграммах показывают частоту клеток с экспрессией PD-1 среди суммарных CD8+ Т-клеток в окне, ограниченном для лимфоцитов. Диаграммы построены в логарифмическом масштабе. Фиг.24B представляет собой сравнение экспрессии PD-1 на CD8+ Т-клетках из периферической крови против них в печени у больных, хронически инфицированных HCV. Для сравнения различия экспрессии PD-1 у одних и тех же больных использовали парный t-тест. Фиг.24C представляет собой сравнение экспрессии PD-1 на CD8+ эффекторных клетках памяти (T_EM) из периферической крови против них в печени. Субпопуляции памяти были идентифицированы по дифференциальной экспрессии CD62L и CD45RA. Цифры жирным шрифтом наверху диаграмм указывают частоту клеток в каждом квадранте. Клетки ограничивали окном для CD8+ лимфоцитов. Субпопуляция T_EM была ограничена окном (боксами), и экспрессия PD-1 представлена на гистограммах ниже. Пунктирная линия отражает экспрессию PD-1 на наивных CD8+ Т-клетках (используемых в качестве негативной популяции). Числа на гистограммах указывают частоту клеток, экспрессирующих PD-1. Сравнение частоты экспрессии PD-1 на CD8+ T_EM клетках десяти больных с хронической инфекцией HCV суммировано ниже гистограмм. Для сравнения различия экспрессии PD-1 на CD8+ T_EM из периферической крови и печени одного и того же больного использовали парный t-тест. Фиг.24D представляет собой типичные диаграммы от двух больных с хронической инфекцией HCV, показывающие различие в экспрессии CD127 на суммарных CD8+ Т-клетках из периферической крови и печени. Цифры жирным шрифтом указывают на частоту экспрессии CD127 на суммарных CD8+ Т-клетках. Клетки ограничены окном для CD8+ лимфоцитов. Диаграммы представлены в логарифмическом масштабе. Суммарное сравнение экспрессии CD127 на суммарных CD8+ Т-клетках в периферической крови по отношению к ним в печени показано ниже диаграмм FACS. Для статистического анализа использовали парный t-тест.

Фиг.25 представляет собой серию графиков и диаграмм, демонстрирующих, что CD8+ Т-клетки, специфичные для HCV, в печени экспрессируют истощенный фенотип. Типичные диаграммы экспрессии PD-1 и CD127 на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV, из периферической крови и печени двух больных хронической инфекцией HCV. Первый ряд диаграмм иллюстрирует HCV тетрамер-позитивную популяцию (боксы). Цифры над боксами указывают частоту тетрамер-позитивных клеток среди CD3+ лимфоцитов. Специфичность эпитопа тетрамера HCV указана на оси y (1073). Второй и третий ряды диаграмм демонстрируют экспрессию PD-1 и CD127 на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV, из периферической крови и печени двух больных хронической инфекцией HCV. Цифры жирным шрифтом указывают частоту экспрессии PD-1 или CD127 на CD8+ Т-клетках, специфичных для HCV. Диаграммы представлены в логарифмическом масштабе и ограничены окном для CD3+ CD8+ лимфоцитов. Ниже FACS диаграмм показаны суммарные данные по сравнению экспрессии PD-1 (слева) и экспрессии CD127 (справа) на суммарных CD8+ Т-клетках по сравнению с CD8+ Т-клетками, специфичными для HCV, из периферической крови (HCV tet+ PBMC) и по сравнению с CD8+ Т-клетками, специфичными для HCV, из печени. Для сравнения экспрессии у одного и того же больного использовали парные t-тесты.

Фиг.26 представляет собой серию диаграмм, демонстрирующих, что блокада пути PD-1/PD-L1 повышает экспансию антиген-стимулир