Способ получения биосовместимых галлий(iii)-содержащих высокодисперсных частиц для изготовления диагностических препаратов для позитронно-эмиссионной томографии

Способ получения биосовместимых галлий(iii)-содержащих высокодисперсных частиц для изготовления диагностических препаратов для позитронно-эмиссионной томографии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области ядерной медицины, а точнее к способам изготовления радиофармацевтических диагностических средств для позитронно-эмиссионной томографии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

На сегодняшний день успех лечения многих болезней зависит от того, насколько рано и успешно была проведена диагностика заболевания. Современная медицина располагает большим количеством диагностических методов. Это и методы визуализации (рентгенография, магнитно-резонансная томография (МРТ), позитрон-эмиссионная томография, компьютерная томография и др.), и биохимические анализы, и биопсия (для диагностики новообразований).

Современные методы позитронно-эмиссионной томографии (двухфотонной эмиссионной томографии) основаны на детектировании пары гамма-квантов, образующихся в результате аннигиляции позитронов после распада нестабильных радиоизотопов в тканях и клетках, при этом локацию источников излучения производят с учетом того обстоятельства, что в результате аннигилляции образуется два кванта, а направления, в которых они распространяются, строго противоположны друг другу.

Одно из главных преимуществ позитронно-эмиссионной томографии состоит в том, что в отличие от иных способов диагностики, включение радионуклидов в состав биологически-активных соединений позволяет исследовать их распределение и метаболизм в организме человека в динамике. Во многих случаях это обстоятельство делает ПЭТ незаменимым способом исследования, несмотря на сравнительно низкую пространственную разрешающую способность современных ПЭТ-сканеров.

В качестве радиоизотопов в позитронно-эмиссионной томографии применяются радионуклиды, подверженные позитронному бета-распаду. Наиболее распространенными являются углерод-11 (T¹/₂ 20,4 минут), азот-13 (T¹/₂ 9,96 минут), кислород-15 (T₁/₂ 2,03 минут) фтор-18 (T¹/₂ 109,8 минут) иод.

С точки зрения дозовой нагрузки (чем меньше T¹/₂, тем большую дозу радиофармацевтического препарата можно ввести в организм пациента единовременно при сохранении той же общей дозы), удобства транспортировки и получения радиофармацевтических препаратов (T¹/₂ не должен быть слишком коротким, чтобы за период между моментом изготовления и моментом введения в организм перед исследованием в препарате сохранялось необходимое количество радиоизотопа), и разрешающей способности ПЭТ-сканеров (увеличивается с уменьшением энергии излучения) наиболее оптимальными являются радионуклиды с периодом полураспада больше 60 минут и низкой энергией излучения.

По совокупности ядерно-физических и химических свойств галлий-68 является одним из наиболее удобных радионуклидов для изготовления радиофармацевтических препаратов для позитронно-эмиссионной томографии.

Это обусловлено доступностью и удобством применения германий-68/галлий-68 генераторов галлия-68, большим периодом полураспада материнского германия-68 (T¹/₂ примерно 250 дней), обеспечивающего длительный срок эксплуатации генератора в лабораторных условиях (см. статьи Astia, M. et al. Validation of 68Ge/68Ga generator processing by chemical purification for routine clinical application of 68Ga-DOTATOC. // Nuclear Medicine and Biology. - 2008. - Vol.35. - P.721-724; Zhemosekov K.P. et al. Processing of generator-produced 68Ga for medical application. J. Nucl. Med. - 2007. - Vol.10. - P.1741-1748; McAlister D.R., Horwitz E.P. Automated two column generator systems for medical radionuclides. Applied Radiation and Isotopes 67 (2009) 1985-1991). При этом галлий-68, напротив, имеет весьма малый период полураспада (T¹/₂=68,1 мин), что позволяет использовать радиофармацевтические препараты необходимой активности, не создавая при этом значительной дозовой нагрузки на пациента. Кроме того, катион галлия-68 (III) формирует широкий спектр устойчивых комплексных соединений со многими лигандами, содержащими кислород, азот и серу как атомы-доноры, что делает его пригодным для синтеза большого количества хелатных комплексов и макромолекул различного функционального назначения.

Известные радиофармацевтические препараты, преимущественно, содержат галлий-68 в виде комплексов с бидентатными лигандами, связанными с различными биоспецифическми молекулами. Наиболее значимыми полидентатными представителями используемых бифункциональных хелатирующих агентов являются ациклические лиганды N,N'-бис(2,2-диметил-2-меркаптоэтил)этилендиамин-N,N'-диуксусная кислота (6SS), трис-аминометилэтан (TAME), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и дифероксамин (DFO), а также макроциклические 1,4,7-триазациклононан-N,N',N''-триуксусная кислота (NOTA), 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-1,4,8,11-тетрауксусная кислота (TETA) и 1,4,7,10-тетраазациклодекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусная кислота (DOTA) и их производные (статьи Maecke H.R. et al. 68Ga-Labeled Peptides in Tumor Imaging, J. Nucl. Med. 46:172S-178S (2005); Breeman W.A.P. et al Radiolabelling DOTA-peptides with 68Ga. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2005. - V.33. - P.478-85 и патентные документы WO 2005/057589, US 20080277350, RU 2343965 C2, US 7586102 B2, WO 2004/089425 A1 и US 7728310 B2).

Несмотря на известность общих подходов к созданию биоконъюгатов галлия-68 и подходов к изготовлению биосовместимых наночастиц, до настоящего времени какие-либо попытки создания радиофармацевтических препаратов в форме наночастиц, содержащих галлий-68, не предпринимались, либо не увенчались успехом. Между тем, создание подобных препаратов могло бы способствовать повышению точности диагностики онкологических заболеваний тех органов, для которых характерно наиболее существенное накопление наночастиц, а именно печени, почек и мозга (см. Semete B. et al. In vivo evaluation of the biodistribution and safety of PLGA nanoparticles as drug delivery systems. Nanomedicine: Nonotechnology, Biology, and Medicine, - 6 (2010) - P.662-671). Кроме того, создание частиц этого типа могло бы стать важным шагом на пути к созданию нацеленных радиофармацевтических препаратов, на основе наночастиц, содержащих наряду с изотопной меткой, различные биоспецифические молекулы, такие как антитела и лиганды рецепторов, характерных для нормальных и малигнизированных клеток.

Одна из проблем, которая препятствует созданию подобных наночастиц, состоит в том, что элюаты коммерчески доступных генераторов германий-68/галлий-68, наряду с галлием-68 содержат большое количество (на 7÷10 порядков больше) конкурирующих катионов, препятствующих образованию комплексов галлия-68 (III). Наличие в рабочем растворе примесей Cd (II); Co (II); Cu (II); In (III); Fe (II); Fe (III); Lu (III); Ni (II); Zn (II) уже в количестве 1 µM может быть серьезной проблемой (Breeman W.A.P. et al Radiolabelling DOTA-peptides with 68Ga. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2005. - V.33. - P.478-85). К тому же элюаты, получаемые с генератора, имеют низкий pH (обычно получают 5,0 мл раствора с pH 1,0), а после разбавления буфером до pH 5,0 получают значительный объем раствора с весьма низкой концентрацией галлия-68. Таким образом, применение наночастиц для изготовления радиофармацевтических препаратов галлия-68 без дополнительной очистки и концентрирования элюата возможно только в том случае, если их сорбционная емкость будет достаточной для связывания не только галлия-68, но и всех мешающих катионов, а их специфичность к галлию-68 будет достаточной для практически полного связывания галлия-68 из растворов с концентрацией менее 1·10^-6 M.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терминам и выражениям, используемым в настоящем тексте, придают следующее значение, если из контекста не следует иное значение.

DIPEA - диизопропилэтиламин

EDC - N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбонат

lgβ₁ - константа устойчивости комплексного соединения в растворе

PDI - индекс полидисперсности

PLGA - сополимер молочной и гликолевой кислоты

PSD - гранулометрическая характеристика

Resomer 202S - биоразлагаемый сополимер D- и L-молочной кислоты с молекулярной массой 10-18 кДа, характеристической вязкостью 0,16-0,24 дл/г, температурой стеклования 38-42°C, свободные карбоксильные группы этерифицированы.

Resomer 502H - биоразлагаемый сополимер молочной и гликолевой кислоты (50:50) с молекулярной массой 7-17 кДа, характеристической вязкостью 0,16-0,24 дл/г, температурой стеклования 42-46°C, имеются свободные карбоксильные группы

Resomer 752H - биоразлагаемый сополимер молочной и гликолевой кислоты (75:25) с молекулярной массой 7-17 кДа, характеристической вязкостью 0,14-0,22 дл/г, температурой стеклования 42-46°C, имеются свободные карбоксильные группы

ZAVeD - средний размер частиц

ZP - дзета-потенциал

Биоразлагаемый полимер - полимер, способный при его введении в организм человека под действием ферментов полностью расщепляется до безвредных некумулирующихся метаболитов, которые могут быть выведены выделительными системами организма.

Биосовместимость - свойство материала, проявляющееся в том, что при введении в организм материал не вызывает реакций непереносимости или аллергических реакций.

ДМСО - диметилсульфоксид

Кислотный индекс - количество миллиэквивалентов KOH, необходимых на грамм полимера для нейтрализации свободной кислотности

Полилактид - биосовместимый биоразлагаемый полимер, выбранный из группы, состоящей из сополимера молочной и гликолевой кислоты и сополимера D и L-молочной кислоты.

Наночастицы (сокращенно - НЧ) - мелкодисперсные частицы, образующие коллоидные системы, в частности суспензии, эмульсии, аэрозоли, гели и золи.

Остальные термины и выражения используют в обычном смысле, известном специалистам в данной области техники.

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа получения высокодисперсных биосовместимых частиц для изготовления диагностических радиофармацевтических средств на основе радионуклида галлия-68 для позитронно-эмиссионной томографии.

Технический результат состоит в создании нетоксичного (при эффективных концентрациях) радиофармацевтического средства, обеспечивающего эффективное связывание катионов галлия-68 (III) из сильно разбавленных загрязненных катионами металлов элюатов и высокую концентрацию галлия-68 (III) в связанной форме.

Свободный и связанный с частицами галлий-68 по-разному распределяется в организме, что позволяет легко отличать высококонтрастные скопления связанного галлия-68 с четкими контурами от размытых зон, обогащенных свободным галлием-68. За счет повышения содержания галлия-68 (III) в готовой к введению лекарственной форме по сравнению с растворами галлия-68 (III) стало возможным вводить его в кровоток в болюсном режиме - короткими инъекциями в небольшом объеме жидкости.

Кроме того, можно ожидать, что вследствие незначительного проникновения наночастиц в интерстициальную жидкость, лимфу и лимфоузлы, лимфотоксичность галлия-68 в связанной с частицами форме будет ниже, чем у несвязанных аналогов.

В основе настоящего изобретения положен тот факт, что, как неожиданно было обнаружено, емкость полилактидных частиц с нековалентно связанными комплексами галлия (III) намного превышает емкость частиц с лигандами, ковалентно связанными с поверхностью полилактидных частиц.

Вышеуказанная задача решена благодаря тому, что в способе получения биосовместимых высокодисперсных частиц для in situ изготовления диагностических средств для позитронно-эмиссионной томографии посредством объединения указанных частиц с раствором, содержащим катионы галлия-68 (III)

(а) используют, по меньшей мере, бидентатные ароматические лиганды, имеющие атомы-доноры неподеленной пары электорнов для образования по меньшей мере двух координационных связей с катионом галлия (III), а именно атом(ы) кислорода, непосредственно связанный(-ые) с ароматическим кольцом, и/или атом(ы) азота в ароматическом кольце, при этом константа устойчивости lgβ1 комплексов упомянутых лигандов с катионом галлия (III) в воде при нормальных условиях составляет по меньшей мере 5,0;

(б) используют раствор, содержащий сополимеры молочной кислоты, выбранные из группы, состоящей из сополимеров D- и L-молочной кислоты и сополимеров молочной и гликолевой кислоты, в малополярном растворителе;

(в) используют водный раствор стабилизатора;

(г) (i) объединяют раствор лиганда (а) в малополярном растворителе с раствором (б) и по меньшей мере тремя объемами раствора (в) и интенсивно перемешивают, либо

(ii) объединяют раствор лиганда (а) в полярном растворителе с раствором (б), интенсивно перемешивают смесь с получением высокогомогенной смеси, добавляют по меньшей мере три объема раствора (в) и интенсивно перемешивают с получением высокогомогенной смеси;

(д) упаривают высокогомогенную смесь, полученную на стадии (г) с получением суспензии;

(е) фильтруют суспензию, полученную на стадии (д) посредством фильтра с размером пор менее 30 мкм, с получением фильтрата, содержащего вышеупомянутые частицы.

В предпочтительной форме осуществления способа к фильтрату, полученному на стадии (е), добавляют лиопротектор, замораживают и лиофилизуют. В качестве лиопротектора могут добавлять (но не обязательно) глюкозу, трегалозу, лактозу, сахарозу и/или маннит, предпочтительно - 1%-ный маннит.

Термин «лиопротектор» относится к соединению, которое, будучи включено в лиофилизуемую композицию, будет защищать химические соединения от отрицательных воздействий замораживания и вакуумирования, таких как воздействия, обычно сопровождающие лиофилизацию, например повреждение, адсорбция и потери от вакуума, применяемого в лиофилизации.

Настоящее изобретение не ограничено применением конкретного лиопротектора; примеры подходящих лиопротекторов включают, без ограничений, углеводороды, такие как сахариды, моно-, ди- или полисахариды, например глюкозу, галактозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, лактозу, амилозу, амилопектин, циклодекстрины, декстран, инулин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал (HES), сахарные спирты, например маннитол, сорбит и полигликоли, такие как полиэтиленгликоли. Список веществ с лиопротективным действием приведен в публикации Acta Pharm, Technol. 34 (3), pp.129-139 (1988), содержание которой введено здесь ссылкой. Указанные лиопротективные агенты могут применяться по отдельности или как смеси одного или более соединений.

Также настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным количеством используемого лиопротектора. Однако оптимальная весовая концентрация лиопротективных агентов в эмульсии до лиофилизации составляет от примерно 1 до примерно 25%, предпочтительно от примерно 2 до примерно 20% и еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 10%.

Заморозку на стадии (ж) могут (но не обязательно) осуществлять до температуры от -196 до -60°C, предпочтительно - до температуры -75°C.

Не менее 90% частиц в лиофилизате, полученном на этапе (ж), могут иметь (но не обязательно) размер 100÷800 нанометров, причем при диспергировании в фармацевтически приемлемом носителе или растворителе частицы образуют пригодную для внутривенного введения устойчивую суспензию, в которой не менее 90% наночастиц имеют размер 200÷800 нанометров.

Лиганды могут быть (но не обязательно) выбраны из группы, состоящей из антрахинонов, флавонов, оксихинолинов, трифенилметанов, имеющих заместители, содержащие атом кислорода, или содержащие атом азота в ароматическом кольце.

Предпочтительно лиганды выбраны группы, состоящей из ализарина, хинализарина, ализаринового красного, кверцетина, 8-оксихинолина и алюминона.

Упомянутый сополимер может иметь (но не обязательно) характеристическую вязкость 0,10÷0,30 дл/г.

Упомянутый сополимер может являться (но не обязательно) сополимером D, L-молочной и гликолевой кислоты с соотношением молочная кислота : гликолевая кислота от 5:1 до 1:5.

Предпочтительно, когда упомянутый сополимер является гидрофильным и имеет кислотный индекс выше 1 мэкв KOH, более предпочтительно выше 1,2, еще более предпочтительно 1,5 мэкв КОН на грамм сополимера.

Малополярный растворитель, в котором растворены сополимеры молочной кислоты, может быть (но не обязательно) выбран из группы, состоящей из этилацетата, хлороформа, дихлорметана или их смеси.

Используемый здесь термин «малополярный растворитель» относится к не смешивающимся с водой растворителям, то есть к таким растворителям, что при его смешивании с водой образуются две отдельные фазы. Не смешиваемые с водой растворители обычно известны в уровне техники как аполярные или неполярные растворители, в отличие от полярных растворителей (таких, как вода). Не смешиваемые с водой растворители, как правило, почти нерастворимы в воде. Для целей настоящего изобретения органическими растворителями, подходящими для эмульгирования с водным растворителем, являются растворители с растворимостью в воде менее примерно 10 г/л. Предпочтительно растворимость указанного растворителя в воде составляет примерно 1,0 г/л или меньше, более предпочтительно примерно 0,2 г/л или меньше и, намного более предпочтительно, примерно 0,01 г/л или меньше. Особенно предпочтительными растворителями являются растворители с растворимостью в воде 0,001 г/л или меньше. В частности, нерастворимые органические растворители (например, перфторуглероды) могут иметь растворимость вплоть до примерно 1,0·10-6 г/л (например, перфтороктан 1,66·10-6 г/л).

Органический растворитель предпочтительно является лиофилизуемым, т.е. указанный растворитель имеет достаточно высокое давление пара при температурах лиофилизации, например, между -30°C и 0°C, чтобы позволить эффективное и полное испарение/сублимацию в пределах приемлемых времен, например 24-48 часов. Предпочтительно давление пара органического растворителя выше примерно 0,2 кПа при 25°C.

Органический растворитель может быть выбран из широкого круга растворителей любой химической природы, то есть не смешиваемых с водой и лиофилизуемых, как указано выше, и которые предпочтительно являются жидкими при комнатной температуре (25°C). Если используется растворитель с точкой кипения ниже, чем комнатная температура, емкость, содержащая эмульгирующую смесь, может преимущественно быть охлаждена ниже точки кипения указанного растворителя, например, до 5°C или 0°C.

Подходящие органические растворители включают, без ограничений, алканы, такие как разветвленные или предпочтительно прямые (C5-C10)-алканы, например пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан; алкены, такие как (C5-C10)-алкены, например 1-пентен, 2-пентен, 1-октен; циклоалканы, такие как (C5-C8)-циклоалканы, возможно замещенные одной или двумя метальными группами, например циклопентан, циклогексан, циклооктан, 1-метилциклогексан; ароматические углеводороды, такие как бензол и производные бензола, замещенные одной или двумя метальными или этильными группами, например бензол, толуол, этилбензол, 1,2-диметилбензол, 1,3-диметилбензол; простые алкиловые эфиры и кетоны, такие как дибутиловый эфир и диизопропилкетон; галогенированные углеводороды или простые эфиры, такие как хлороформ, четыреххлористый углерод, 2-хлор-1-(дифторметокси)-1,1,2-трифторэтан (энфлюран), 2-хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифторэтан (изофлюран), тетрахлор-1,1-дифторэтан и, в частности, перфторированные углеводороды или простые эфиры, такие как перфторпентан, перфторгексан, перфторгептан, перфторметилциклогексан, перфтороктан, перфторнонан, перфторбензол и перфтордекалин, метилперфторбутиловый эфир, металперфторизобутиловый эфир, этилперфторбутиловый эфир, этилперфторизобутиловый эфир и их смеси.

Смешивание на стадии (г)(i) могут осуществлять (но не обязательно) 3÷10 минут на емкостном гомогенизаторе при 19000÷30000 оборотах ротора в минуту, а затем 3÷10 минут на гомогенизаторе высокого давления при давлении 20000÷30000 psi.

Смешивание на стадии (г)(ii) предпочтительно осуществляют 1,5÷10 минут на емкостном гомогенизаторе при 19000÷30000 оборотах ротора в минуту.

Высокогомогенную смесь на стадии (д) могут упаривать (но не обязательно) на роторном испарителе.

Фильтрование на стадии (е) могут осуществлять (но не обязательно) на стеклянном фильтре с размером пор, по существу, 10 микрометров.

В качестве стабилизатора на стадии (в) могут использовать (но не обязательно) водный раствор поливинилового спирта, предпочтительно, 1,0% в/о водный раствор поливинилового спирта с молекулярной массой 9,0÷80 кДа.

В одном из вариантов осуществления способа частицы, полученные на этапе (е), промывают и после этого помещают в раствор, содержащий катионы галлия-68 (III).

В еще одном из вариантов осуществления способа pH раствора, содержащего катионы галлия-68 (III), доводят до pH 3,0÷8,0, предпочтительно до pH приблизительно 5,0.

Частицы могут содержать (но не обязательно) стехиометрический избыток лиганда и катионов металлов в растворе, содержащем катионы галлия-68 (III).

Упомянутые частицы могут дополнительно конъюгировать (но не обязательно) с авидином и/или стрептавидином для придания способности избирательно связываться с биоспецифическими биотинилированными лигандами, предпочтительно - с моноклональными антителами.

Упомянутые частицы могкт дополнительно конъюгировать (но не обязательно) с биоспецифическими лигандами.

Упомянутые биоспецифические лиганды могут быть (но не обязательно) выбраны из группы, состоящей из моноклональных антител, активных фрагментов пептидных гормонов, активных фрагментов интегринсвязывающих белков и RGD-пептида.

Упомянутые биоспецифические лиганды могут быть выбраны (но не обязательно) из группы, состоящей из моноклональных антител, специфичных к факторам свертывания крови, предпочтительно к тканевому тромбопластину.

Упомянутые биоспецифические лиганды могут быть выбраны (но не обязательно) из группы, состоящей из моноклональных антител, специфичных к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления радиофармацевтического препарата для позитронно-эмиссионной томографии, в котором частицы, полученные вышеописанным способом, помещают в раствор, содержащий галлий-68 (III) с pH 3,0÷8,0.

Упомянутые частицы перед помещением в упомянутый раствор могут (но не обязательно) промывать.

В другом своем аспекте изобретение относится к применению частиц, полученных вышеописанным способом, в котором упомянутые частицы объединяют с раствором, содержащим катионы галлия-68 (III), и вводят в организм человека перед проведением позитронно-эмиссионной томографии.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутые частицы перед помещением в упомянутый раствор могут (но не обязательно) промывать.

В еще одном аспекте изобретение относится к биосовместимым высокодисперсным частицам для изготовления радиофармацевтического препарата для позитронно-эмиссионной томографии, характеризующимся тем, что они получены в соответствии с вышеописанным способом.

В еще одном аспекте изобретение относится к применению частиц, полученных в соответствии с вышеописанным способом, для изготовления радиофармацевтического препарата для позитронно-эмиссионной томографии.

Позитронно-эмиссионную томографию могут (но не обязательно) совмещать с компьютерной томографией.

Позитронно-эмиссионную томографию также могут (но не обязательно) совмещать с магнитно-резонансной (ядерно-магнитной) томографией.

В качестве контраста в упомянутой магнитно-резонансной томографии могут (но не обязательно) использовать упомянутые частицы с предварительно сорбированными катионами гадолиния (III).

В еще одном своем аспекте изобретение относится к диагностической радиофармацевтической композиции для позитронно-эмиссионной томографии, характеризующейся тем, что она содержит эффективное количество галлия-68 (III), связанного с частицами, изготовленными вышеописанным способом.

Эффективное количество в расчете на массу тела 50÷90 кг соответствует активности 2÷5 мКи.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления после объединения раствор инкубируют, центрифугируют, удаляют супернатант и ресуспендируют в фармацевтически приемлемом растворе для парентерального введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показан ЯМР-спектр модифицированного ализарина по примеру 1.

На фиг.2 показан спектр Resomer 752H, ковалентно-модифицированного ализарином, по примеру 1.

На фиг.3 показаны спектры поглощения ксиленолового оранжевого и его комплекса с галлием (III) в водно-органической среде (вода-ДМСО, pH<1,0 (0,1 н H₂SO₄)).

На фиг.4 показан градуировочный график для определения свободного галлия (вода-ДМСО, pH<1,0 (0,1 н H₂SO₄)); длина волны 550 нм.

На фиг.5 показаны градуировочный график для определения общего содержания галлия (вода-ДМСО, pH<1,0 (0,1 н H₂SO₄)); длина волны 550 нм.

На фиг.6 показаны микрофотографии образцов по примеру 2.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Содержание галлия, входящего в виде комплексов в состав полилактидных частиц, а также степень включения галлия (III) в полилактидные частицы, определяют посредством спектрофотометрии растворов с использованием индикатора - ксиленолового оранжевого, образующего окрашенные комплексы с галлием (III) при pH 1,0 и менее. Данный способ основан на том, что в кислой среде комплексы галлия (III) с анализируемыми лигандами разрушаются и не мешают определению содержания галлия в виде его комплекса с индикатором. Поглощение измеряют при длине волны 550 нм (см. фиг.3).

Концентрацию свободного (не связанного с полилактидными частицами) галлия (III) определяют по предварительно построенному градуировочному графику (измеряют поглощение при длине волны 550 нм) (фиг.1 и фиг.2).

Для выявления возможного мешающего влияния собственного поглощения органических реагентов определяют концентрацию в отсутствии и в присутствии органических реагентов. Концентрация органических реагентов в анализируемом растворе соответствовала максимальному теоретически возможному содержанию органических реагентов в препарате.

Результаты валидации способа определения галлия (III) на примере полилактидных частиц с кверцетином, хинализарином и ализарином представлены в таблице 1+.

Таблица 1
Без добавления органических реагентов
Введено, мкг/мл	Найдено, мкг/мл	Sr, %
3,46	3,49	1,3
1,66	1,61	2
С добавлением органических реагентов (0,1 мл раствора*)
1,66 + кверцитин	1,63	3
1,66 + хинализарин	1,81	2,2
1,66 + ализарин	1,58	3
Примечание: концентрация кверцитина, хинализарина и ализарина составляла 1,86·10-5 моль/мл, 1,25·10-5 моль/мл и 0,94·10-5 моль/мл, соответственно.

Как следует из таблицы 1, присутствие хинализарина в растворе приводит к завышению результатов определения концентрации галлия. Поэтому для определения галлия в растворах, содержащих данный реагент, используют метод добавок.

Для определения концентрации свободного галлия (III) в суспензии полилактидных частиц лиофилизат ресуспендируют в объеме воды, составляющем 0,5 от исходного, количественно переносят в центрифужную пробирку, отделяют полилактидные частицы центрифугированием (Avanti J-301, 180C, 20000 об/мин, 30 мин) и отбирают супернатант. Далее к смеси 0,1% водного раствора индикатора (0,2 мл), 1 н. H₂SO₄ (0,1 мл) и 0,5 мл диметилсульфоксида добавляют 0,2 мл супернатанта, перемешивают, инкубируют 30 мин при комнатной температуре и определяют концентрацию свободного галлия (III) по предварительно построенному градуировочному графику (фиг.4).

Для определения общего содержания галлия (III) в полилактидных частицах их растворяют в диметилсульфоксиде и по предварительно построенному градуировочному графику для растворов галлия (III) в смеси вода:ДМСО = 1:1 (об.:об.) (фиг.5). При этом учитывают, что концентрация раствора полилактида в 50% диметилсульфоксиде, не должна превышать 1 мг/мл.

Для определения общего содержания галлия (III) в лиофилизате полилактидных частиц лиофилизат, полученный из 1 или 2 мл, суспензии полилактидных частиц растворяют в 5,0 или 10,00 мл диметилсульфоксида, соответственно. В мерные колбы вместимостью 10,00 мл вносят 2 мл 0,1% водного раствора индикатора, 1 мл H₂SO₄ (1 N), аликвотную часть суспензии образца частиц PLGA (от 1 до 5 мл, по необходимости) и доводят содержание диметилсульфоксида в колбе до 5,00 мл. Далее объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и через 30 минут измеряют оптическую плотность растворов.

Для определения общего содержания галлия (III) в осадках полилактидных частиц после центрифугирования осадок, оставшийся в центрифужной пробирке после отбора супернатанта, ресуспендируют и вновь лиофилизируют. Содержимое флакона после лиофилизации растворяют в диметилсульфоксиде (из расчета 5 мл диметилсульфоксида на осадок во флаконе, полученный из 1 мл исходного лиофилизата). В колбу объемом 10 мл вносят 2 мл 0,1% водного раствора индикатора, 1 мл 1 н H₂SO₄ и 5 мл раствора частиц PLGA в диметилсульфоксиде (в случае, если во флаконе было всего 5 мл, то его переносят количественно). Раствор доводят до метки водой, перемешивают и через 30 минут измеряют поглощение при 550 нм.

Вышеописанный способ определения галлия (III) в лиофилизате валидировали с использованием лиофилизата полилактидных частиц, содержащих хинализарин. Установлено незначительное мешающее влияние собственной окраски хинализарина на результаты определения концентрации галлия. Поэтому для определения галлия в лиофилизатах полилактидных частиц, содержащих хинализатрин, используют метод добавок. Результаты валидации способа представлены в таблице 2.

Таблица 2
Введено, мкг/мл	Найдено, мкг/мл
Образец 1181	0,443
Образец 1181 + добавка (0,700)	1,184

Таким образом, погрешность составляет 3,4%, а способ позволяет с достаточной точностью определять содержание галлия в образцах полилактидных частиц.

Степень связывания вычисляют как выраженное в процентах отношение содержания галлия (III) в осадке полилактидных частиц к содержанию галлия (III) в супернатанте, полученном после центрифугирования суспензии полилактидных частиц после их инкубации в растворе галлия (III).

ПРИМЕР 1 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ)

Получение и исследование полилактидных частиц, содержащих ковалентно связанный лиганд, образующий устойчивые комплексы с галлием (III)

Этап 1

Получение модифицированного ализарина для ковалентного связывания с полилактидными частицами

Растворяют 0,6 г ализарина 1 (2,5 ммоль), 1,0 г (6,3 ммоль) карбоэтоксипиперазина, 0,14 г KOH и 0,07 г параформа в 2,5 мл воды и 2,5 мл этанола и перемешивают при 75°C в течение 24 часов. Затем добавляют еще 0,1 г параформа и перемешивают еще 24 часа при той же температуре. После этого растворитель отгоняют, к остатку добавляют 30 мл воды и подкисляют уксусной кислотой до тех пор, пока цвет реакционной смеси изменится с фиолетового на желто-коричневый. Осадок соединения 2 отфильтровывают, промывают водой и смешивают с 15 мл воды и 15 мл HCl. Полученный раствор кипятят при перемешивании 4 часа. После охлаждения раствор фильтруют, фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют 20 мл этанола и снова упаривают. После этого остаток нагревают с 10 мл этанола до кипения. К кипящему раствору добавляют 30 мл ацетонитрила. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетонитрилом и сушат. Получают 227 мг продукта.

Модифицированный ализарин (220 мг, 0,54 ммоль) смешивают с резомером 360 мг Resomer 752H 3 (приблизительно 0,097 ммоль свободных карбоксильных групп), 192 мг EDC (0,65 ммоль), и 258 мг DIPEA (2 ммоль) перемешивают в 8,0 мл дихлорметана в течение 3-х суток. Смесь выливают в 100 мл воды и 50 мл этилацетата. Органическую фазу отделяют и промывают 8 раз в 100 мл дистиллированной воды. При каждой промывке добавляют 10 мл этилацетата. Промывают до тех пор, пока промывной раствор перестанет окрашиваться. После этого органическую фазу промывают 3-4 раза 100 мл 1% HCl и затем 1 раз 100 мл воды. Органическую фазу сушат сульфатом натрия и упаривают до объема 10 мл. К остатку при перемешивании добавляют 30 мл гексана. Выпавший осадок фильтруют и сушат. Получают 205 мг полимера.

Из сравнения ЯМР-спектров (растворитель - ДМСО, частота 400,46 МГц) модифицированного ализарина 2 и резомера 752H с привитым ализарином следует, что массовое содержание ализарина в продукте составляет приблизительно 5,8%. Кроме того, продукт содержит незначительные примеси гексана и этилацетата.

Этап 2

Получение полилактидных частиц, содержащих ковалентно связанный ализарин

Раствор полилактида (200 мг) и 50 мг модифицированного ализарином полилактида, полученного на этапе 1, в 5 мл дихлорметана смешивали с 25 мл 0,5%-ного раствора поливинилового спирта (9-10 тысяч Дальтон), 2 мин гомогенизировали на гомогенизаторе Turax при 23600 об/мин, затем - 5 мин на гомогенизаторе Avestin при 15000-20000 psi. Дихлорметан отгоняли на роторе до давления 15 миллибар, фильтровали на стеклянном фильтре с порами 10 мкм, добавляли 2,5% маннита, замораживали при -70°C и лиофилизовали на аппарате ALPHA 2-4LSC (Martin Christ GmbH).

Этап 3

Сорбция галлия (III) полилактидными частицами, полученными на этапе 2

Полилактидные частицы, полученные на этапе 2, ресуспендировали и трижды промывали дистиллированной водой от свободного ализарина методом осаждения-ресуспендирования в дистиллированной воде (центрифугирование - 30 минут при 13,2 тысяч об/мин и температуре 18°C на центрифуге 5415R (Eppendorf, Германия)).

Далее осадок частиц ресуспендировали в 1 мл ацетатного буфера с pH 5,0, прибавляли раствор сульфата галлия (III) с концентрацией 12,84 мг/мл и перемешивали на магнитной мешалке 2 часа при 250 об/мин. Супернатант и осадок разделяли центрифугированием 30 минут на центрифуге Beckman при 20000 об/мин и температуре 18°C.

Этап 4

Определение содержания галлия (III) в осадке полилактидных частиц, полученных на этапе 3 и в супернатанте

Модифицированные ализарином полилактидные частицы (образцы №№1324 и 1325) получают вышеописанным способом с использованием полимеров Resomer 752H / Resomer752H-ализарин (5:1) и Resomer 502H / Resomer502H-ализарин (5:1), соответственно. Сорбцию галлия (III) осуществляют в растворе сульфата галлия (III), содержащего заведомый избыток галлия (III) по отношению к ализариновым группам (около 3:1 и 2:1 для образцов 1324 и 1325, соответственно). Содержание свободного галлия (III) в супернатанте и галлия (III), связанного с ковалентно-модифицированными ализарином полилактидными частицами, определяли спектрофотометрически, вышеописанным способом. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
№	ZP, мВ	ZAVeD*, нм	PDI	Об. PSD, нм (%)	Содержание галлия (III), мкг/мг PLGA
1324	-0,456±0,186	160,1±0,1708	0,097±0,009	169 (100%)	0,23
				187,2	0,21
1325	-2,82±0,349	173,6±0,6557	0,097±0,007
				(100%)
* - размеры измерены при разбавлении образца в 50 раз.

ПРИМЕР 2

Получение полилактидных частиц с нековалентно связанными лигандами, способными образовывать устойчивые комплексы с галлием (III)

Используют бидентатные лиганды, удовлетворяющие следующим требованиям:

(1) лиганды относятся к классу аренов, в которых донорами неподеленной пары электронов для образования двух координационных связей с катионом галлия (III) служат атомы кислорода, непосредственно связанные с ароматическим кольцом, и/или атомы азота ароматического кольца;

(2) константа устойчивости lgβ1 не менее 5,0.

Желательно использовать лиганды, образующие с галлием (III) комплексы с коэффициентом экстракции неполярными растворителями, несмешивающимися с водой, из растворов в воде, полярных растворителях, или их смесей, больше 10, причем особенно желательно, когда дополнительно свободный лиганд растворим в полярном растворителе лучше, чем его комплекс с галлием (III).

Предпочтительными классами лигандов являются антрахиноны, флавоны, оксихинолины и трифенилметаны.

Конкретными примерами подходящих лигандов являются ализарин, хинализарин, ализариновый красный, кверцетин, 8-оксихинолин и алюминон (таблица 4).

Таблица 4
Название	Формула	Стехиометрия комплекса галлий(III):лиганд
Ализарин	1:3
Хинализарин	1:3
Кверцетин	1:3