Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза

Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству диагностикумов, используемых для выявления антител к возбудителям сапа и мелиоидоза в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Для определения антител к возбудителям особо опасных инфекций в РНГА известны диагностикумы, приготовленные с применением бараньих эритроцитов, обработанных танином с последующей сенсибилизацией их антигенным комплексом, выделенным из клеток возбудителей [1].

На сегодняшний день, в условиях все более увеличивающихся миграционных потоков, развития туризма и уровней коммуникации населения, а также в преддверии предстоящих международных спортивных форумов и связанным с этим наплывом зарубежных гостей особую актуальность приобретают иммунологические экспресс-методы исследований, направленные на своевременную и точную диагностику различных опасных инфекционных заболеваний. РНГА с антигенным диагностикумом позволяет определить уровень специфических сывороточных антител и может использоваться для диагностики сапа и мелиоидоза в условиях чрезвычайных ситуаций при заносе этих инфекций в Россию из эндемичных регионов.

Аналитические характеристики эритроцитарного диагностикума, направленного на выявление антител, во многом определяются качеством используемых для сенсибилизации носителя антигенных комплексов. Различные штаммы возбудителя мелиоидоза содержат разные по специфичности наборы антигенов, из них диагностически значимыми являются те, на которые прежде всего формируется иммунный ответ макроорганизма. Не все штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза пригодны для создания высокоспецифичных и чувствительных диагностических тест-систем [6]. Поэтому подбор штамма является наиболее существенной и определяющей задачей для создания качественного антигенного диагностикума.

Как известно, В. pseudomallei и В. mallei генетически чрезвычайно близки, чем обусловлено сходство и их антигенных характеристик [4]. Поэтому исторически при создании препаратов для диагностики сапа и мелиоидоза использовали антигены одного из этих возбудителей.

Наиболее близким аналогом является препарат, описанный в патенте RU №2188036 (прототип), где в качестве сенситина используют антигены высоковирулентного штамма возбудителя сапа Burkholderia mallei Ц5 [2].

Однако препарат-прототип отличает относительно низкая стабильность (препарат выпускается в жидком виде), трудоемкость и длительность процесса выделения антигенов из клеточной массы возбудителя сапа, который относится к особо опасным инфекциям и требует соблюдения специальных правил при проведении работ [СП 1.3 1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)]. Кроме того, возбудителей сапа отличают замедленные темпы роста и определенная прихотливость в питательных средах при культивировании по сравнению со штаммами возбудителей мелиоидоза.

Использование в прототипе для выделения антигенов цетавлона, с нашей точки зрения, несет определенные трудности. Как известно, цетавлон (цетилтриметиламмонийбромид) - положительно заряженный ионный детергент, который способствует растворению белков за счет связывания с гидрофобными участками полипептидов. Комплекс белковых антигенов с цетавлоном, особенно в кислой среде (pH 5,9), заряжен заведомо положительно. Благодаря электростатическому отталкиванию положительно заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи распрямляются, приобретают жесткость и могут меняться стереохимически, что приведет к затруднению образования комплексов «антиген-антитело» по принципу «ключ к замку».

Вышеперечисленные недостатки прототипа определяют задачу в получении определенного набора антигенов из штаммов возбудителя мелиоидоза для выявления антител на ранних стадиях развития заболевания.

Цель изобретения - создание антигенного эритроцитарного диагностикума на основе общих для возбудителей сапа и мелиоидоза диагностически значимых фракций суммарного антигенного комплекса для выявления антител на ранних стадиях заболевания.

Поставленная цель достигается тем, что для этого получают диагностически значимую фракцию клеточного антигенного комплекса Burkholderia pseudomallei 107, состоящую из антигенов гликопротеиновой природы и имеющую в своем составе мажорные протеины, которые в электрофорезе в ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН) характеризуются молекулярными массами - 28 кДа, 29 кДа, 40 кДа, 51,2 кДа, выделенную из суммарного клеточного антигенного комплекса этого штамма возбудителя путем ультразвуковой дезинтеграции ацетонвысушенных клеток микроорганизма и осаждением в насыщенном до 40% растворе сульфата аммония, которую применяют для сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана, в дальнейшем лиофильно высушенных, и затем проводят серологическую оценку полученного диагностикума, который и позволяет определять в РИГА специфические антитела даже в ранние сроки как сапной, так и мелиоидозной инфекций.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение фракции суммарного антигенного комплекса Burkholderia pseudomallei 107, используемой для сенсибилизации эритроцитов, и измерение молекулярной массы входящих в состав фракции протеинов.

Для получения суммарного антигенного комплекса высушенные после стерилизации ацетоном в течении суток в соотношении 1:3 клетки В. pseudomallei 107 суспендировали в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,2) и суспензию обрабатывали ультразвуком мощностью 100 Вт и частотой 20 кГц на льду за 5 циклов (1 мин - обработка, 5 мин - охлаждение). Затем взвесь разрушенных клеток центрифугировали при 15000 об/мин в течение 25 мин. Отбирали супернатант с суммарным антигенным комплексом.

Ранее установлено, что при концентрациях солей до 40% выпадают в осадок макромолекулы большей молекулярной массы [3]. Поэтому фракцию суммарного антигенного комплекса, используемую для сенсибилизации эритроцитов получали высаливанием в насыщенном до 40% сульфате аммония. Для этого в супернатант добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до конечной концентрации 40% и оставляли для формирования осадка на ночь при температуре +4°С. Затем раствор центрифугировали при 18000 об/мин в течение 25 мин и осадок, содержащий антигенные комплексы отбирали и ресуспендировали в 0,15 М растворе NaCl и использовали в работе для сенсибилизации эритроцитов.

Для измерения молекулярной массы протеинов фракции суммарного антигенного комплекса применяли электрофорез в ПААГ с додецилсульфатом натрия по методике Laemmli U.K. [8]. Электрофорез проводили в вертикальных пластинах 10% разделяющего геля и 5% концентрирующего геля размером 18×16 см, толщиной 1 мм в течение 18 часов при электрическом токе 5 мА и напряжении 20-34 В. Пластины геля окрашивали Кумасси R-250. Пробы фракции суммарного антигенного комплекса после удаления сульфата аммония в диалиазе против дистиллированной воды вносили в карманы треков шприцами «Гамильтон» в объеме 20 мкл.

Анализ полученных электрофореграмм выявил, что фракция суммарного антигенного комплекса имела в своем составе 4 мажорных протеина с молекулярными массами 28 кДа, 29 кДа, 40 кДа, 51,2 кДа (Рис.1).

Антигенные характеристики полученного препарата изучали в РИД, ВИЭФ, а также в РНГА с диагностикумом эритроцитарным иммуноглобулиновым сапным и мелиоидозным сухим, выпускаемом в ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Использовали сенситин с концентрацией белка не менее 10 мг/мл, специфическая активность которого была подтверждена в РИД и РНГА.

Пример 2.

Приготовление диагностикума антигенного эритроцитарного мелиоидозного и сапного.

Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса проводили с использованием формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Осадок, полученный из 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов, суспендировали в таком же объеме 0,01 М раствора NaCl pH 5,9, в который добавляли навески 50, 100, 200, 400 мкг/мл сухого антигенного комплекса соответственно. Сенсибилизацию проводили на водяной бане при температуре 45°С в течение 1,5-2 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляли добавлением 1% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. После трехкратного отмывания эритроциты доводили до концентрации 2,5% в 0,15 М растворе NaCl pH 7,2 и использовали в реакции непрямой гемагглютинации. Оптимальная сенсибилизирующая доза составила 100 мкг/мл, которая обусловливала чувствительность РНГА с контрольной сывороткой в титрах до 1:204800 с четкими отрицательными контролями.

Полученный диагностикум расфасовывали в стандартные ампулы (ОСТ 64-2-485-85) по 1 мл в виде 10% суспензии в протективной среде высушивания, которая содержала 15% реополиглюкина и 7,5% сахарозы, и подвергали лиофилизации в щадящем режиме в течение 24-28 час при плавном повышении температуры полок от -70°С до +25°С и постепенном снижении вакуума до 0,1 hPa (табл.1). После лиофилизации ампулы запаивали.

Пример 3. Определение аналитических и диагностических характеристик диагностикума (табл.2).

Качество диагностикума проверяли с козьими и кроличьими гипериммунными сыворотками, которые были получены путем многоцикловой иммунизации животных инактивированными взвесями возбудителей сапа и мелиоидоза [5]. Для повышения достоверности постановку РНГА проводили с 3 сериями препарата.

При постановке РНГА сыворотки разводили 1:10 0,15 М раствором NaCl, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл в 1% НКС с 1% формалином в полистироловой пластине, после чего в каждую лунку вносили по одной капле 2,5% взвеси диагностикума. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Табличные данные свидетельствуют о возможности применения диагностикума для определения уровня антител в иммунных сыворотках как к возбудителю сапа, так и к возбудителю мелиоидоза, при этом специфическая активность трех серий диагностикума антигенного эритроцитарного мелиоидозного и сапного в РНГА составила от 1:6400 до 1:204800.

Аналитические и диагностические характеристики диагностикума определяли с мелиоидозными и сапными сыворотками кроликов и коз. В результате было установлено, что титр антител к возбудителям мелиоидоза и сапа в разных сыворотках составляет от 1:160 до 1:204800. За диагностический был принят титр -1:160. Специфичность препарата подтверждена отсутствием перекрестных реакций в диагностическом титре с 5 гетерологичными, 5 кроличьими сыворотками, 5 диагностическими коммерческими агглютинирующими сыворотками, а также 5 сыворотками фактически здоровых людей и 5 интактными сыворотками лабораторных животных.

Диагностикум эритроцитарный мелиоидозный и сапной антигенный сухой успешно прошел контрольные межлабораторные испытания на базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол №3/12 от 22.06.2012 г., утвержденный директором института проф. В.А. Антоновым) и рекомендован к внедрению в производство.

Использованная литература

1. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. - М.: Медицина. - 1976. - 162 с.

2. Левчук Б.А., Кузнецов С.Л., Бондарева Т.А. и др. Способ получения диагностикума эритроцитарного антигенного сапного. // RU №2188036. - Патент на изобр., опубл. 27.08.2002.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: МИР. - 1985. - 360 с.

4. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. академика РАМП, проф. Г.Г. Онищенко. // М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006, 288 с.

5. Способ получения мелиоидозной иммунной сыворотки / Кулаков М.Я. с соавт. // RU 2249464 C1. - Патент на изобр., опубл. 10.04.2005.

6. Alexander A.D., Huxsoll D.L., Warner A.R. et al. Serological Diagnosis of Human Melioidosis with Indirect Hemagglutination and ComplementFixation Tests. Applied microbiology, Nov. 1970, p.825-833.

7. Cheng A.C., O'Brien М., Freeman K., et al. Indirect hemagglutination assay in patients with melioidosis in northern Australlia. // Am. J. Trop. Med. Hyg, Feb 2006; 74: 330-334.

8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, Aug. 1970; 227(5259): 680-5.

Таблица 1
Параметры лиофилизации препарата «Диагностикум антигенный эритроцитарный мелиоидозный и сапной сухой»
№ п/п	Время (ч)	Температура полки (°С)	Давление (Pa)
1	4,0	-70	30
2	2,0	-20	25
3	2,0	-15	20
4	2,0	-10	20
5	2,0	-5	20
6	2,0	0	20
7	2,0	5	15
8	2,0	10	15
9	2,0	20	15
10	4,0	25	10

Рисунок 1.

Электрофореграмма ПААГ с ДСН протеинов.

Обозначения треков: 1 - суммарный антигенный комплекс B. pseudomallei 107, 2 - маркерные белки, 3 - фракция суммарного антигенного комплекса B. pseudomallei 107 после высаливания (проба 25 мкл), 4 - фракция суммарного антигенного комплекса B. pseudomallei 107 после высаливания (проба 20 мкл).

Таблица 2
Аналитические и диагностические характеристики диагностикума эритроцитарного антигенного мелиоидозного и сапного сухого
	Серия или № сыворотки, вид животного	Антиген, используемый для иммунизации / производитель.	Титры РНГА∗
Серия диагностикума
72/11	73/11	74/11
1	2	3	4	5	6
1	Сыворотка кролика 9072	В. pseudomallei 56830	1:12800	1:6400	1:6400
2	Сыворотка кролика 0024	В. pseudomallei 57576 + В. pseudomallei 56830	1:25600	1:25600	1:6400
3	Сыворотка кролика 9880	В. pseudomallei 59361 «S»	1:12800	1:12800	1:6400
4	Сыворотка кролика 9513	В. pseudomallei 59361	1:1600	1;1600	1:1600
5	Сыворотка кролика 7581	В. mallei 10230	1:6400	1:6400	1:3200
6	Сыворотка кролика 2767	В. pseudomallei VPA	1:320	1:640	1:320
7	Сыворотка кролика 2766	В. pseudomallei 107	1:1280	1:2560	1:1280
8	Сыворотка козла 5-1	В. pseudomallei 57576 + В. pseudomallei 56830	1:6400	1:6400	1:6400
9	Сыворотка козла 10-5	В. pseudomallei 111-6-1	1:6400	1:12800	1:6400
10	Сыворотка козла 11-10	В. mallei 10230	1:25600	1:51200	1:25600
11	Сыворотка козла 7424-14	В. pseudomallei 100	1:12800	1:25600	1:12800
12	Сыворотка козла 9921-12	В. pseudomallei 100	1:102400	1:204800	1:51200
13	Сыворотка кролика 9919	P. aeruginosa H-8	-	-	-
14	Сыворотка кролика 9920	P. aeruginosa H-6	-	-	-
15	Сыворотка кролика 9929	B. cepacia 423	-	-	-
16	Сыворотка кролика 9041	P. fluorescens 540	-	-	1:20
17	Сыворотка кролика 5520	В. cepacia 8235	-	-	-
18	Сыворотка кролика 1825	F. tularensis 32	-	-	-
19	Сыворотка человека 1	нет	1:20	1:40	1:20
20	Сыворотка человека 2	нет	-	-	-
21	Сыворотка человека 3	нет	1:20	-	1:20
22	Сыворотка человека 4	нет	-	-	-
23	Сыворотка человека 5	нет	-	-	-
24	Сыворотка белой крысы	нет	-	-	-
25	Сыворотка морской свинки 1	нет	-	-	-
26	Сыворотка морской свинки 2	нет	-	-	1:20
27	Сыворотка золотистого хомячка	нет	-	-	-
28	Сыворотка белой мыши	нет	-	-	-
29	Сыворотка чумная агглютинирующая	РосНИПЧИ «МИКРОБ»	-	-	-
30	Сыворотка бруцеллезная поливалентная	Иркутск НИПЧИ	-	-	1:20
31	Противосибиреязвенный глобулин с-6-8	Тбилиси НИИВС	-	-	-
32	Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная O-5	Санкт-Петербург НИИВС	-	-	-
Примечание: ∗ - Титры указаны по результатам РНГА в лунках на 3+ 4+ по общепринятым принципам учета реакции
«-» - сывороточные антитела к возбудителям мелиоидоза и сапа не выявлены

1. Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза, включающий получение антигена и последующее приготовление на его основе эритроцитарного диагностикума, отличающийся тем, что для получения диагностически значимой фракции суммарного антигенного комплекса, для выявления антител на ранних стадиях заболевания, выращенную культуру авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107 в течение суток стерилизуют ацетоном в соотношении 1:3, удаляют ацетон, а высушенную бактериальную массу суспендируют в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,2) и суспензию обрабатывают ультразвуком мощностью 100 Вт и частотой 20 кГц на льду за 5 циклов: 1 мин - обработка, 5 мин - охлаждение, затем взвесь разрушенных клеток центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25 мин, отбирают супернатант с суммарным антигенным комплексом, из которого далее высаливают в насыщенном до 40% сульфате аммония гликопротеиновую фракцию, имеющую в своем составе четыре мажорных протеина, с молекулярными массами, определенными методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия, - 28 кДа, 29 кДа, 40 кДа, 51,2 кДа, на основе которой получают диагностикум.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученную фракцию антигенного комплекса после сушки добавляют навесками 50, 100, 200, 400 мкг/мл к формалинизированным танизированным эритроцитам барана, сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 1,5-2 ч при постоянном перемешивании, фиксацию осуществляют добавлением 1% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин, а после трехкратного отмывания эритроциты доводят до концентрации 2,5% в 0,15 М растворе хлористого натрия pH 7,2, полученный диагностикум сушат лиофильно в протективной среде высушивания, содержащей 15% реополиглюкина и 7,5% сахарозы.