Антитела к рецептору инсулинподобного фактора роста i и их применение

Антитела к рецептору инсулинподобного фактора роста i и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к антителам к рецептору инсулинподобного фактора роста I (IGF-IR), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и их применению.

Рецептор инсулинподобного фактора роста I (IGF-IR, КФ 2.7.112, антиген CD 221) относится к семейству трансмембранных протеин-тирозин-киназ (LeRoith D. и др., Endocrin. Rev. 16, 1995, cc.143-163; и Adams Т.Е. и др., Cell. Mol. Life Sci. 57, 2000, cc.1050-1093). IGF-IR связывается с IGF-I с высокой аффинностью и инициирует физиологический ответ на этот лиганд in vivo. IGF-IR связывается также с IGF-II, однако с несколько более низкой аффинностью. Сверхэкспрессия IGF-IR стимулирует неопластическую трансформацию клеток, и имеются данные о том, что IGF-IR участвует в трансформации клеток в злокачественные клетки и поэтому является пригодной мишенью при разработке терапевтических средств лечения рака (Adams Т.Е. и др., Cell. Mol. Life Sci. 57, 2000, cc.1050-1093).

Антитела к IGF-IR хорошо известны в данной области, и изучено их противоопухолевое действие in vitro и in vivo (Benini S. и др., Clin. Cancer Res. 7, 2001, cc.1790-1797; Scotlandi K. и др., Cancer Gene Ther. 9, 2002, cc.296-307; Scotlandi K. и др., Int. J. Cancer 101, 2002, cc.11-16; Brunetti А. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1989, cc.212-218; Prigent S.A. и др., J. Biol. Chem. 265, 1990, cc.9970-9977; Li S.L. и др., Cancer Immunol. Immunother. 49, 2000, cc.243-252; Pessino А. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162, 1989, cc.1236-1243; Surinya K.H. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, cc.16718-16725; Soos M.A. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, cc.12955-12963; Soos M.A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc.5217-5221; O'Brien R.M. и др., ЕМВО J. 6, 1987, cc.4003-4010; Taylor R. и др., Biochem. J. 242, 1987, cc.123-129; Soos M.A. и др., Biochem. J. 235, 1986, cc.199-208; Li S.L. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 1993, cc.92-98; Delafontaine Р. и др., J. Mol. Cell. Cardiol. 26, 1994, cc.1659-1673; Kull F.C. Jr. и др. J. Biol. Chem. 258, 1983, cc.6561-6566; Morgan D.O. и Roth R.A., Biochemistry 25, 1986, cc.1364-1371; Forsayeth J.R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, cc.3448-3451; Schaefer E.M. и др., J. Biol. Chem. 265, 1990, cc.13248-13253; Gustafson T.A. и Rutter W.J., J. Biol. Chem. 265, 1990, cc.18663-18667; Hoyne P.A. и др., FEBS Lett. 469, 2000, cc.57-60; Tulloch P.A. и др., J. Struct. Biol. 125, 1999, cc.11-18; Rohlik Q.T. и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 149, 1987, cc.276-281; и Kalebic T. и др., Cancer Res. 54, 1994, cc.5531-5534; Adams Т.Е. и др., Cell. Mol. Life Sci. 57, 2000, cc.1050-1093; Dricu А. и др., Glycobiology 9, 1999, cc.571-579; Kanter-Lewensohn L. и др., Melanoma Res. 8, 1998, cc.389-397; Li S.L. и др., Cancer Immunol. Immunother. 49, 2000, cc.243-252). Антитела к IGF-IR описаны также в многочисленных других публикациях, например, у Arteaga C.L. и др., Breast Cancer Res. Treatment 22, 1992, cc.101-106; и Hailey J. и др., Mol. Cancer Ther. 1, 2002, cc.1349-1353.

В частности, моноклональное антитело к IGF-IR, имеющее название αIR3, нашло широкое применение при исследовании опосредуемых IGF-IR процессов и опосредуемых IGF-I заболеваний, таких как рак. Альфа-IR-3 описано у Kull F.C., J. Biol. Chem. 258, 1983, cc.6561-6566. С тех пор опубликовано около ста работ, посвященных исследованию и терапевтическому применению αIR3, в которых рассматривается его противоопухолевое действие индивидуально и в сочетании с цитостатическими агентами, такими как доксорубицин и винкристин. αIR3 представляет собой мышиное моноклональное антитело, в отношении которого известно, что оно ингибирует связывание IGF-I с рецептором IGF, но не ингибирует связывание IGF-II с IGF-IR. В высоких концентрациях αIR3 стимулирует пролиферацию опухолевых клеток и фосфорилирование IGF-IR (Bergmann U. и др., Cancer Res, 55, 1995, cc.2007-2011; Kato H. и др., J. Biol. Chem. 268, 1993, cc.2655-2661). Существуют другие антитела (например, 1Н7, см. Li S.L. и др., Cancer Immunol. Immunother. 49, 2000, cc.243-252), которые ингибируют связывание IGF-II с IGF-IR в большей степени, чем связывание IGF-I. Обзор уровня техники, касающийся антител и их свойств и характеристик, приведен у Adams Т.Е. и др., Cell. Mol. Life Sci. 57, 2000, cc.1050-1093.

Большинство антител, известных из существующего уровня техники, имеют происхождение из организма мыши. Как хорошо известно, из существующего уровня техники, такие антитела нельзя применять в терапии человека без дополнительных изменений, таких как химеризация или гуманизация. Вследствие указанных недостатков в качестве терапевтических агентов для лечения людей наиболее предпочтительно применяют человеческие антитела. Человеческие антитела хорошо известны из существующего уровня техники (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc.368-374). С использованием этой технологии можно получать человеческие антитела к широкому разнообразию мишеней. Примеры человеческих антител к IGF-IR представлены в WO 02/053596, WO 2004071529, WO 2005016967, WO 2006008639, US 20050249730, US 20050084906, WO 2005058967, WO 2006013472, US 20030165502, WO 2005082415, WO 2005016970, WO 03106621, WO 04083248, WO 2003100008, WO 2004087756, WO 2005005635 и WO 2005094376.

Однако все еще сохраняется потребность в антителах к IGF-IR, обладающих выраженными благоприятными действиями для пациентов, нуждающихся в противоопухолевой терапии. Проще говоря, благоприятное действие для пациента означает уменьшение роста опухоли и существенное увеличение времени до прогрессирования заболевания, обусловленное лечением с применением противоонкогенного средства.

У Routier F.H. и др., Glycoconjugate J. 14, 1997, cc.201-207, описана схема гликозилирования гуманизированного антитела в виде IgG1, экспрессируемого в клетках линии CHO-DUKX. Для этого антитела молярное соотношение остатков фукозы и маннозы (Fuc:Man) составляет 0,8:3,0, что соответствует степени гликозилирования, составляющей 80%. У Niwa R. и др., J. Immunol. Methods 306, 2005, cc.151-160, описаны антитела к CD20 в виде IgG1 и IgG3, которые рекомбинантно продуцируются в клетках линии СНО DG44, имеющие степень фукозилирования 90% и 91% соответственно. У Mimura Y. и др., J. Immunol. Methods 247, 2001, cc.205-216, описано, что бутират повышает производство человеческого химерного IgG в клетках линии СНО-K1, сохраняя при этом функцию и профиль гликозилирования. Олигосахаридные профили свидетельствуют о значительном содержании нефукозилированных гликановых структур. У Raju T.S., BioProcess International 1, 2003, cc.44-53, описано влияние вариации гликозилирования, обусловленной экспрессионными системами, на биологическую активность и номенклатуру терапевтических иммуноглобулинов. У Ма S. и др., Anal. Chem. 71, 1999, cc.5185-5192 описан анализ углеводного состава ритуксимаба. Ритуксимаб имеет степень фукозилирования 9-10% (Niwa R. и др., J. Immunol. Methods 306, 2005, cc.151-160). У Fujii S., J. Biol. Chem 265, 1990, cc.6009-6018 указано, что бычий IgG содержит примерно 11% нефукозилированного IgG. У Mizuochi Т., J. Immunol. 129, 1982, cc.2016-2020, приведены данные о том, что человеческий IgG является примерно на 14% нефукозилированным. У Bergwerff A.A., Glycoconjugate J. 12, 1995, cc.318-330 указано, что антитела, продуцируемые в организме мышей линии SP2/0, содержат в больших количествах олигосахариды N-гликолилнейраминовой кислоты (NGNA). У Nahrgang S. и др., In: Animal Cell Technology: Products from Cells, Cells as Products, под ред. Bernard А. и др., изд-во Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999, cc.259-261, указано, что при экспрессии IgG1 в клетках СНО после кратковременной трансфекции обнаружено в целом незначительное гликозилирование. У Lund J. и др., Mol. Immunol. 30, 1993, cc.741-748 описано рекомбинантное получение мышиного-человеческого антитела в клетках мышиной трансфектомы. Антитело в виде IgG1 является нефукозилированным примерно на 13%. У Patel Т.Р. и др., Biochem. J. 285, 1992, cc.839-845, описано гликозилирование антител, полученных из клеток гибридомы и мышиных асцитов. У Niwa R. и др., J. Immunol. Methods 306, 2005, cc.151-160, указано, что антитело в виде IgGI к CD20, полученное методом рекомбинации в клетках СНО DG44, имеет фукозилирование, составляющее 91%, а у Mori К. и др., Biotech. Bioeng. 88, 2004, cc.901-908, указано, что фукозилирование составляет 94%. У Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng. 74, 2001, cc.288-294, указано, что экспрессия антител с измененными гликоформами приводит к повышению антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC). У Sheeley D.M. и др., Anal. Biochem. 247, 1997, cc.102-110, приведено сравнение гликозилирования антител, полученных в различных экспрессионных системах. У Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, cc.26733-26740, указано, что отсутствие фукозы на Fc-фрагменте человеческого IgG1 повышает связывание FcγRIII и повышает ADCC. Антитело Her2, которое имеет степень гликозилирования, составляющую примерно 90%, обладает также значительной ADCC. У Zhu L. и др., Nature Biotechnol. 23, 2005, cc.1159-1169, описано получение человеческих антител в куриных яйцах.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к антителу, обладающему способностью к связыванию с IGF-IR, которое представляет собой человеческое антитело IgG1- или IgG3-типа и является гликозилированным сахарной цепью на остатке Asn297, где антитело отличается тем, что количество остатков фукозы в сахарной цепи составляет по меньшей мере 98% («полностью фукозилированное антитело», предпочтительные версии приведены ниже) и, кроме того, количество остатков NGNA составляет 1% или менее и/или количество остатков N-концевой альфа-1,3-галактозы составляет 1% или менее.

В контексте изобретения понятие «количество» означает количество сахарных остатков в сахарной цепи, присоединенной к Asn297, взятое по отношению к сумме G0, G1, G2 (без маннозы (4 и 5)), принимаемой за 100%, и его рассчитывают, как описано в примере 3.

Согласно изобретению можно создавать антитела, связывающиеся с IGF-IR, которые имеют степень фукозилирования, составляющее даже 99,4% или более, 99,5% или более или 99,9% или более.

Предпочтительно количество NGNA составляет 0,5% или менее, более предпочтительно 0,1% или менее, и даже представляет собой количество, не обнаруживаемое с помощью ЖХ-МС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия).

Предпочтительно количество N-концевой альфа-1,3-галактозы составляет 0,5% или менее, более предпочтительно 0,1% менее, и даже представляет собой количество, не обнаруживаемое с помощью ЖХ-МС.

Сахарная цепь предпочтительно обладает характеристиками N-связанных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое связывается с IGF-IR, рекомбинантно экспрессируемого в клетке СНО (клетка яичника китайского хомячка).

Предпочтительно клетка СНО представляет собой клетку СНО, имеющую делецию (например, DG44) или функциональную инактивацию обоих аллелей DHFR или делецию одного аллеля DHFR и функциональную инактивацию второго аллеля DHFR (например, DXB11).

Предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело. Предпочтительно антитело представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

Изобретение предпочтительно относится к полностью фукозилированному антителу, обладающему способностью связываться с IGF-IR и ингибировать связывание IGF-I и IGF-II с IGF-IR, где антитело отличается тем, что оно обладает одним или несколькими свойствами, выбранными из группы, включающей:

а) соотношение значений IC50, характеризующих ингибирование связывания IGF-I с IGF-IR и ингибирование связывания IGF-II с IGF-IR, составляет от 1:3 до 3:1;

б) в концентрации 5нМ ингибирует по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90% фосфорилирование IGF-IR по данным клеточного анализа фосфорилирования с использованием клеток линии НТ29 в среде, содержащей 0,5% инактивированной тепловой обработкой фетальной телячьей сыворотки (FCS), по сравнению с фосфорилированием по данным анализа без антитела;

в) не обладает IGF-IR-стимулирующей активностью (отсутствие передачи сигнала, отсутствие IGF-1-подобной активности), измеряемой по РKВ-фосфорилированию при использовании концентрации 10 мкМ в клеточном анализе фосфорилирования с использованием клеток линии 3Т3, имеющих 400000-600000 молекул IGF-IR на клетку, в среде, содержащей 0,5% инактивированной тепловой обработкой фетальной телячьей сыворотки (FCS) по сравнению с фосфорилированием в анализе без антитела;

г) осуществляет понижающую регуляцию на 50% или более IGF-IR, экспрессируемых на опухолевых клетках (например, линии НТ29) через 24 ч после добавления антитела к клеткам.

Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают благоприятным действием для пациента, нуждающегося в противоопухолевой терапии, и обеспечивают снижение роста опухоли и значительное увеличение времени до прогрессирования заболевания. Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают новыми и имеющими признаки изобретения свойствами, оказывают благоприятное действие на пациента, страдающего заболеванием, ассоциированным с нарушением регуляции IGF, прежде всего заболеванием, связанным с опухолью. Антитела, предлагаемые в изобретении, отличаются указанными выше свойствами.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что антитело, предлагаемое в изобретении («полностью фукозилированное антитело»), не вызывает ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) (ее величина отклоняется не более чем на 3×С.К.О. (стандартное отклонение) от используемого в качестве эталона стандартного антитела (референс-антитело) (антитело к гемоцианину лимфы улитки, т.е. антитело к KLH)) как продемонстрировано в ADCC-анализе, описанном в примере).

Предпочтительно антитело, которое обладает способностью специфически связываться с IGF-IR, ингибировать связывание IGF-1 и IGF-II с IGF-IR в указанном выше соотношении, представляет собой антитело IgG1-изотипа и оно не активирует передачу сигнала IGF-IR даже в клетках, сверхэкспрессирующих IGF-IR, при концентрациях, в 200 раз превышающих его значение IC₅₀.

Антитела, связывающиеся с IGF-IR, которые не обладают «IGF-1-подобной активностью» и характеризуются «полным фукозилированием», имеют выраженное преимущество при применении в качестве терапевтического средства.

Предпочтительно антитела, предлагаемые в изобретении, в концентрации 5нМ полностью ингибируют трансдукцию опосредуемого IGF-I сигнала IGF-IR в опухолевых клетках.

Ниже перечислены кодируемые нуклеиновыми кислотами полипептиды, которые обладают способностью к сборке с соответствующей другой цепью антитела с образованием антитела, предлагаемого в изобретении:

а) тяжелая цепь антитела, содержащая в качестве CDR CDR1 (ак 31-35), CDR2 (ак 50-66) и CDR3 (ак 99-107) последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 или 3;

б) легкая цепь антитела, содержащая в качестве CDR CDR1 (ак 24-34), CDR2 (ак 50-56) и CDR3 (ак 89-98) последовательности, представленной в SEQ ID NO:2 или 4.

Предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело и, кроме того, химерное антитело (содержащее человеческую константную цепь), гуманизированное антитело и наиболее предпочтительно человеческое антитело.

Антитело предпочтительно конкурирует с антителом 18 за связывание с человеческим IGF-IR (КФ 2.7.1.112, SwissProt P08069):

Кроме того, антитело предпочтительно характеризуется аффинностью к связыванию, составляющей 10^-8 М (K_D) или менее, предпочтительно от примерно 10^-9 до 10^-13 М.

Предпочтительно антитело не обладает обнаруживаемой зависимостью способности ингибировать связывание инсулина с рецептором инсулина от концентрации.

Предпочтительно антитело представляет собой антитело IgG1-типа.

Антитело, предлагаемое в изобретении, значительно увеличивает время до прогрессирования заболевания на моделях с использованием соответствующих ксенотрансплантатов опухолей по сравнению с животными, обработанными наполнителем, и замедляет рост опухоли. Антитело ингибирует связывание IGF-I и IGF-II с IGF-IR in vitro и in vivo, предпочтительно в примерно одинаковой степени как касательно IGF-I, так и IGF-II.

Предпочтительно антитела, предлагаемые в изобретении, содержат в качестве гипервариабельных участков (CDR) следующие последовательности:

а) тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве CDR CDR1 (ак 31-35), CDR2 (ак 50-66) и CDR3 (ак 99-107) последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 или 3;

б) легкую цепь антитела, содержащую в качестве CDR CDR1 (ак 24-34), CDR2 (ак 50-56) и CDR3 (ак 89-98) последовательности, представленной в SEQ ID NO:2 или 4.

Предпочтительные вариабельные области и CDR, прежде всего CDR3 тяжелой цепи антител, предлагаемых в изобретении, получают из клона 18 <IGF-1R> HUMAB (антитело 18) и клона 22 <IGF-1R> HUMAB (антитело 22), депонированных в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбН (DSMZ), Германия.

Линия клеток	Регистрационный номер	Дата депонирования
клон 18 <IGF-1R> HUMAB	DSM ACC 2587	10.04.2003
клон 22 <IGF-1R> HUMAB	DSM ACC 2594	09.05.2003

Указанные антитела подробно описаны в WO 2005/005635. Другие предпочтительные вариабельные области и CDR, прежде всего CDR3 тяжелой цепи антител, предлагаемых в изобретении, получают из клона 1а <IGF-1R> HuMab (антитело 1А, At 1A или Ak 1A), клона 23 <IGF-1R> HuMab (антитело 23) и клона 8 <IGF-1R> HuMab (антитело 8), депонированных в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбН (DSMZ), Германия:

Линия клеток	Регистрационный номер	Дата депонирования
клон 1a <IGF-1R> HUMAB	DSM ACC 2586	10.04.2003
клон 23 <IGF-1R> HUMAB	DSM ACC 2588	10.04.2003
клон 8 <IGF-1R> HUMAB	DSM ACC 2589	24.04.2003

Указанные антитела подробно описаны в WO 2005/087756.

Изобретение относится также к способам рекомбинантного получения таких антител.

Изобретение относится также к способам лечения рака, заключающимся в том, что пациенту, у которого диагностирован рак (и который, следовательно, нуждается в противоопухолевой терапии), вводят в эффективном количестве антагонистическое антитело к IGF-IR, предлагаемое в изобретении. Антитело можно вводить индивидуально в виде фармацевтической композиции или в альтернативном варианте в сочетании с цитотоксическим лечением, таким как радиотерапия, или с цитотоксическим средством или его пролекарством.

Кроме того, изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для лечения рака и для приготовления фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении. Изобретение относится также к способу приготовления фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело, предлагаемое в изобретении, в фармацевтически эффективном количестве необязательно в сочетании с буфером и/или адъювантом, который можно применять в фармацевтических целях для приготовления лекарственных форм.

В изобретении предложены также фармацевтические композиции, содержащие такие антитела в фармацевтически приемлемом носителе. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическую композицию можно включать в состав изделия или набора.

Кроме того, изобретение относится к способу получения рекомбинантного человеческого антитела, предлагаемого в изобретении, отличающемуся тем, что осуществляют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, которое обладает способностью связываться с IGF-IR, в клетке-хозяине, представляющей собой СНО-клетку, в результате чего происходит полное фукозилирование антитела, и выделяют антитело из клетки. Изобретение относится также к антителу, которое можно получать таким методом рекомбинации.

Краткое описание чертежа

На чертеже показана столбиковая диаграмма, иллюстрирующая ADCC-активность (или ее отсутствие) антител, предлагаемых в изобретении, и контроля и антител, используемых для сравнения.

Подробное описание изобретения

Понятие «антитело» относится к различным формам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) полные антитела, фрагменты антител, человеческие антитела, гуманизированные антитела и созданные с помощью генной инженерии антитела, если они сохраняют отличительные признаки, предлагаемые в изобретении.

Понятие «фрагменты антитела» относится к части полноразмерного антитела, как правило, по меньшей мере к его антигенсвязывающему центру или вариабельной области. Примерами фрагментов антител являются двойные антитела, молекулы одноцепочечных антител, иммунотоксины и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый состав аминокислот. Соответственно понятие «человеческое моноклональное антитело» относится к антителам, обладающим одинаковой специфичностью к связыванию, которые имеют вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из одного источника или видов и по меньшей мере часть константной области из другого источника или других видов, которое, как правило, получают с помощью методов рекомбинантной ДНК. Особенно предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела представляют собой продукт экспрессированных генов иммуноглобулина, которые содержат ДНК-сегменты, кодирующие вариабельные области мышиного иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, кодирующие константные области человеческого иммуноглобулина. Другие формы «химерных антител», подпадающие под объем настоящего изобретения, представляют собой такие формы, в которых класс или подкласс модифицирован или заменен относительно исходного антитела. Такие «химерные» антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Методы получения химерных антител включают общепринятые методы, основанные на применении рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые в настоящее время хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и 5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасный участок или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения «гуманизированного антитела» мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270). Наиболее предпочтительные CDR соответствуют репрезентативным последовательностям, которые распознают антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «человеческое антитело» относится к антителам, имеющим вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Вариабельную тяжелую цепь предпочтительно получают из последовательности зародышевой линии DP-50 (GenBank L06618), а вариабельную легкую цепь предпочтительно получают из последовательности зародышевой линии L6 (GenBank X01668), или вариабельную тяжелую цепь предпочтительно получают из DP-61 (GenBank М99682), а вариабельную легкую цепь предпочтительно получают из последовательности зародышевой линии L15 (GenBank K01323). Константные области антитела представляют собой константные области человеческого иммуноглобулина IgG1-типа. Такие области могут быть аллотипическими, они описаны, например, у Johnson G. и Wu Т.Т., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc.214-218, и в указанных в этой публикации ссылках.

Понятие «рекомбинантное человеческое антитело» относится к антителам, имеющим вариабельную и константную области, которые получены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии и находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, были подвергнуты in vivo соматической гипермутации. Так, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH- и VL-областей человеческой зародышевой линии и являются родственными им, могут не встречаться in vivo в спектре зародышевой линии человеческого антитела.

В контексте настоящего описания понятие «связывание» относится к связыванию антитела с IGF-IR, которое характеризуется аффинностью, составляющей примерно от 10^-13 до 10^-8 М (K_D), предпочтительно примерно от 10^-13 до 10^-9 М.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «молекула нуклеиновой кислоты» включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК.

Человеческие константные области IgG1- или IgG3-типа подробно описаны у Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991, и у Bruggemann M. и др., J. Exp. Med. 166, 1987, cc.1351-1361; Love T.W. и др., Methods Enzymol. 178, 1989, cc.515-527. Их примерами являются последовательности, представленные в SEQ ID NO:5-8. Другие пригодные и предпочтительные константные области представляют собой константные области антител, которые можно получать из линий клеток гибридомы, депонированных в DSMZ для целей настоящего изобретения.

Константные области IgG1- или IgG3-типа гликозилированы на остатке Asn297. В контексте настоящего описания «Asn 297» означает аминокислоту аспарагин, локализованную примерно в положении 297 в Fc-фрагмента; вследствие небольших вариаций последовательностей антител Asn297 может находиться также на несколько аминокислот (как правило, не более чем на ±3 аминокислоты) выше или ниже. Например, в одном из антител, предлагаемых в изобретении, «Asn297» находится в положении 298 аминокислотной последовательности.

Гликозилирование человеческого IgG1 или IgG3 имеет место на Asn297 в виде гликозилирования, осуществляемого с помощью сложного биантенного олигосахарида с коровым фукозилированием, на концах которого располагаются вплоть до 2 остатков Gal. Эти структуры обозначены как гликановые остатки G0, G1 (α1,6 или α1,3) или G2, в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int. 1, 2003, cc.44-53). СНО-тип гликозилирования Fc-фрагментов антитела описан, например, у Routier F.H., Glycoconjugate J. 14, 1997, сс.201-207.

Понятие «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания относится к каждой из пары легких и тяжелых цепей, которые непосредственно принимают участие в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных областей легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит 4 каркасных участка (FR), последовательности которых являются высококонсервативными, связанных тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность областями, CDR). Каркасные участки адаптированы к β-складчатой конформации, а CDR-участки могут формировать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживаются в виде своей трехмерной структуры с помощью каркасных участков и формируют с CDR-участками другой цепи антигенсвязывающий центр. СОР3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют наиболее важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и вследствие этого являются дополнительным объектом изобретения.

Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность областей» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельной области, остатки которых отличны от остатков гипервариабельного участка, как они определены в настоящем описании. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR3 тяжелой цепи представляет собой участок, который обеспечивает главным образом связывание с антигеном. К CDR- и FR-участкам относят участки, которые определяют согласно стандартному определению Кэбота и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) и/или остатки из «гипервариабельной петли».

В контексте настоящего описания понятие «связывание с IGF-IR» означает связывание антитела с IGF-IR, обнаруживаемое в анализе in vitro, предпочтительно в анализе связывания, в котором антитело связывают с поверхностью и связывание IGF-IR измеряют с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR). Наличие связывания означает, что аффинность к связыванию (K_D) составляет 10^-8 М или менее, предпочтительно от 10^-13 до 10^-9 М.

Связывание с IGF-IR можно исследовать с помощью BIAcore-анализа (фирма Pharmacia Biosensor AB, Уппсала, Швеция). Аффинность к связыванию определяют в понятиях ka (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), kd (константа диссоциации) и K_D (kd/ka). Антитела, предлагаемые в изобретении, характеризуются значением K_D, составляющим 10^-10 M или менее.

Антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют также связывание IGF-I и IGF-II с IGF-IR. Ингибирование оценивают по величине IC₅₀ в анализе связывания IGF-I/IGF-II с IGF-IR на опухолевых клетках. Такой анализ описан в примере 7. В таком анализе измеряют количество несущего радиоактивную метку IGF-I или IGF-II или их IGF-IR-связывающих фрагментов, связанных с IGF-IR, находящимся на поверхности указанных опухолевых клеток (например, линии НТ29), в отсутствие антитела и в присутствии возрастающих концентраций антитела. Значения IC₅₀ для антител, предлагаемых в изобретении, характеризующие ингибирование связывания IGF-I и IGF-II с IGF-IR, составляют не более 2 нМ и отношение значений IC₅₀, характеризующих ингибирование связывания IGF-I/IGF-II с IGF-IR, составляет примерно от 1:3 до 3:1. Значения IC₅₀ определяют как средние или медианные значения по результатам по меньшей мере трех независимых измерений. Отдельные значения IC₅₀ могут выпадать из указанного диапазона.

В контексте настоящего описания понятие «ингибирование связывания IGF-I и IGF-II с IGF-IR» относится к ингибированию связывания меченного с помощью I¹²⁵ IGF-I или IGF-II с IGF-IR, присутствующим на поверхности опухолевых клеток линии НТ29 (АТСС НТВ-38), в анализе in vitro. Наличие ингибирования означает, что значение IC₅₀ составляет 2 нМ или менее.

Понятие «клетки, экспрессирующие IGF-IR» относится к таким клеткам, в которых происходит сверхэкспрессия рецептора IGF-I с уровнем, составляющим по меньшей мере примерно 20000 рецепторов/клетку. Такими клетками являются, например, линии опухолевых клеток, такие как NCI H322M или НТ29, или линия клеток (например, 3Т3 АТСС CRL1658), которая сверхэкспрессирует IGF-IR после трансфекции экспрессионным вектором, обеспечивающим экспрессию IGF-IR. Количество рецепторов на клетку оценивают согласно методу, описанному у Lammers, R. и др., EMBO J. 8, 1989, cc.1369-1375.

Понятие «ингибирование фосфорилирования IGF-IR» относится к ингибированию, которое выявляют с помощью клеточного анализа фосфорилирования с использованием клеток линии 3Т3, экспрессирующих по 400000-600000 молекул IGF-IR на клетку в среде, содержащей 0,5% инактивированной тепловой обработкой фетальной телячьей сыворотки (FCS), при сравнении с результатами такого анализа без присутствия антитела. Фосфорилирование обнаруживают методом Вестерн-блоттинга с использованием антитела, специфического в отношении белков с фосфорилированным остатком тирозина. Такой анализ описан в примере 11. Тепловую инактивацию FCS осуществляют путем кратковременного нагрева до 56°C с целью инактивации системы комплемента.

Понятие «ингибирование фосфорилирования протеинкиназы В (РKВ)» относится к ингибированию, которое выявляют с помощью клеточного анализа фосфорилирования с использованием клеток линии 3Т3, экспрессирующих по 400000-600000 молекул IGF-IR на клетку в среде, содержащей 0,5% инактивированной тепловой обработкой фетальной телячьей сыворотки (FCS), при сравнении с результатами такого анализа без присутствия антитела. Фосфорилирование обнаруживают методом Вестерн-блоттинга с использованием антитела, специфического в отношении РKВ, фосфорилированной на остатке серина в положении 473 РКВ (Akt 1, Swiss Prot Асе. No. P31749). Такой анализ описан в примере 11.

Понятие «антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC)» относится к лизису человеческих опухолевых клеток-мишеней с помощью антитела, предлагаемого в изобретении, в присутствии эффекторных клеток. ADCC предпочтительно измеряют путем обработки препарата клеток, которые экспрессируют IGF-IR, антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) или очищенные эффекторные клетки из лейкоцитных пленок, такие как моноциты или NK-клетки (естественные клетки-киллеры).

Понятие «полное ингибирование опосредуемой IGF-I трансдукции сигнала» относится к ингибированию опосредуемого IGF-I фосфорилирования IGF-IR. В таком анализе клетки, экспрессирующие IGF, предпочтительно клетки линии Н322М, стимулируют IGF-I и обрабатывают антителом, предлагаемым в изобретении (можно применять антитело в концентрации 5нМ или более). Затем осуществляют ДСН-ПААГ и измеряют фосфорилирование IGF-IR методом Вестерн-блоттинга с использованием антитела, специфического в отношении фосфорилированного остатка тирозина. Считается, что имеет место полное ингибирование трансдукции сигнала, если на Вестерн-блоте визуально нельзя обнаружить полосы, соответствующей фосфорилированному IGF-IR.

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно обладают способностью связываться с тем же самым эпитопом IGF-IR, что и антитело 18, или имеет место ингибирование их связывания с IGF-IR вследствие стерической помехи, обусловленной связыванием с антителом 18. Ингибирование связывания можно обнаруживать с помощью SPR-анализа с использованием иммобилизованного антитела 18 и IGF-IR в концентрации 20-50 нМ и антитела, подлежащего обнаружению, в концентрации 100 нМ. Уменьшение сигнала на 50% или более означает, что антитело конкурирует с антителом 18. Такой анализ можно осуществлять аналогичным образом с использованием антитела 22 в качестве иммобилизованного антитела.

Понятие «эпитоп» обозначает белковую детерминанту, обладающую способностью специфически связываться с антителом. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных расположенных на поверхности групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и, как правило, имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические характеристики зарядов. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с эпитопами первого, но не второго типа, нарушается в присутствии денатурирующих растворителей.

Антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют фосфорилирование тирозина IGF-IR и предпочтительно также фосфорилирование тирозина РKB в близкой степени.

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно осуществляют понижающую регуляцию уровня белка IGF-IR в опухолевых клетках и в опухолях, например в ксенотрансплантированных опухолях.

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно ингибируют трехмерное разрастание опухолевых клеток в анализе образования колоний, а также пролиферацию клеток, экспрессирующих IGF-IR (например, клеток линии NIH 3Т3).

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно не ингибируют связывание инсулина с рецептором инсулина в анализе конкурентного связывания на клетках линии 3Т3, сверхэкспрессирующих рецептор инсулина, в концентрации 200 нмолей/л.

Антитела, предлагаемые в изобретении, получают методом рекомбинации в СНО-клетках, где происходит полное фукозилирование антитела. Для осуществления экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в таких СНО-клетках и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса).

Пригодные СНО-клетки-хозяева можно получать с помощью метода, заключающегося в том, что культивируют СНО-клетки, трансфектированные нуклеиновой кислотой, которая кодирует антитело, предлагаемое в изобретении, в условиях давления отбора с использованием DHFR, отбирают отдельные клоны, размножают клоны и отбирают клон, продуцирующий антитело, имеющее схему гликозилирования, предлагаемую в изобретении. Предпочтительно культивирование осуществляют в течение по меньшей мере двух, предпочтительно по меньшей мере трех недель. СНО-клетка предпочтительно представляет собой клетку линии DG44.

Понятие «СНО-клетка» относится к различным формам клеток яичника китайского хомячка (СНО), основанных на двух неактивных, предпочтительно уделенных путем делеции аллелях dhfr (дефицит дигидрофолатредуктазы (dhfr^-)). Такие dhfr^--клетки и методы их получения описаны, например, у Urlaub G. И др., Cell 33, 1983, cc.405-412; Chasm L. и др., Som. Cell Molec. Genet. 12, 1986, cc.555-556; Kolkekar A.S. и др., Biochemistry 36, 1997, cc.10901-10909. Предпочтительно клетка представляет собой клетку линии DG44. Такие dhfr^--клетки СНО можно получать с использованием гамма-излучения для удаления всего локуса dhfr. В клетках дикого типа, не имеющих мутацию, dhfr является ферментом, необходимым для