Композиции и способы, включающие варианты микробных протеаз

Композиции и способы, включающие варианты микробных протеаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение предоставляет варианты субтилизинов и композиции, включающие, по меньшей мере, один вариант субтилизина, представленный в настоящей заявке, а также способы применения указанных вариантов и композиций.

Уровень техники

Сериновые протеазы представляют собой подгруппу карбонилгидролаз, включающих обширный класс ферментов, обладающих широкой специфичностью и целым спектром биологических функций. В отношении субтилизинов проводили много исследований, что в значительной степени обусловлено их ценностью в производстве моющих средств и продуктов питания. Дополнительная работа была сосредоточена на неблагоприятных экологических условиях (например, на воздействии окислительных агентов, хелатирующих агентов, экстремальных температуры и/или уровней pH), которые могут неблагоприятно воздействовать на функциональные возможности данных ферментов в различных областях применения. Тем не менее, в уровне техники сохраняется потребность в ферментных системах, которые обладают устойчивостью к указанным неблагоприятным условиям и сохраняют исходную или имеют повышенную активность по сравнению с ферментными системами, известными в уровне техники на настоящий момент.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает варианты субтилизинов и композиции, включающие, по меньшей мере, один вариант субтилизина, представленный в настоящей заявке, а также способы применения указанных вариантов и композиций. В частности, настоящее изобретение обеспечивает различные протеазы, подходящие для производства стирально-моющих средств.

Настоящее изобретение обеспечивает варианты субтилизина, включающие, по меньшей мере, одну модификацию, где, по меньшей мере, одна модификация выбрана из G100C, S101D, S101H, Q103D, M124G, L126G, S132H, S161N, Q275Z и/или, по меньшей мере, из одного набора модификаций, выбранного из

где положения соответствуют положениям субтилизина BPN' SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также обеспечивает варианты субтилизина, включающие, по меньшей мере, один набор модификаций, где указанный набор модификаций выбран из:

где положения соответствуют положениям субтилизина BPN' SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также обеспечивает варианты субтилизина, включающие, по меньшей мере, один набор модификаций, где указанный набор модификаций выбран из:

где положения соответствуют положениям субтилизина BPN' SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также обеспечивает варианты субтилизина, включающие, по меньшей мере, один набор модификаций, где указанный набор модификаций выбран из:

где положения соответствуют положениям субтилизина BPN' SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также обеспечивает варианты субтилизина, включающие замену Y217L и дополнительно, по меньшей мере, любой один набор из наборов модификаций, представленных выше, где положения соответствуют положениям субтилизина BPN' SEQ ID NO:2. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает варианты субтилизина, включающие замены G97A/G128A/Y217Q, а также включающие, по меньшей мере, любую одну модификацию из наборов модификаций, представленных в настоящей заявке, где положения соответствуют положениям субтилизина BPN' SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также обеспечивает чистящие композиции, включающие, по меньшей мере, один вариант субтилизина, представленный в настоящей заявке. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления чистящая композиция является стиральным моющим средством. В некоторых особо предпочтительных вариантах осуществления стиральное моющее средство является мощным жидким стиральным моющим средством. В некоторых альтернативных вариантах осуществления чистящая композиция является средством для мытья посуды. В некоторых других вариантах осуществления чистящие композиции дополнительно включают один или несколько дополнительных ферментов или производных фермента, выбранных из группы, состоящей из гемицеллюлаз, пероксидаз, протеаз, целлюлаз, ксиланаз, липаз, фосфолипаз, эстераз, кутиназ, пектиназ, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, липоксигеназ, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, маланаз, β-глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы и амилаз или их смесей. В некоторых других вариантах осуществления чистящие композиции дополнительно включают, по меньшей мере, один стабилизатор. В некоторых дополнительных вариантах осуществления чистящие композиции включают, по меньшей мере, 0,0001 вес.%, по меньшей мере, любого одного из вариантов субтилизина, представленных в настоящей заявке, и необязательно, по меньшей мере, один подходящий дополнительный компонент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены способы очистки, где способ включает этапы: контакта поверхности и/или изделия, включающего ткань, по меньшей мере, с одной из чистящих композиций, представленных в настоящей заявке, и необязательно мытья и/или промывания поверхности или изделия.

Настоящее изобретение также обеспечивает корма для животных, включающие, по меньшей мере, один вариант субтилизина, представленный в настоящей заявке, а также композиции для обработки продукта питания, включающие, по меньшей мере, один вариант субтилизина, представленный в настоящей заявке.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана диаграмма, иллюстрирующая способ, применяемый для получения делеций и вставок внутри рамки считывания. Была создана библиотека, в которой 33% клонов имело замены; 33% клонов имело вставки и 33% клонов имело делеции.

Фиг. 2A представляет схему плазмиды pAC-FNA10. Элементы плазмиды являются следующими: pUB110=фрагмент ДНК из плазмиды pUB110 (McKenzie et al., Plasmid 15:93-103 [1986]), pBR322=фрагмент ДНК из плазмиды pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113 [1977]), pC194=фрагмент ДНК из плазмиды pC194 (Horinouchi and Weisblum, J. Bacteriol 150:815-825 [1982]).

На фиг. 2B приведена схема pHPLT-FNA.

На фиг. 2C приведена схема pHPLT-BPN. Вектор pHPLT содержит LAT-промотор (PLAT), последовательность, кодирующую сигнальный пептид LAT (preLAT). Сайт начала репликации и neoR получены из плазмиды pUB110.

Описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает варианты субтилизинов и композиции, включающие, по меньшей мере, один вариант субтилизина, представленный в настоящей заявке, а также способы применения указанных вариантов и композиций. Модификация протеаз-предшественников согласно изобретению в целях получения соответствующих вариантов субтилизинов включает, по меньшей мере, одну замену, по меньшей мере, одну делецию или, по меньшей мере, одну вставку. В некоторых вариантах осуществления модификация включает комбинацию мутаций. Например, в некоторых вариантах осуществления модификация включает комбинацию, по меньшей мере, одной замены и, по меньшей мере, одной делеции. В некоторых других вариантах осуществления модификация включает комбинацию, по меньшей мере, одной замены и, по меньшей мере, одной вставки. В некоторых дальнейших вариантах осуществления модификация включает комбинацию, по меньшей мере, одной делеции и, по меньшей мере, одной вставки. В других вариантах осуществления модификация включает комбинацию, по меньшей мере, одной замены, по меньшей мере, одной делеции и, по меньшей мере, одной вставки.

В уровне техники известно несколько подходящих способов получения модифицированных полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению, включающих, помимо прочего, сайт-насыщающий мутагенез, сканирующий мутагенез, инсерционный мутагенез, делеционный мутагенез, случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и направленную эволюцию, а также различные другие рекомбинационные методы. Обычно применяемые способы включают ДНК-перетасовку (см. Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 25:10747-51 [1994]), способы, основанные на негомологичной рекомбинации генов (например, ITCHY) (Ostermeier et al., Bioorg Med Chem. 7:2139-44 [1999]), SCRACHY (Lutz et al. Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-53 [2001]), SHIPREC (Sieber et al., Nat Biotechnol., 19:456-60 [2001]) и NRR (Bittker et al., Nat Biotechnol., 20:1024-9 [2001]; Bittker et al., Proc Natl Acad Sci. USA 101:7011-6 [2004]), а также способы, основанные на использовании олигонуклеотидов для вставки случайных и специфических мутаций, делеций и/или вставок (Ness et al., Nat Biotechnol. 20:1251-5 [2002]; Coco et al., Nat Biotechnol., 20:1246-50 [2002]; Zha et al., Chembiochem. 3:34-9 [2003], Glaser et al., J Immunol., 149:3903-13 [1992], Sondek and Shortle, Proc Natl Acad Sci USA 89:3581-5 [1992], Yanez et al., Nucleic Acids Res., 32:el58 [2004], Osuna et al., Nucleic Acids Res., 32:el36 [2004], Gaytan et al., Nucleic Acids Res., 29:E9 [2001] и Gaytan et al., Nucleic Acids Res., 30:e84 [2002]).

В некоторых вариантах осуществления родительский полноразмерный полинуклеотид лигирован в соответствующую экспрессионную плазмиду, а затем способ мутагенеза применяется для упрощения конструирования модифицированной протеазы по настоящему изобретению, хотя могут применяться другие способы. Способ основан на методе, описанном Pisarchik et al. (Pisarchik et al., Prot. Eng. Des. Select, 20:257-265 [2007]). В некоторых вариантах осуществления обеспечивается дополнительное преимущество, состоящее в том, что рестриктаза, которая применяется в настоящей заявке, производит расщепление вне своей последовательности узнавания, что позволяет провести рестрикцию фактически любой нуклеотидной последовательности и избежать образования разреза в сайте рестрикции. Сначала, как описано в настоящей заявке, получают и секвенируют природный ген, кодирующий полноразмерную протеазу, который затем сканируют с поиском одной или более точек, в которых требуется сделать мутацию (делецию, вставку, замену или их комбинацию) одной или более аминокислот. Мутацию гена с целью такого изменения его последовательности, чтобы она соответствовала требуемой последовательности, выполняют с помощью удлинения праймера в соответствии с общеизвестными методами. Фрагменты слева и справа от целевой точки (точек) мутации амплифицируются с помощью ПЦР и включают сайт рестрикции Eam1104I. Левый и правый фрагменты расщепляют с использованием Eam1104I, получая некоторое количество фрагментов, имеющих комплементарные липкие концы длиной три нуклеотида, которые затем объединяют и лигируют с получением библиотеки модифицированных последовательностей, содержащих одну или более мутаций. Данный способ позволяет избежать возникновения мутаций со сдвигом рамки считывания. Кроме того, данный способ упрощает процесс мутагенеза, поскольку все синтетические олигонуклеотиды могут иметь один и тот же сайт рестрикции, и поэтому для создания сайтов рестрикции не потребуются синтетические линкеры, как это необходимо в некоторых других способах.

Композиции

Настоящее изобретение обеспечивает варианты протеаз и композиции, включающие, по меньшей мере, один из вариантов субтилизинов, представленных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы получения протеазы с различными коммерческими назначениями, в которых требуется расщепление или синтез полипептидов, включая чистящие композиции, а также пищевые компоненты, обработку ткани, отделку кожи, переработку зерна, переработку мяса, переработку продуктов питания, получение белковых гидролизатов, средств, способствующих пищеварению, бактерицидных композиций, бактериостатических композиций, фунгистатических композиций и средств для личной гигиены (например, для ухода за полостью рта, для ухода за волосами и/или для ухода за кожей).

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает ферментные композиции, обладающие сопоставимой или улучшенной моющей эффективностью, по сравнению с применяемыми на настоящий момент субтилизиновыми протеазами.

Чистящие композиции

Чистящая композиция по настоящему изобретению предпочтительно применяется, например, в области стирки. Фактически, благодаря уникальным преимуществам, связанным с повышенной эффективностью в растворах с более низкой температурой, ферменты по настоящему изобретению идеально подходят для применения в стирке. Кроме того, ферменты по настоящему изобретению могут применяться как в гранулированных, так и в жидких композициях.

Варианты протеаз по настоящему изобретению также находят применение в стирально-моющих добавках. В некоторых вариантах осуществления применяется низкотемпературный чистящий раствор. Добавка, в наиболее простой форме, может являться одной или несколькими протеазами. В некоторых вариантах осуществления добавка упакована в дозированной форме для добавления в процессе чистки. Любая подходящая разовая дозированная форма также может применяться согласно настоящему изобретению, включая, помимо прочего, гранулы, таблетки, желатиновые капсулы или другие разовые дозированные формы, такие как дозированные порошки или жидкости. В некоторых вариантах осуществления включен наполнитель(и) или носитель(и), увеличивающие объем такой композиции. Подходящий наполнитель или носитель включают, помимо прочего, различные соли, например, сульфат, карбонат и силикат, а также тальк, глину и т.п. Подходящий наполнитель или носитель в случае жидких композиций включает, помимо прочего, воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, включая полиолы и диолы. Примеры таких спиртов включают, помимо прочих, метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат приблизительно от 5% до приблизительно 90% подобных материалов. Кислотные наполнители могут применяться для снижения pH. В альтернативе чистящая добавка включает дополнительные компоненты, как более подробно описано ниже.

Настоящие чистящие композиции и чистящие добавки требуют эффективного количества, по меньшей мере, одного из вариантов протеаз, представленных в настоящей заявке, отдельно или в комбинации с другими протеазами и/или дополнительными ферментами. Необходимый уровень фермента достигают путем добавления одного или нескольких вариантов протеаз по настоящему изобретению. Обычно настоящие чистящие композиции включают, по меньшей мере, приблизительно 0,0001 вес.%, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1, от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,5 или даже от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 вес.%, по меньшей мере, одного из вариантов протеаз по настоящему изобретению.

Чистящие композиции, описанные в настоящей заявке, обычно составлены так, что в процессе применения в операциях по очистке в воде моечная вода имеет pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5 или даже от приблизительно 7,5 до приблизительно 10,5. Состав жидких средств обычно подобран так, что они в чистом виде имеют pH от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0 или даже от приблизительно 3 до приблизительно 5. Гранулированные средства для стирки обычно имеют такой состав, что их pH составляет от приблизительно 9 до приблизительно 11. Способы регулирования pH на рекомендованных практических уровнях включают применение буферов, щелочей, кислот и т.д. и известны специалистам, квалифицированным в данной области.

Подходящие чистящие композиции с низким pH в чистом виде обычно имеют pH от приблизительно 3 до приблизительно 5, и обычно не содержат поверхностно-активных веществ, которые подвергаются гидролизу в среде с таким pH. Подобные поверхностно-активные вещества включают поверхностно-активные вещества из группы алкилсульфатов натрия, которые включают, по меньшей мере, одну этиленоксидную группу или даже от приблизительно от 1 до приблизительно 16 молей этилоксида. Такие чистящие композиции обычно включают достаточное количество модификатора pH, такого как гидроксид натрия, моноэтаноламин или хлороводородная кислота, с получением такой чистящей композиции, которая в чистом виде имеет pH от приблизительно 3 до приблизительно 5. Такие композиции обычно включают, по меньшей мере, один кислотоустойчивый фермент. В некоторых вариантах осуществления композиции представляют собой жидкости, тогда как в других вариантах осуществления они представляют собой твердые вещества. Уровень pH таких жидких композиций обычно измеряется как pH в чистом виде. Уровень pH таких твердых композиций измеряется как pH 10%-го раствора твердых веществ указанной композиции, где растворителем является дистиллированная вода. В данных вариантах осуществления все измерения pH проводят при 20°C.

В некоторых вариантах осуществления, когда вариант протеазы (протеаз) применяется в гранулированной композиции или жидкости, предпочтительно, чтобы вариант протеазы находился в форме инкапсулированной частицы, чтобы защитить вариант протеазы от других компонентов гранулированной композиции при хранении. Кроме того, инкапсулирование также является способом регулирования доступности варианта протеазы в процессе чистки. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирование увеличивает эффективность варианта протеазы (протеаз) и/или дополнительных ферментов. В этой связи варианты протеаз по настоящему изобретению инкапсулированы с использованием любого подходящего инкапсулирующего материала, известного в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал обычно инкапсулирует, по меньшей мере, часть катализатора для варианта протеазы (протеаз) по настоящему изобретению. Как правило, инкапсулирующий материал растворим в воде и/или является диспергируемым в воде. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал имеет температуру стеклования (Тс) 0°C или выше. Температура стеклования более подробно описана в WO 97/11151. Инкапсулирующий материал выбран из группы, состоящей из углеводов, природных или синтетических смол, хитина, хитозана, целлюлозы и производных целлюлозы, силикатов, фосфатов, боратов, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, твердых парафинов и их комбинаций. В случае, когда инкапсулирующим материалом является углевод, он обычно выбран из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинаций. Как правило, инкапсулирующим материалом является крахмал. Подходящие крахмалы описаны в EP 0922499; US 4977252; US 5354559 и US 5935826. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующим материалом является микросфера, изготовленная из пластмассы, такой как термопласты, акрилонитрил, метакрилонитрил, полиакрилонитрил, полиметакрилонитрил и их смеси; коммерчески доступные микросферы, которые могут применяться, включают микросферы EXPANCEL^® (Stockviksverken, Sweden) и PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES^®, LUXSIL^®, Q-CEL^®, а также SPHERICEL^® (PQ Corp., Valley Forge, PA).

Как описано в настоящей заявке, варианты протеаз по настоящему изобретению находят конкретное применение в стирально-моющих средствах. В данных областях применения ферменты находятся в условиях воздействий различных внешних факторов. Варианты протеаз по настоящему изобретению предоставляют преимущества по сравнению со многими ферментами, используемыми в настоящее время, благодаря своей стабильности в различных условиях.

Фактически существуют различные условия стирки или мойки, включающие различные составы моющих средств, объемы моечной воды, температуры моечной воды и продолжительность стирки или мойки, воздействию которых подвергаются протеазы, применяемые в стирке или мойке. Кроме того, моющие составы, используемые в различных географических районах, имеют различные концентрации соответствующих компонентов, которые присутствуют в моечной воде. Например, европейское моющее средство обычно содержит приблизительно 4500-5000 м.д. моющих компонентов в моечной воде, в то время как японское моющее средство обычно содержит приблизительно 667 м.д. моющих компонентов в моечной воде. В Северной Америке, в особенности в Соединенных Штатах, моющие средства обычно содержат приблизительно 975 м.д. компонентов моющих средств в моечной воде.

Система с низкой концентрацией моющего средства включает моющие средства, где менее чем приблизительно 800 м.д. моющих компонентов присутствуют в моечной воде. Японские моющие средства обычно считаются системой с низкой концентрацией моющего средства, поскольку они содержат в моечной воде приблизительно 667 м.д. компонентов моющих средств.

Моющие средства средней концентрации включают моющие средства, где в моечной воде присутствует от приблизительно 800 м.д. до приблизительно 2000 м.д. компонентов моющих средств. Североамериканские моющие средства обычно считаются системами со средней концентрацией моющих средств, поскольку они содержат приблизительно 975 м.д. компонентов моющих средств в моечной воде. В Бразилии в моечной воде обычно содержится приблизительно 1500 м.д. компонентов моющих средств.

Система с высокой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где в моечной воде присутствует более чем приблизительно 2000 м.д. компонентов моющих средств. Европейские моющие средства обычно считаются системами с высокой концентрацией моющих средств, поскольку в моечной воде они содержат приблизительно 4500-5000 м.д. компонентов моющих средств.

Латиноамериканские моющие средства обычно являются сильнопенящимися моющими средствами на фосфатной основе, при этом ассортимент моющих средств, используемых в Латинской Америке, может включать моющие средства средних и высоких концентраций, поскольку они различаются по содержанию компонентов моющих средств в моечной воде от 1500 м.д. до 6000 м.д. Как указано выше, в Бразилии моечная вода обычно содержит приблизительно 1500 м.д. компонентов моющих средств. Впрочем, в других географических районах, не ограниченных другими латиноамериканскими странами, сильнопенящееся моющее средство на фосфатной основе может включать системы с высокой концентрацией моющих средств, составляющей до приблизительно 6000 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в моечной воде.

С учетом вышеизложенного очевидно, что концентрации моющих композиций в обычных моечных растворах во всем мире варьируют от менее чем приблизительно 800 м.д. моющей композиции ("географические районы с низкой концентрацией моющих средств"), например, приблизительно 667 м.д. в Японии, до приблизительно 800-2000 м.д. ("географические районы со средней концентрацией моющих средств"), например, приблизительно 975 м.д. в США и приблизительно 1500 м.д. в Бразилии и более чем приблизительно до 2000 м.д. ("географические районы с высокой концентрацией моющих средств"), например, приблизительно от 4500 м.д. до приблизительно 5000 м.д. в Европе и приблизительно 6000 м.д. в географических районах, где используются сильнопенящиеся моющие средства на фосфатной основе.

Концентрации обычного моечного раствора определяют эмпирически. Например, в США обычная стиральная машина вмещает объем приблизительно 64,4 л моечного раствора. Соответственно, чтобы в моечном растворе получить концентрацию приблизительно 975 м.д. моющего средства, в 64,4 л моечного раствора требуется добавить приблизительно 62,79 г моющей композиции. Указанное количество является стандартным количеством, дозируемым в моечную воду потребителем с помощью мерного стаканчика, поставляемого с моющим средством.

В качестве следующего примера, в различных географических районах используют различные моечные температуры. Температура моечной воды в Японии обычно ниже используемой в Европе. Например, температура моечной воды в Северной Америке и Японии обычно составляет 10-30°C (например, приблизительно 20°C), тогда как температура моечной воды в Европе обычно составляет 30-60°C (например, приблизительно 40°C).

В качестве другого примера, в различных географических районах вода обычно имеет разную жесткость. Жесткость воды обычно описывается в гранах на галлон смеси Ca²⁺/Mg²⁺. Жесткость является мерой количества кальция (Ca²⁺) и магния (Mg²⁺) в воде. Большая часть воды в Соединенных Штатах является жесткой, но степень жесткости изменяется. Вода от умеренно жесткой (60-120 м.д.) до жесткой (121-181 м.д.) содержит 60-181 миллионных долей (миллионные доли преобразуются в граны на американский галлон - число м.д., деленное на 17,1, равно гранам на галлон) минеральных солей жесткости.

Вода	Гранов на галлон	Миллионных долей
Мягкая	менее 1,0	менее 17
Слегка жесткая	1,0-3,5	17-60
Умеренно жесткая	3,5-7,0	60-120
Жесткая	7,0-10,5	120-180
Очень жесткая	более 10,5	более 180

Жесткость европейской воды обычно превышает 10,5 (например, 10,5-20,0) гранов на галлон смеси Ca²⁺/Mg²⁺ (например, приблизительно 15 гранов на галлон смеси Ca²⁺/Mg²⁺). Жесткость североамериканской воды обычно выше, чем жесткость японской воды, но меньше, чем жесткость европейской воды. Например, жесткость североамериканской воды может составлять 3-10 гранов, 3-8 гранов или приблизительно 6 гранов. Жесткость японской воды обычно ниже, чем жесткость североамериканской воды, и обычно меньше 4 и равна, например, 3 гранам на галлон смеси Ca²⁺/Mg²⁺.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает различные протеазы, которые демонстрируют неожиданно эффективное моющее действие, по меньшей мере, в одном наборе условий (например, температура воды, жесткость воды и/или концентрация моющего средства). В некоторых вариантах осуществления варианты протеаз по настоящему изобретению сопоставимы по эффективности моющего действия с другими субтилизиновыми протеазами. В некоторых вариантах осуществления варианты протеаз по настоящему изобретению демонстрируют повышенную эффективность моющего действия по сравнению с субтилизиновыми протеазами, коммерчески доступными в настоящее время. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения варианты протеаз, представленные в настоящей заявке, демонстрируют повышенную устойчивость к окислению, повышенную термическую устойчивость и/или повышенную устойчивость к комплексонам. Кроме того, варианты протеаз по настоящему изобретению находят применение в чистящих композициях, которые не включают моющих средств, либо отдельно, либо в комбинации с основными компонентами и стабилизаторами.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции включают, по меньшей мере, один вариант протеазы по настоящему изобретению на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% по весу композиции и прочие компоненты (например, составляющие от приблизительно 99,999% до приблизительно 90,0% по весу композиции), включающие вспомогательные чистящие материалы. В других аспектах настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению включают, по меньшей мере, один вариант протеазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% по весу композиции, а также прочие компоненты чистящей композиции (например, составляющие от приблизительно 99,9999% до приблизительно 90,0%, от приблизительно 99,999% до приблизительно 98%, от приблизительно 99,995% до приблизительно 99,5% по весу), включающие вспомогательные чистящие материалы.

В некоторых вариантах осуществления предпочтительные чистящие композиции включают один или более дополнительных ферментов или производных фермента, которые обеспечивают эффективность чистки и/или эффекты ухода за тканью, в дополнение к одному или нескольким вариантам протеаз, представленным в настоящей заявке. Такие ферменты включают, помимо прочих, другие протеазы, липазы, кутиназы, амилазы, целлюлазы, пероксидазы, оксидазы (например, лакказы) и/или маннаназы.

В композициях по настоящему изобретению может применяться любая другая подходящая протеаза. Подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления применяются микробные протеазы. В некоторые варианты осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления протеаза является сериновой протеазой, предпочтительно микробной щелочной протеазой или трипсиноподобной протеазой. Примеры щелочных протеаз включают субтилизины, в особенности субтилизины, полученные из Bacillus (например, субтилизин, lentus, amyloliquefaciens, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168). Дополнительные примеры включают мутантные протеазы, описанные в патентах США RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, которые включены в настоящую заявку путем отсылки. Дополнительные примеры протеаз включают, помимо прочего, трипсин (например, свиной или бычий) и протеазу Fusarium, описанную в WO 89/06270. Предпочтительные коммерчески доступные ферменты протеазы включают MAXATASE^®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN^®, OPTIMASE^®, PROPERASE^®, PURAFECT^® и PURAFECT^® OXP (Genencor); ALCALASE^®, SAVINASE^®, PRIMASE^®, DURAZYM™, RELASE^® и ESPERASE^® (Novozymes) и BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany). Варианты протеаз описаны в WO 95/23221, WO 92/21760 и патентах США 5801039, 5340735, 5500364, 5855625, US RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, а также в других патентах.

Кроме того, в настоящем изобретении находит применение любая подходящая липаза. Подходящие липазы включают, помимо прочих, липазы бактериального или грибкового происхождения. В настоящее изобретение включены химически или генетически модифицированные мутанты. Примеры полезных липаз включают липазу Humicola lanuginosa (см., например, EP 258068 и EP 305216), липазу Rhizomucor miehei (см., например, EP 238023), липазу Candida, такую как липаза C. antarctica (например, липаза C. antarctica A или B; см., например, EP 214761), липазу Pseudomonas, такую как липаза P. alcaligenes и P. pseudoalcaligenes (см., например, EP 218272), липазу P. cepacia (см., например, EP 331376), липазу P. stutzeri (см., например, GB 1372034), липазу P. fluorescens, липазу Bacillus (например, липазу B. subtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); липазу B. stearothermophilus [см. например, JP 64/744992] и липазу B. pumilus [см. например, WO 91/16422]).

Кроме того, ряд клонированных липаз находит применение в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включая, помимо прочих, липазу Penicillium camembertii (см., Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), липазу Geotricum candidum (см., Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]), а также различные липазы Rhizopus, например, липаза R. delemar (см., Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), липаза R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) и липаза R. oryzae.

Другие типы липолитических ферментов, таких как кутиназы, также находят применение в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включая, помимо прочего, кутиназу, полученную из Pseudomonas mendocina (см. WO 88/09367), и кутиназу, полученную из Fusarium solani pisi (см. WO 90/09446).

Дополнительные подходящие липазы включают коммерчески доступные липазы, такие как M1 LIPASE™, LUMA FAST™ и LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE® и LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); а также LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japan).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают липазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной липазы по весу композиции, а также прочие компоненты, включающие вспомогательные чистящие материалы, от веса композиции. В других аспектах настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают липазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% липазы от веса композиции.

Любая амилаза (альфа и/или бета), подходящая для применения в щелочных растворах, также находит применение в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения. Подходящие амилазы включают, помимо прочего, амилазы бактериального или грибкового происхождения. В некоторые варианты осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, помимо прочих, α-амилазы, полученные из B. licheniformis (см., например, GB 1296839). Коммерчески доступные амилазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, помимо прочих, DURAMYL^®, TERMAMYL^®, FUNGAMYL^® и BAN™ (Novozymes), а также RAPIDASE^® и MAXAMYL^® P (Genencor).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают амилазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной амилазы по весу композиции, а также прочие компоненты, включающие вспомогательные чистящие материалы, по весу композиции. В других аспектах настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают амилазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% амилазы по весу композиции.

В некоторых других вариантах осуществления в чистящих композициях по настоящему изобретению находит применение любая подходящая целлюлаза. Подходящие целлюлазы включают, помимо прочего, целлюлазы бактериального или грибкового происхождения. В некоторые варианты осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Подходящие целлюлазы включают, помимо прочего, целлюлазы Humicola insolens (см., например, патент США 4435307). Наиболее подходящими целлюлазами являются целлюлазы, которые обеспечивают эффект сохранения цвета (см., например, EP 0495257). Коммерчески доступные целлюлазы, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, помимо прочих, CELLUZYME^® (Novozymes) и KAC-500(B)™ (Kao Corporation). В некоторых вариантах осуществления целлюлазы включены как части или фрагменты зрелого белка дикого типа или варианта целлюлаз, в которых удалена N-концевая часть (см., например, патент США 5874276). В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают целлюлазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной целлюлазы по весу композиции, а также прочие компоненты, включающие вспомогательные чистящие материалы, по весу композиции. В других аспектах настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают целлюлазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% целлюлазы по весу композиции.

Любая маннаназа, подходящая для применения в моющих композициях, также находит применение в настоящем изобретении. Подходящие маннаназы включают, помимо прочих, маннаназы бактериального или грибкового происхождения. В некоторые варианты осуществления включены химически или генетически модифицированные мутанты. Известны различные маннаназы, которые находят применение в настоящем изобретении (см., например, патент США 6566114, патент США 6602842 и патент США 6440991, которые включены в настоящую заявку путем отсылки). В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции по настоящему изобретению дополнительно включают маннаназы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной маннаназы по весу композиции, а также прочие компоненты, включающие вспомогательные чистящие материалы, по весу композиции. В других аспектах настоящего изобретения чистящие композиции по настоящему изобретению также включают маннаназы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% маннаназы по весу композиции.

В некоторых вариантах осуществления в композициях по настоящему изобретению пероксидазы применяются в комбинации с перекисью водорода или ее источником (например, перкарбонатом, перборатом или персульфатом). В некоторых альтернативных вариантах осуществления оксидазы применяются