Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа ii в сочетании с активным агентом анти- bcl-2

Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа ii в сочетании с активным агентом анти- bcl-2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению антител анти-СD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего опухолей, экспрессирующих CD20, в комбинации с активным агентом анти-Всl-2.

Предпосылки создания изобретения

Белок CD20 (так называемый дифференцировочный антиген созревания В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с мол. массой приблизительно 35 кДа, локализованный в предшественниках В-клеток и в зрелых В лимфоцитах (Valentine M.A. и др., J. Biol. Chem., 264(19), 11282-11287 (1989) и Einfield D.A. и др., ЕМВО J. 7(3), 711-717 (1988)). CD20 найден на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется на ранней стадии развития предшественников В-клеток и сохраняется до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует в нормальных В-клетках, а также в злокачественных В-клетках. CD20 прежде всего экспрессируется в более 90% В-клеток лимфомы не-Ходжкина (НХЛ) (Anderson K.C. и др.. Blood, 63(6), 1424-1433 (1984)), но не обнаружен на кроветворных стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или на других нормальных тканях (Tedder T.F. и др., J, Immunol., 135 (2), 973-979 (1985)).

С-концевой фрагмент (содержащий 85 аминокислотных остатков) белка CD20 локализован в цитоплазме. Длина такого участка существенно отличается от размеров цитоплазматического участка других поверхностных белков В-клеток, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или α- или β-цепи антигенов гистосовметимости класса I1, которые характеризуются относительно короткими цитоплазматическими фрагментами, содержащими 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислотных остатков, соответственно (Komaromy M. и др., NAR, 11, 6775-6785 (1983)). В С-концевом фрагменте 21 из 61 аминокислотных остатков являются кислотными и только 2 основными, т.е. указанная область обладает суммарным высоким отрицательным зарядом (The GenBank рег.№NP-690605). Принято считать, что CD20 может принимать участие в регуляции ранней стадии (стадий) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder и др., Eur. J. Immunol., 25, 16, 881-887 (1986)) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder T.F. и др., J. Cell. Biochem., 14D, 195 (1990)).

Существует два различных типа антител анти-CD20, которые существенно отличаются по способу связывания с CD20 и по биологической активности (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)). Антитела типа I, ритуксимаб, обладают цитотоксичностью, опосредованной комплементом, в то время как антитела типа II, тоситумомаб (B1), 11B8 и АТ80 или гуманизированные антитела В-Lyl эффективно инициируют гибель клеток-мишеней за счет каспаза-независимого апоптоза с одновременным воздействием фосфатидилсерина.

Сводка общих свойств антител анти-CD20 типа I и типа II приводятся в Таблице 1.

Таблица 1
Свойства антител анти-СD20 типа I и типа II
антитела анти-CD20 типа I	антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
CD20 локализованы в липидномслое	CD20 не локализованы в липидномслое
Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)	Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)
АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)	АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)
Полная емкость связывания	Пониженная емкость связывания
Гомотипическая агрегация	Повышенная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза послесвязывания	Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Семейство белков Всl-2 регулирует программируемую гибель клеток, которая запускается стимуляторами эволюции и в ответ на многие стрессовые сигналы (Cory S. и Adams J.M., Nature Reviews Cancer, 2, 647-656 (2002), Adams, Genes und Development, 17, 2481-2495 (2003), Danial N.N. и Korsmeyer S.J., Cell, 116, 205-219 (2004)). В то время как выживание клеток промотируется белком Всl-2 и рядом его близких аналогов (Bcl-xL, Bcl-W, Mcl-1 и А1), которые содержат три или четыре консервативных участка (ВН) белка Всl-2, апоптоз контролируется двумя другими подсемействами белков. Первоначальный сигнал гибели клеток передается большой группой белков ВН3, включающей белки Bad, Bid, Bim, Puma и Noxa, которые содержат одни общий небольшой домен связывания ВНЗ (Huang и Strasser, Cell, 103, 839-842 (2000)). Однако, Вах или Bak, мультидоменные белки, содержащие ВН1-ВН3, необходимы только для коммитирования гибели клетки (Cheng и др. Molecular Cell, 8, 705-711 (2001), Wei M.C. и др., Science, 292, 727-730 (2001), Zong W.X. и др., Genes and Development, 15, 148, 1-1486 (2001)). При активации указанные белки делают внешнюю мембрану проницаемой для митохондрий и высвобождения проапоптогенных факторов (например, цитохрома С), необходимых для активации каспаз, которые разбирают клетку (Wang К., Genes and Development, 15, 2922-2933 (2001), Adams, 2003, см. выше. Green D.R. и Kroemer G., Science, 305, 626-629 (2004)).

Взаимодействие между этими тремя фракциями семейства Всl-2 определяет выживание или гибель клетки. Если, например, в ответ на повреждение ДНК активируются только белки ВН3, то они связываются доменом ВНЗ с бороздкой на белках-аналогах, обеспечивающих выживаемость клетки (Sattler и др., Science, 275, 983-986 (1997). Однако как белки ВН3 и Bcl-2-подобные белки контролируют активацию Вах и Bak, остается неясно (Adams, 2003, см. выше). Основное внимание уделяется белку Вах. Указанный растворимый мономерный белок (Hsu Y.T. и др., Journal of Biological Chemistry, 272, 13289-1 3834 (1997), Wolter K.G. и др., Journal of Cell Biology, 139, 1281-1292 (1997)) обычно содержит погруженный в бороздку мембранотропный домен, по-видимому ответственный за его локализацию в цитозоле (Nechushtan А. и др., ЕМВО Journal, 18, 2330-2341 (1999), Suzukm др., Cell, 103, 645-654 (2000), Schinzel А. и др., J. Cell Biol., 164, 1021-1032 (2004)). Предполагается, что активность ВАХ модулируется рядом других пептидов/белков (Lucken-Ardjomande S. и Martinou J.C., J. Cell Sci., 118, 473-483 (2005)), но их физиологическая функция остается неизвестной. В другом варианте Вах может активироваться за счет прямого стимулирования некоторыми белками ВН3 (Lucken-Ardjomande S. и Martinou J.C, 2005, см. выше), из которых наиболее описанной является укороченная форма белка Bid, tBid (Wei M.C. и др., Genes und Development, 14, 2060-2071 (2000), KuwanaT. и др., Cell, 111,331-342(2002), Roucou X. и др., Biochemical Journal, 368, 915-921 (2002), Cartron P.F. и др., Mol. Cell, 16, 807-818 (2004)). Как указано в литературе (Adams, 2003, см. выше), наиболее распространенная модель, согласно которой Всl-2 непосредственно стимулирует Вах (Oltvai Z.N. и др., Cell, 74, 609-619 (1993)), становится проблематичной, поскольку Всl-2 связан с мембраной, а Вах локализован в цитозоле, и их взаимодействие в существенной степени зависит от детергентов, которые используются для лизиса клеток (Hsu Y.T. и Youle, 1997, см. выше). Тем не менее установлено, что домен ВН3 белка Вах может непосредственно ассоциироваться с белком Всl-2 (Zha H. и Reed J., Journal of Biological Chemistry, 272, 31482-3188 (1997), Wang К. др., Molecular und Cellular Biology, 8, 6083-6089 (1998)) и что Bcl-2 предотвращает олигомеризацию Вах, хотя при этом не удается детектировать присутствие гетеродимеров (Михайлов В. и др. Journal of Biological Chemistry, 276, 18361-18374 (2001)). Таким образом, возможность блокирования белками, обеспечивающими выживание клеток, активации белка Вах непосредственно или опосредовано остается неизвестной.

Хотя Вах и Bak в большинстве случаев являются эквивалентными (Lindsten Т и др., Molecular Cell, 6, 1389-1399 (2000), Wei M.C. и др., 2001, см. выше), благодаря их определенной локализации в здоровых клетках следует ожидать, что они регулируются по совершенно различным механизмам. В отличие от Вах, который в основном локализован в цитозоле, Bak содержится в комплексах на внешней мембране митохондрий и на эндоплазматическом ретикулуме здоровых клеток (Wei M.C. и др., 2000, см. выше, Zong W.X. и др., Journal of Cell Biology, 162, 59-69 (2003)). Тем не менее при получении цитотоксичных сигналов Вах и Bak изменяют конформацию, и Вах переносится в мембраны органелл, где Вах и Bak образуют гомоолигомеры, которые могут ассоциироваться, приводя к нарушению проницаемости мембраны (Hsu Y.T. и др., PNAS, 94, 3668-3672 (1997), Wolter K.G. и др., 1997, см. выше, Antonsson В. и др.. Journal of Biological Chemistry, 276, 11615-11623 (2001), Nechushtan А. и др.. Journal of Cell Biology, 153, 1265-1276 (2001), Wei M.C. и др., 2001, см. выше, Михайлов В. и др.. Journal of Biological Chemistry, 278, 5367-5376 (2003)).

Существует ряд ингибиторов Bcl-2, которые обладают одинаковым свойством ингибировать белки семейства Bcl-2, обеспечивающие выживаемость клеток, благодаря которому они являются перспективными агентами для лечения рака. Такими ингибиторами Bcl-2 являются, например, облимерсен, SPC-2996, RTA-402, госсипол, AT-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллин, TP-TW-37, YC-137 и Z-24, и препараты, описанные, например, в статье Zhai D. и др.. Cell Death and Differentiation, 13, 1419-1421 (2006).

Статьи Smith M. R. и др.. Molecular Cancer Therapeutics, 3(12), 1693-1699 (2004) и Ramanarayanan J. и др., British Journal of Haematology, 127(5), 519-530 (2004) относятся к комбинации антител анти-CD20 типа I (ритуксимаб) с антисмысловыми олигонуклеотидами Всl-2 (облимерсен).

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с агентом, активным в отношении Всl-2.

Изобретение также включает применение антител анти-СП20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с агентом, активным в отношении Всl-2.

Предпочтительно указанный активный агент анти-Всl-2 является ингибитором Всl-2, который характеризуется величиной Ic₅₀ 5 мкМ или менее.

Предпочтительно соотношением связывающих активностей указанных антител анти-СD20 типа II и ритуксимаба с CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, более предпочтительно от 0,35 до 0,55 и наиболее предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Предпочтительно указанные антитела анти-СD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Lyl.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Предпочтительно указанный агент, активный в отношении Всl-2, выбирают из группы, включающей облимерсен, SPC-2996, RTA-402, госсипол, AT-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллин, TP-TW-37, YC-137 и Z-24, более предпочтительно из группы, включающей АВТ-263 и АВТ-737. Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, обозначает В-клеточную лимфому не-Ходжкина В-клеток (ЛНХ).

Подробное описание изобретения

Термин "антитела" обозначает различные формы антител, включающих, но, не ограничиваясь только ими, полноразмерные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генно-инженерные антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител при условии сохранения их характерных свойств по изобретению.

Термины "моноклональные антитела" или "композиция моноклональных антител", используемые в описании заявки, относятся к получению молекул антител одного аминокислотного состава. Соответственно, термин "моноклональные антитела человека" относится к моноспецифичным антителам, содержащим вариабельные и константные области иммуноглобулинов линии зародышевых клеток человека. В одном варианте моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного (исключая человека), например, трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека и трансген легкой цепи иммуноглобулина человека, включенные в иммортализованные клетки.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами.

Термин "химерные антитела" обозначает моноклональные антитела, включающие вариабельную область, т.е. связывающий участок, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области от другого источника или вида, обычно полученные методом рекомбинантных ДНК. Более предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область антител мыши и константную область антител человека. Такие химерные антитела человека/мыши являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина мыши? и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. Другими формами " химерных антител" по настоящему изобретению являются такие антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен по сравнению с исходными антителами. Такие "химерные" антитела обозначаются также как "переключенные по классу антитела". Способы получения химерных антител включают метод рекомбинантных ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области техники. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), US 5202238 и US 5204244.

Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых каркасный участок или "участки комплементарности" (CDR) модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте CDR мыши прививают в каркасный участок антител человека для получения "гуманизированных антител". См., например, Riechmann L. и др., Nature, 332, 323-327 (1988) и Neuberger M.S. и др., Nature, 314, 268-270 (1985)). Более предпочтительные CDR представляют собой аминокислотные последовательности, узнающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Термин "антитела человека", используемый в описании заявки, включает антитела, содержащие вариабельную и константную области иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека. Антитела человека известны в данной области техники (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology, 5, 368-374 (2001)). С использованием такой технологии получают антитела человека, специфичные в отношении множества мишеней. Примеры антител человека, описаны, например, в статье Kellermann S.A., и др., Curr. Opin. BiotechnoL, 13, 593-597 (2002).

Термин "рекомбинантные антитела человека", используемый в описании заявки, обозначает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными методами, такие как антитела, выделенные из клеток хозяина, таких как клетки NSO или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат константные области, полученные из иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, хотя они получены из последовательностей VH и VL линии зародышевых клеток человека, не содержатся в нативном мотиве линии зародышевых клеток человека in vivo.

Термин "специфичное связывание" или "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает специфичное связывание антител с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания характеризуется величиной kd 10" мол/л или менее (например, 10' мол/л), предпочтительно величиной kd 10" мол/л или менее (например, 10' мол/л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом связывания, таким как анализ графика Скатчарда на клетках, экспрессирующих CD20.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в описании заявки, обозначает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Термин "константные домены" не имеет прямого отношения к связыванию антител с антигеном, а относится к эффекторным функциям (АЗКОЦ, связывание комплемента и КЗЦ).

Термин "вариабельная область" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемый в описании заявки, обозначает каждую легкую и тяжелую цепь, которая принимает непосредственное участие в связывании антител с антигеном. Домены вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи человека характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются строго консервативными, соединенные тремя "гипервариабельными областями" (или участками комплементарности, CDR). Каркасные участки образуют конформацию β-складчатого листа, а участки CDR образуют петли, связывающие β-складчатую структуру. В каждой цепи CDR сохраняют свою трехмерную структуру благодаря каркасным участкам и вместе с CDR другой цепи образуют антиген-связывающий участок. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи играют главную роль в специфичности связывания антитела по изобретению и, следовательно, представляют собой еще один объект изобретения.

Термины "гипервариабельная область" или "антиген-связывающий участок антитела", используемый в описании заявки, обозначают аминокислотные остатки, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "участков комплементарности" (участков CDR). "Каркасные участки" или "FR" представляют собой такие области вариабельного домена, которые не относятся к указанным гипервариабельным участкам. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антител включают (в направлении от N- до С- концевого фрагмента) домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Наиболее важным фрагментом тяжелой цепи является CDR3, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. Области CDR и FR определяют, как описано в работе Kabat E.A. и др.. Sequences of Proteins oflmmunological Interest, 5 изд.. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), и/или по их остаткам, включенным в состав "гипервариабельной петли".

Термины "CD20" и "антиген CD20" используются взаимозаменяемым образом и обозначают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20 человека, который обычно экспрессируется клетками или на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антител по изобретению с антигеном CD20 опосредует гибель клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток), за счет инактивации CD20. Гибель клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: индукции апоптоза, АЗКОЦ и/или КЗЦ.

Синонимами CD20, известными в данной области техники, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В1 В-лимфоцитов, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Термин "антитела анти-CD20" по изобретению обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности антитела анти-CD20 подразделяются на два типа, тип I и тип II (см. Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)), как указано в таблице 2.

Таблица 2
Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II
антитела анти-CD20 типа I	антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
CD20 локализованы в липидном слое	CD20 не локализованы в липидном слое
Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)	Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)
АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)	АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)
Полная емкость связывания	Пониженная емкость связывания
Гомотипическая агрегация	Повышенная гомотпическая агрегация
Индукция апоптоза после связывания	Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Одним из важнейших свойств антител анти-CD20 типа I и типа II является способ связывания. Таким образом, антитела анти-CD20 типа I и типа II классифицируются по соотношению связывающих активностей указанных антител и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86).

Соотношение связывающих активностей антител анти-СВ20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами таких антител анти-CD20 типа II являются, например, тоситумомаб (B1 IgG2a), гуманизированные антитела В-Lyl IgG1 (химерные гуманизированные антитела IgG1, описанные в WO 2005/044859), 11 В8 IgG1 (описанные в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и гуманизированные антитела В-Lyl (описанные в WO 2005/044859).

В отличие от анти-CD20 типа II соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами таких антител анти-CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ЕСАСС, гибридома, Press O.W. и др., Blood, 69/2, 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgGI (описанные в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанные в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанные в WO 2004/056312).

«Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86)" определяют прямым измерением иммунофлуоресценции (измеряется средняя интенсивность флуоресценции (СИФ)) с использованием указанных антител анти-CD20, конъюгированных с Су5, и ритуксимаба, конъюгированного с Су5, на клеточном сортере FACS (фирма Becton Dickinson) с использованием клеток Raji (ATCC, №CCL-86), как описано в Примере 2, и рассчитывают по следующей формуле:

Соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC. №CCL-86)=

СИФ обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. Термин "доля Су5 в конъюгате" обозначает число молекул метки Су5 - в расчете на молекулу антитела.

Обычно соотношение связывающих емкостей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В предпочтительном варианте указанные антитела анти-CD20 типа II, предпочтительно гуманизированные антитела В-Lyl, обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Термин "антитела, обладающие повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ)" обозначает антитела, описанные выше, обладающие повышенной АЗКОЦ, которую определяют способом, известным специалисту в данной области. Например, известным способом анализа АЗКОЦ является следующий:

1) анализ проводят с использованием клеток-мишеней, которые, как известно, экспрессируют антиген, узнаваемый антиген-связывающей областью антител,

2) анализ проводят с использованием в качестве эффекторных клеток одноядерных клеток периферической крови человека (ОКПК), выделенных из крови произвольно выбранного здорового донора,

3) анализ проводят в соответствии со следующим протоколом:

3.1) ОКПК выделяют с использованием обычного центрифугирования в градиенте плотности и осадок суспендируют в культуральной среде RPMI с плотностью 5×10 клеток/мл

3.2) клетки-мишени выращивают стандартными методами культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста с выживаемостью более 90%, промывают культуральной средой RPMI, вводят метку в виде 100 мкКи ⁵¹Cr^-, дважды промывают культуральной средой и ресуспендируют в культуральной среде с плотностью 10 клеток/мл,

3.3) 100 мкл конечной суспензии клеток-мишеней переносят в лунки 96-луночного планшета для микротитрования,

3.4) раствор антител серийно разбавляют культуральной средой (от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл) и полученные растворы добавляют (по 50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие клетки-мишени, анализ проводят при различных концентрациях антител в указанном выше интервале при тройном повторе,

3.5) для контролей с максимальным высвобождением (МР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл 2% водного раствора неионного детергента (VN, Nonidet, фирма Sigma, St. Louis),

3.6) для контролей с произвольным высвобождением (ПР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл культуральной среды RPMI,

3.7) затем 96-луночный планшет центрифугируют при 50 g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С,

3.8) в каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии ОКПК (см. п.3.1, выше) до соотношения клетки- эффекторы/клетки-мишени 25:1 и планшеты инкубируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4 ч,

3.9) из каждой лунки отбирают супернатант и измеряют экспериментальную радиоактивность (ЭР) с использованием γ-счетчика,

3.10) для каждой концентрации антител рассчитывают процент специфичного лизиса по формуле (ЭР-МР)/(МР-ПР)×100, где ЭР обозначает среднее значение измеренной радиоактивности (см. п.3.9) для данной концентрации антител, МР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в МР контроле (см. п.3.5), а ПР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в ПР контроле (см. п.3.6),

4) "повышенный уровень АЗКОЦ" определяют по повышению максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных концентраций антител и/или по понижению концентрации антител, необходимой для снижения вдвое максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных выше концентраций антител. Превышение АЗКОЦ по сравнению с цитотоксичностью, измеренной в указанном выше анализе, опосредуется указанными антителами, которые продуцируются теми же клетками хозяина (при использовании стандартных методов очистки, получения и хранения антител, известных специалисту в данной области), но которые не продуцируются клетками хозяина, сконструированными для гиперэкспрессии GnTIII.

Указанную "повышенную АЗКОЦ" получают гликоинженерией указанных антител, которая обозначает усиление указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител за счет инженерии их олигосахаридного компонента, описанной в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ)" обозначает лизис клеток-мишеней опухоли человека антителами по изобретению в присутствии комплемента. Предпочтительно КЗЦ измеряют при обработке клеток, экспрессирующих CD20, антителами анти-CD20 по изобретению в присутствии комплемента. КЗЦ наблюдается в том случае, если при концентрации 100 нМ антитела индуцируют лизис 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Предпочтительно анализ проводят с использованием опухолевых клеток, меченых ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождаемый ⁵¹Cr или Eu. Контроль включает инкубацию опухолевых клеток-мишеней в присутствии комплемента, но в отсутствие антител.

Обычно антитела анти-CD20 типа II изотипа IgG1 обладают характерной КЗЦ. Антитела анти-СD20 типа II (изотипа IgG1) обладают пониженной КЗЦ по сравнению с антителами типа I. Предпочтительно антитела анти-CD20 типа II являются изотипами IgG1.

Антитела "ритуксимаб" (контрольные антитела, например, анти-CD20 типа I) представляют собой генетически модифицированные химерные моноклональные антитела γ1 человека, содержащие константный домен антител мыши, специфичные в отношении антигена CD20 человека. Указанные химерные антитела содержат константные домены γ1 человека и обозначаются "С2 В8" (US 5736137, Andersen, и др., зарегистрированном 17 апреля 1998 г. Фармацевтическая корпорация IDEC). Ритуксимаб предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или повторной вялотекущей или фолликулярной, СD20-позитивной В-клеточной лимфомы не-Ходжкина. При исследовании механизма действия in vitro установлено, что ритуксимаб проявляет комплемент-зависимую цитоксичность (КЗЦ) (ReiffM.E. и др., Blood, 83(2), 435-445 (1994)). Кроме того, препарат проявляет высокую активность в анализах, где измеряется антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКОЦ).

Термин "гуманизированные антитела В-Lyl" обозначает гуманизированные антитела В-Lyl, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которые получают из мышиных моноклональных антител анти-CD20 В-Lyl (вариабельная область тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи (VL): SEQ ID NO: 2, см. Poppema S. и Visser L., Biotest. Bulletin, 3, 131-139 (1987)) за счет химеризации с константным доменом IgGI человека и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Указанные "гуманизированные антитела В-Lyl" подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, включающей SEQ ID No.3 - SEQ ID No.20 (от В-НН2 до В-НН9 и от B-HL8 до B-HL17. см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Более предпочтительны Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8. B-HL11 и B-HL13, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No. 20 (B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, гуманизированные антитела В-Lyl предпочтительно являются антителами IgGl. Предпочтительно такие гуманизированные антитела В-Lyl гликозилируют в Fc области по методикам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342. Такие гликозилированные гуманизированные антитела В-Lyl обладают измененным характером гликозилирования в Fc области, предпочтительно они характеризуются пониженным содержанием остатков фукозы. Предпочтительно в этих антителах не фукозилированы по меньшей мере 40% или более (в одном варианте от 40% до 60%, в другом варианте по меньшей мере 50%, и в еще одном варианте по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc области. Кроме того, олигосахариды Fc области предпочтительно являются бисекционными.

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, обеспечивающие эффективность действия терапевтического гликопротеина, такие как стабильность, устойчивость к действию протеазы, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетика и специфичная биологическая активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от конкретных структур олигосахаридов. Можно указать на некоторое соответствие между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока за счет взаимодействия с некоторыми белками, связывающимися с конкретными углеводами, тогда как другие углеводы могут связываться с антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Предпочтительными клетками для продуцирования терапевтических гликопротеинов являются клетки млекопитающих благодаря их способности гликозилировать белки в форме, наиболее совместимой с организмом человека (Cumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 115-130 (1991), Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, а другие подобные типы продуцентов, такие как дрожжи, нитевидные грибы, клетки насекомых и растений, обеспечивают такой профиль гликозилирования, который ассоциируется с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и некоторыми процессами, снижающими биологическую активность. Последние двадцать лет в качестве клеток млекопитающих наиболее часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО). Наряду с приданием пригодного профиля гликозилирования указанные клетки позволяют провести последовательное размножение генетически стабильных, высокопродуктивных линий клональных клеток. Такие клетки можно культивировать до высокой плотности в простых биореакторах с использованием бессывороточной среды, что позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые биотехнологии. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки NSO- и SР2/0-мышиной миеломы. Кроме того, в последнее время исследуется возможность продуцирования антител с использованием трансгенных животных (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает собственным профилем N-углеводных структур, которые по разному воздействует на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S. L, Trends Biotech., 15, 26-32 (1997)). Структуры N-углеводных цепей существенно варьируют в зависимости от степени процессинга и могут включать олигосахариды с высоким содержанием маннозы, полиразветвленные, а также двухантенные комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 26-32 (1997)). Обычно имеет место гетерогенный процессинг каркасных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, и даже моноклональные антитела присутствуют в полигликозилированных формах. Установлено также, что главные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями и при выращивании данной клеточной линии в различных условиях культивирования проявляются даже самые незначительные различия (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5(8), 813-822 (1995)).

Одним из способов существенного повышения активности и возможно исключения значительного нежелательного побочного действия антител при сохранении простого способа получения является усиление природных, клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител за счет формирования их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgGI, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые содержат консервативный сайт N-гликозилирования по Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагаются между СН2 доменами, формируя плотные контакты с полипептидной цепью, и их присутствие является существенным для антител при осуществлении эффекторных функций, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКОЦ) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 813-822 (1995), Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 59-76 (1998), Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)).

Ранее установлено, что гиперэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I11 (GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает АЗКОЦ in vitro анти-необластомных химерных моноклональных антител (chCE7), продуцируемых модифицированными клетками СНО (см. публикации Umana Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342, включенные в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Антитела chCE7 принадлежат к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но являются практически непригодными для клинического применения при продуцировании в стандартных производственных клеточных линиях, не содержащих фермента GnTIII (Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999)). В указанной работе впервые установлено, что АЗКОЦ можно существенно повысить благодаря конструированию клеток, продуцирующих антитела и экспрессирующих GnTIII, что приводит к повышению доли (Fc)-ассоциированных, бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные, нефукозилированные олигосахариды, на уровне, превышающем уровень, наблюдаемый в природных антителах.

Термин "Всl-2", используемый в описании заявки, обозначает белок Всl-2 (Swiss Prot ID №Р10415), член семейства белков Всl-2 (Cory S. и Adams J.M., Nature Reviews Cancer, 2, 647-656 (2002), Adams, Genes und Development, 17, 2481-2495 (2003), Danial N.N. и Korsmeyer S.J., Cell, 116, 205-219 (2004), Petros A.M., Biochim. Biophys. Acta, 1644, 83-94 (2004)).

Термин "активный агент анти-Всl-2" включает "антисмысловые нуклеотиды анти-Всl-2" и "ингибиторы Всl-2". "Антисмысловые нуклеотиды анти-Всl-2" регулируют с понижением уровень мРНК Всl-2 и понижают экспрессию белка Всl-2. Примеры таких антисмысловых нуклеотидов анти-Всl-2 включают облимерсен и SPC-2996. Термин "ингибиторы Всl-2", используемый в описании заявки, обозначает агенты, которые ингибируют связывание белка Всl-2 за счет ингибирования фосфорилирования Всl-2 ("ингибиторы фосфорилирования белка Всl-2", такие, например, как RTA-402), или за счет связывания с белком Всl-2, и таким образом разрушают комплекс Bad/Bcl-2 (такие ингибиторы обозначаются как "ингибиторы связывания белка Всl-2"). Предпочтительно указанными ингибиторами Всl-2 являются ингибиторы связывания белка Всl-2. Ингибирующую активность в отношении Всl-2 за счет непосредственного связывания таких ингибиторов с белком Всl-2 измеряют анализом конкурентного связывания. Таким образом, величину Ic₅₀, характеризующую активность ингибирования белка Всl-2, определяют методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (ГФВР), описанным в примере 3. Предпочтительно величина Ic₅₀, характеризующая активность ингибирования белка Всl-2, составляет 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее. Такими ингибиторами связывания белка Всl-2 являются соединения, такие как госсипол, АТ-101, мезилат обатоклакс