Мутанты стрептокиназы и их ковалентно модифицированные формы

Мутанты стрептокиназы и их ковалентно модифицированные формы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к мутантам стрептокиназы и их ковалентно модифицированным формам. Настоящее изобретение использует стрептокиназу и ее родственные варианты, полученные заменой, присоединением, удалением или созданием конструкций за счет слияния доменов, модифицированные ПЭГ гомогенно, сайт-специфично и определенным образом, что позволяет использовать их в качестве улучшенных белковых терапевтических средств.

Настоящее изобретение относится к ковалентному присоединению ПЭГ к цистеиновым вариантам стрептокиназы, ее мутеинам, видовым вариантом или продуктам слияния с фибрином, при использовании реагентов на основе производных ПЭГ, реагирующих с тиольными группами. Могут быть также использованы различные значения pK_a альфа-аминогрупп для проведения специфического конъюгирования ПЭГ при кислых рН с целью получения монопэгилированных вариантов стрептокиназы или ее мутеинов.

Настоящее изобретение относится также к идентификации различных цистеиновых вариантов стрептокиназы или ее мутантов, в том числе родственных ковалентных вариантов на основе структурной и функциональной информации (Wang et al., 1998). Структурное сравнение с другим однодоменным активатором плазминогена, стафилокиназой (SAK), указывает на значительное сходство с альфа-доменом СК, несмотря на то что оба белка не обладают значительной гомологией последовательностей на аминокислотном уровне (Rabijns et al., 1997). Это указывает на то, что активаторы плазминогена из различных источников сохраняют одинаковый тип структурной укладки, даже если они значительно различаются по своей полипептидной последовательности. Можно ожидать, что эволюционное ограничение удерживает структурную целостность, поскольку активаторы бактериального плазминогена являются белковыми кофакторами, следовательно, они используют множество точек контакта, необходимых для конформационной активации зимогена. Такое структурное подобие еще больше увеличивает масштаб настоящего изобретения, поскольку методы, используемые в данном случае, могут быть применены к активаторам бактериального плазминогена других типов или видов, которые участвуют в подобной активации плазминогена. Поэтому «правила», приводимые здесь для получения биологически активных цистеиновых вариантах стрептокиназы, будут использованы для получения биологически активных цистеиновых вариантов различных других форм стрептокиназы. Конъюгирование этих цистеиновых вариантов с производными ПЭГ, способными реагировать с цистеином, приводит к тем же преимуществам, которые получают при использовании производных в настоящем исследовании. Принципы определения сайта, в котором находится цистеин, главным образом основываются на идее выбора остатков, попадающих либо в петлю, либо в спираль, либо в пограничные области между структурированными и гибкими участками. Для определения поверхностной доступности использована программа DSSP. Программа DSSP (Kabsch et al., 1983) определяет вторичную структуру, геометрические свойства и доступность белков по отношению к растворителям, задаваемую атомными координатами в формате Protein Data Bank. DSSP устанавливает доступность каждого остатка в квадратных ангстремах. Поверхностная доступность аминокислотных остатков стрептокиназы была расшифрована из данных по кристаллической структуре высокого разрешения для стрептокиназы в комплексе с микроплазмином (Wang et al., 1998, PDB ID 1BML). Для областей, которые были пропущены в этой структуре (175-181 и 252-262) при определении поверхностной доступности используют кристаллическую структуру изолированных бета-доменов (Wang et al., 1999, PDB ID 1c4p).

Цистеиновые варианты стрептокиназы, ее мутеины, производные видов и ее ковалентно модифицированные формы далее химически модифицируют присоединением реагентов на сульфгидрильные группы с последующим эмпирическим тестированием на существенное сохранение биологической активности наряду с приобретением новых свойств, таких как пониженная иммуногенность или реакция с анти-СК антителами, пониженная чувствительность к протеолизу, увеличенное выживание in vivo и т.д. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению сконструированных вариантов стрептокиназы с целью применения для использования в фармацевтических композициях для лечения сосудистых заболеваний.

Уровень техники

Образование тромба (кровяного сгустка) в кровеносной системе может вызвать закупорку сосудов, приводящую к фатальным последствиям. Образование сгустка и его растворение представляет собой строго контролируемый процесс гомеостаза. Любое отклонение от нормального свертывания крови приводит к различным клиническим патологическим состояниям, таким как инсульт, эмболия сосудов легких, тромбоз глубоких вен и острый инфаркт миокарда. Патофизиологические состояния, развивающиеся в результате нарушения процесса свертывания крови, требуют незамедленного клинического вмешательства. Наиболее часто практикуемое медицинское вмешательство состоит во введении тромболитических агентов (Collen et al., 1988; Collen, 1990; Francis and Mafder, 1991). Наиболее часто используемые тромболитические агенты включают в себя стрептокиназу СК (SK), урокиназу (UK) и тканевой активатор плазминогена (ТРА). Ранее были проведены многочисленные фармакоэкономические оценки использования различных тромболитиков для коррекции острого инфаркта миокарда (Mucklow, 1995; Gillis and Goa, 1996). Banerjee et al., 2004, рассмотрел клиническое использование стрептокиназы и ее применение в качестве лучшего выбора препарата для лечения. Что касается клинической эффективности, то как стрептокиназа, так и ТРА в равной степени являются хорошими препаратами, но в связи с тем, что стрептокиназа на несколько порядков дешевле и несколько лучше в отношении периода полураспада in vivo, она во всем мире является наиболее предпочтительным тромболитиком (Sherry and Marder, 1991, Wu et al., 1998). Кроме того, использование ТРА несколько более вероятно вызывает инсульт, наиболее частый побочный эффект для обоих лекарств. Однако, стрептокиназа, будучи бактериальным белком, является по природе антигенной и может вызывать клинические осложнения, например, аллергическую реакцию или кровотечение. Кроме того, время полужизни циркуляции стрептокиназы (15-30 мин) недостаточно для эффективного тромболиза (Wu et al., 1998).

Несмотря на все это в последнее время тромболитическая терапия с помощью фибринолитических агентов, например, стрептокиназы (СК), тканевого активатора плазминогена (ТРА) или урокиназы (UK) полностью изменила клиническое применение различных заболеваний органов кровообращения, например, тромбоза глубоких вен, эмболии сосудов легких и острого инфаркта миокарда. Эти агенты проявляют свои фибринолитические свойства за счет активации плазминогена ПГ (PG) при циркуляции путем расщепления лабильных пептидных связей между остатками 561 и 562 в ПГ. В результате неактивный зимоген переходит в активную форму, сериновую протеиназу, плазмин ПН (PN), который затем циркулирует в системе и действует на фибрин, разрушая последний с образованием растворимых продуктов распада. Здесь следует упомянуть, что сам PN не способен активировать ПГ до ПН; эта реакция катализируется высоко специфическими протеазами, подобными ТРА, комплексом СК-плазминоген и UK, все они обладают необычайно высокой специфичностью по отношению к белковым субстратам, а именно способностью расщеплять лабильную пептидную связь в ПГ высоко специфическим образом. Однако, в отличие от UK и ТРА, СК не обладает собственной протеолитической активностью и активирует ПГ в ПН "косвенно", т.е. вначале образуя высокоафинный эквимолярный комплекс с ПГ, известный как активаторный комплекс (рассмотренный Castellino, F.J., 1981). Затем активаторный комплекс действует как протеаза, которая расщепляет другие молекулы субстрата ПГ до ПН.

Несмотря на огромные преимущества терапевтического использования стрептокиназы и других бактериальных тромболитиков имеется несколько недостатков, ограничивающих применимость этих полипептидных лекарств. Эти недостатки включают в себя их подверженность деградации протеолитическими ферментами, малое время полужизни циркуляции, малый срок хранения, быстрое выведение почками и их способность генерировать нейтрализующие антитела. Эти недостатки также иногда присущи многим другим полипептидным лекарствам, по своей природе отличающимся от полипептидов человека. Этот аспект в общем виде рассмотрен Roberts et al.; 2002. Были сделаны различные попытки устранить эти недостатки полипептидных лекарств, например, изменением аминокислотных последовательностей для снижения протеолиза или антигенности, присоединением полипептидов к доменам глобулина или альбумина для увеличения времени полужизни (Osborn et al., 2002).

Эти способы приносят мало пользы для решения проблемы и сопровождаются дополнительными затратами. Основным прорывом в этой области является пэгилирование белков, обеспечивающее единственное решение множества проблем. ПЭГ (полиэтиленгликоль) образуется в результате полимеризации нескольких повторяющихся субъединиц этиленгликоля, приводящей к линейным или разветвленным полимерам ПЭГ заранее запланированных молекулярных масс. Будучи ковалентно конъюгированными с ПЭГ, белки или полипептиды проявляют улучшенные фармакокинетические или фармакодинамические свойства, такие как увеличение растворимости в воде, уменьшение почечного клиренса и часто существенное уменьшение иммунореактивности (Moreadith et al., 2003, Doherty et al., 2005, Basu et al., 2006). Конъюгирование с ПЭГ также делает молекулу менее подверженной протеолизу. Уменьшение взаимодействия с рецепторами или взаимодействия с поверхностными белками клеток, обусловленное присоединением ПЭГ, также способствует подавлению неблагоприятных иммунологических эффектов. Пэгилированные лекарства также более стабильны в широком интервале рН и изменения температуры (Monfardini et al. 1995). Применение ПЭГ одобрено FDA для терапевтических средств и показано, что он практически не обладает токсичностью и выводится из организма в неизменном виде либо через почки, либо вместе с калом. Полезные свойства конъюгирования с ПЭГ могут быть потенциально сообщены СК для того, чтобы сделать его более эффективным и безопасным тромболитиком. Попытка пэгилирования СК при использовании относительно неспецифической реакции химической модификации описана в литературе (Rajagopalan et al., 1985). Терапевтические применения таких модификаций строго ограничены высокой аномальной способностью активации плазминогена. Кроме того, слабо контролируется природа модификации, которая может быть гетерогенной. Причиной такой гетерогенности являются химические превращения, используемые для модификации ПЭГ, не являющиеся адресной модификацией специфического сайта. Поэтому такую стратегию модификации не используют для получения усовершенствованных тромболитиков на основе СК.

Термин стрептокиназа, используемый везде обобщенно в тексте, относится к вариантам стрептокиназы, любому из ее функциональных фрагментов, функциональным мутеинам, изолятам из различных образцов и продуктов конденсации, полученных присоединением олиго- или полипептидов природного или синтетического происхождения.

Известно, что различные функциональные группы, находящиеся в молекуле белка, могут быть использованы для введения ПЭГ. Наиболее часто используемыми способами является дериватизация лизиновых остатков или цистеиновых остатков в белках. Альфа-аминогруппа в N-концевом фрагменте также может быть использована для единичного гомогенного конъюгирования ПЭГ в белках (Baker et al., 2006). Однако, использование цистеиновых остатков для присоединения групп ПЭГ является особенно предпочтительным, т.к. потенциально SH-группы могут быть использованы в качестве мишени сайт-специфическим образом, особенно если белок содержит или может быть устроен таким образом, чтобы он содержал очень ограниченное число цистеиновых остатков. Не будет преувеличением считать, что конъюгирование с ПЭГ становится видом искусства, когда белок лишен любых цистеинов, т.к. он составляет виртуальный чистый холст для присоединения, введения цистеина или замены цистеином с целью сайт-специфического «раскрашивания» ПЭГ, или декорации, белков. Поскольку потенциально присоединение цистеинов к не содержащему цистеина субстрату может оказывать неблагоприятное действие на функцию белка. Поэтому выбор сайтов для получения цистеиновых вариантов требует тщательного планирования и исполнения. В противоположность, скажем, пэгилированию, основанному на модификации лизина, хотя химизм этой реакции и хорошо известен, гетерогенность является существенным недостатком. В случае СК большое число лизиновых остатков равномерно распределено вдоль полипептида и поэтому ограничивают возможность гомогенного сайт-специфического ПЭГ конъюгирования. Интереснее, что в молекуле стрептокиназы нет природного цистеина (Malke et al., 1985), благодаря чему становится возможным получение различных вариантов стрептокиназы. Кроме того, в нативно свернутых ковалентных производных СК, образующихся при слиянии с фибринсвязывающими доменами (ссылка US Patent 7163817). Это дает возможность получения различных вариантов специфичной к тромбам стрептокиназы, содержащей свободный цистеин, в отсутствие действительных факторов, мешающих нормальному сворачиванию белка, богатого цистеином (все цистеиновые остатки участвуют в образовании дисульфидной связи). Вводимый свободный цистеин(ы) может взаимодействовать с различными реагентами на тиольные группы, в том числе с ПЭГ, с образованием цистеиновых аддуктов этих белков.

Стрептокиназа (СК) является видовым обозначением секреторного белка, образованным множеством гемолитических стрептококков, способных индуцировать лизис плазменных сгустков (Tillet and Gamer, 1933). Поэтому она может легко и экономично быть получена из ее основного источника или при использовании рДНК технологии из подходящих гетерологических хозяев, СК очень рентабельна и поэтому является основным тромболитическим лекарственным соединением, особенно для мировых рынков, чутко реагирующих на цену. Показано, что СК очень эффективна при клиническом лечении острого инфаркта миокарда, сопровождающегося тромбозом коронарных артерий (1SIS-3, 1992), и выступает в роли тромболитического агента в течение более трех десятилетий. Однако, она имеет ряд недостатков. Известно, что плазмин, образующийся при активации плазминогена, опосредованной стрептокиназой, расщепляет стрептокиназу вскоре после ее введения (Rajagopalan et al., 1985, Wu et al., 1998). Это ограничивает время полужизни стрептокиназы in vivo приблизительно до 15 мин (Wu et al., 1998). Хотя стрептокиназа остается в кровотоке значительно дольше, чем выбранное другое тромболитическое лекарственное средство, ТРА (со временем полужизни, равным менее 5 мин; Ross, 1999; Ouriel, 2002), все же этого недостаточно для эффективной терапии (Wu et al., 1998). Из-за обнаруженных недостатков, связанных с быстрым выведением in vivo имеющихся активаторов плазминогена, предприняты попытки получать усовершенствованные рекомбинантные производные этих соединений (Nicolini et al., 1992, Adams et al., 1991, Lijnen et al., 1991; Marder, 1993, and Wu et al., 1998). Несмотря на свои внутренние проблемы стрептокиназа остается предпочтительным лекарственным средством, особенно в развивающихся странах, из-за ее относительно низкой стоимости (например, приблизительно US $ 50 или меньше на курс лечения по сравнению почти с US $ 1500 для ТРА).

Впервые показано, что стрептокиназа вызывает лизис кровяных сгустков (Tillet and Gamer (1933)). Однако, позже было показано, что фибринолитическая активность СК обусловлена ее способностью активировать плазминоген человека ПГЧ (HPG), описанная Castellino, 1979. Стрептокиназа главным образом секретируется β-гемолитической группой А, С и G стрептококки. СК представляет собой активатор ПГ человека, хотя сама она не является протеазой, скорее она связывается с ПГ/ПН человека и привлекает другие молекулы HPG в качестве субстрата и превращает их в продукт, ПН. Последний циркулирует в кровотоке. Плазмин, будучи неспецифической протеазой, обобщенной и промежуточной генерацией ПН, после инъекции СК приводит к широкомасштабному разрушению различных факторов крови, что приводит к риску кровотечения, а также к растворению ЕСМ и базальной мембраны (ВМ) и к увеличению бактериальной инвазивности во вторичные центры зараженности в теле хозяина (Esmon and Mather, 1998; Uihteenmaki et al., 2001). Таким образом, имеется острая необходимость минимизировать побочные эффекты конструированием усовершенствованных аналогов СК.

В настоящее время СК интенсивно используют в качестве тромболитического лекарственного средства во всем мире, т.к. она является эффективным растворителем фибриновых сгустков, однако она имеет собственные ограничения. СК является белком, продуцируемым из гемолитической стрептококки, его использование в организме человека индуцирует иммуногенность (McGrath and Patterson, 1984; McGrath et al., 1985; Schweitzer et al., 1991). Известно, что высокие титры анти-СК иммуноглобулинов (Ig), генерируемые после первого введения СК, остаются у пациентов в течение периода от нескольких месяцев до нескольких лет (Lee et al., 1993). Таким образом, анти-СК антитела существенно ограничивают ее применение в качестве пролонгированной терапии либо из-за нейтрализации СК при введении (Spottal and Kaiser, 1974; Jalihal and Morris, 1990), либо из-за того, что она вызывает ряд аллергических реакций (McGrath and Patterson, 1984; McGrath et al., 1985).

Как уже упоминалось выше, использованию стрептокиназы в тромболитической терапии препятствует относительно короткое время полужизни (несколько минут) этого белка in vivo (что в действительности наблюдается для всех используемых в настоящее время тромболитических лекарственных средств), помимо ее иммуногенности. Показано, что чужеродные белки при введении в кровоток позвоночных часто быстро выводятся через почки. Эта ситуация становится еще более острой в случае стрептокиназы, когда постепенно увеличивающиеся дозы белка (для того, чтобы превысить быструю нейтрализацию, обусловленную антителом) могут значительно увеличить вероятность аллергического ответа/ов, что делает повторное введение в значительной мере неэффективным и опасным. Обычно попытки решить эти проблемы в литературе хорошо подтверждены документально, где показано, что для получения усовершенствованных лекарственных веществ целесообразны различные физические и химические модификации, например, смотри: Mateo, С. et al., 2000, Lyczak, J.В. & Morrison, S.L. 1994, Syed, S. et. al.; 1997, Allen, Т.М. 1997. Наиболее перспективной из них в настоящее время является модификация терапевтических белков ковалентным присоединением полиалкиленоксидных полимеров, например, полиэтиленгликолей (ПЭГ). ПЭГ представляет собой неантигенный, инертный полимер и известно, что он увеличивает время полужизни циркуляции белков в организме (Abuchowski et al., 1984; Hershfield, 1987; Meyers et al., 1991). Это обеспечивает продолжительное действие лекарственных веществ при их использовании. Считают, что конъюгирование ПЭГ с белками увеличивает их общий размер и поэтому уменьшает быстрое почечное очищение. Кроме того, присоединение ПЭГ также придает белку или полипептиду большую растворимость в воде и увеличивает их стабильность в условиях in vivo наряду со значительным уменьшением иммуногенности и увеличением стабильности in vivo (Katre et al., 1987; Kcitre, 1990). U.S. Pat. №. 4,179,337 раскрывает применение ПЭГ или полопропиленгликоля, присоединенных к белкам, для получения физиологически активной неиммуногенной водорастворимой полипептидной композиции.

Несмотря на то что химизм конъюгирования ПЭГ является, в основном, универсальным, ключевое расположение полимеров ПЭГ в терапевтическом белке имеет первостепенное значение для достижения успешных результатов. Доступность информации о трехмерной структуре с функциональными активными областями, выявленными благодаря различным исследованиям в растворе, помогает в разработке плана введения мутаций, чтобы сохранить функциональность неизменной.

Полная аминокислотная последовательность СК определена последовательным деградационным анализом по Эдману фрагментов СК, полученных бромциановым и ферментативным способами (Jackson and Tang, 1982). Результаты показали, что молекула с молекулярной массой, M_r, равной 47408 Да, содержит 415 аминокислот в единичной полипептидной цепочечной аминокислотной последовательности.

Нуклеотидная последовательность из S.equisimilis H46A (штамм прототипа для получения СК, которую чаще всего используют терапевтически для лечения людей) была секвенирована Malke с сотрудниками в 1985. Был также изучен транскрипционный контроль этого гена и описан функциональный анализ его комплексного промотора (Grafe et al., 1996). Следовательно, имеется значительная информация для эффективного использования этого гена, для того чтобы с уверенностью получать стрептокиназу в относительно непатогенных микробах.

Цель изобретения

Основной целью настоящего изобретения является обеспечение мутантов стрептокиназы, обладающих повышенной эффективностью благодаря более продолжительному действию и пониженной иммунореактивности.

Другой целью настоящего изобретения является селективная модификация стрептокиназы для улучшения ее фармакокинетических свойств и придания ей свойств терапевтически эффективного тромболитика и увеличения протеолитической стабильности и увеличения времени полужизни in vivo.

Еще одной целью настоящего изобретения является селективная модификация стрептокиназы с тем, чтобы сохранить желаемые биологические свойства, присущие немодифицированной молекуле.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение производного СК, которое обеспечивает продолжительный и более эффективный фибринолиз в определенном сайте при пониженной иммунореактивности.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения пэгилированных цистеиновых вариантов стрептокиназы или ее активных мутеинов или молекул гибридных молекул активаторов плазминогена в чистой или биологически активной форме.

Раскрытие изобретения

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает мутанты стрептокиназы, ее функциональные фрагменты или ковалентно модифицированные формы. Производные содержат полипептиды, относящиеся к СК, где один или несколько остатков цистеина замещены одной или несколькими заменимыми аминокислотами белков предпочтительно, производные содержат остаток цистеина, замещенный аминокислотой, выбранной из аминокислот, входящих в области петли, концов альфа-спиралей и даже в области, образующие вторичную структуру, или в области, где остатки цистеина присоединены к N-концу или С-концу молекулы белка, при наличии или отсутствии аминокислотных достроек.

Настоящее изобретение включает в себя общие способы селекции, получения и применения стрептокиназ, проявляющих повышенную протеолитическую стабильность, увеличенное время полужизни из плазмы и пониженную иммуногенность. Производные имеют модифицированные аминокислотные последовательности, но фактически сохраняют свою биологическую активность. Настоящее изобретение также описывает цистеиновые варианты стрептокиназы, ковалентно связанные с одной или несколькими молекулами полиэтиленгликоля (ПЭГ) различных молекулярных масс, например, 5, 10, 20 и 40 кДа. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения касается фармацевтических композиций вариантов пэгилированной стрептокиназы вместе с подходящими инертными наполнителями, стабилизаторами и носителями, известными в данной области техники, для эффективного распределения в организме при лечении различных заболеваний кровеносной системы.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение основано на экспериментальных результатах, показывающих, что ковалентное присоединение одной или нескольких молекул ПЭГ к стратегически замещенным или добавленным остаткам цистеина в молекуле стрептокиназы приводит к биологически активной пэгилированной стрептокиназе с повышенной протеолитической стабильностью и увеличением времени полужизни и меньшей иммунореактивностью по сравнению со нативной стрептокиназой. Локализация и число молекул при ПЭГ конъюгировании могут быть специально подобраны при помощи цистеиновых вариантов, сконструированных таким образом, чтобы они не могли ингибировать каталитическую функцию (активацию плазминогена) в стрептокиназе и ее активных вариантов, в том числе в стрептокиназах, специфичных к тромбам (в данном контексте можно сослаться на U.S. Patent 7163817, в котором описано устройство и конструкция вариантов стрептокиназ, специфичных к тромбам, с повышенной фибринолитической активностью благодаря введению фибринсвязывающих доменов по любому или обоим концам молекулы белка СК). Замена, присоединение или внедрение одного или нескольких молекул цистеина в стрептокиназу и полипептиды стрептокиназы, специфичной к тромбам, создает условия для нужной локализации при присоединении ПЭГ различных молекулярных масс к полипептидам при условии, что замена и/или присоединение проводят "стратегически" полностью, избегая потери функциональных свойств, и приводит к получению новых полезных свойств, отсутствующих в немодифицированном нативном белке. Выбор места расположения ПЭГ проектируют, исходя из поверхностной доступности выбранного сайта и его структурно-функциональной значимости.

Пэгилированные стрептокиназы настоящего изобретения обладают большей применимостью в качестве терапевтических средств, а также большими преимуществами при использовании по сравнению с нативной молекулой(ами), поскольку сохраняя нативную или почти нативную биологическую активность, они имеют увеличенный латентный период по сравнению с первыми, которые быстро распадаются in vitro в присутствии плазмина (плазминогена), а также после введения, в результате чего они очень быстро выводятся из кровотока. Напротив, пэгилированные стрептокиназы проявляют значительно более высокую протеолитическую стабильность, являются иммунореактивными и выводятся из кровотока in vivo только после заметно увеличенного периода времени по сравнению с нативными (непэгилированными) белками.

Следовательно, пэгилированные стрептокиназы настоящего изобретения эффективны для лечения субъектов с нарушением кровообращения, например, с венозными или артериальными тромбозами, инфарктом миокарда и т.д., имея то преимущество, что пэгилированные стрептокиназы настоящего изобретения создают потенциал для увеличения эффективности благодаря увеличению срока действия и уменьшению иммунореактивности, что дает возможность повторного введения благодаря минимальной антигенности. Число, размер и локализация групп(ы) ПЭГ могут быть использованы таким образом, чтобы реконструировать стрептокиназы для реализации различных времен полужизни, что позволяет использовать их соответственно требованиям конкретного заболевания/клинического синдрома, или определенного больного.

Настоящее изобретение включает в себя селективную модификацию стрептокиназ для фармацевтического применения как для того, чтобы усилить их фармакокинетические свойства, так и для того, чтобы обеспечить терапевтически эффективные тромболитики. Это изобретение также включает в себя мутанты стрептокиназы, ее природные или искусственные варианты, которые сохраняют желаемые биологические свойства нативной немодифицированной молекулы. Все производные настоящего изобретения могут быть получены экспрессированием последовательности рекомбинантной ДНК, кодирующей нужное производное в клетках хозяина, например, в прокариотических клетках хозяина, например, E.coli или в эукариотических клетках хозяина, например, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих, при использовании обычно используемых материалов, известных в данной области техники. Информация по последовательности ДНК для закодированной стрептокиназы из различных препаратов может быть получена из опубликованных данных. Изучен полиморфизм гена стрептокиназы и объяснена его роль в патогенезе (Malke Н, 1993). Также проведено молекулярное эпидемиологическое исследование для определения распределения гена стрептокиназы в группе А стрептококковых штаммов различных М типов и других препаратов стрептококка. Большинство изученных штаммов в этом исследовании проявило положительную стрептокиназную активность по данным оверлейного теста казеин-плазминоген. Суммарные результаты этих исследований показывают, что существует значительная гетерогенность среди стрептокиназ, полученных из различных стрептококковых препаратов (Huang et al.; 1989). Возможно использование любых доступных вариантов стрептокиназы, которые способны активировать плазминоген для мутагенеза цистеина и последующих модификаций реакционноспособными сульфгидрильными реагентами.

Новые последовательности ДНК, кодирующие мутанты и видовые производные могут быть подобным образом клонированы и экспрессированы, как и в случае природных форм. Затем стрептокиназы, полученные экспрессией в генетически сконструированных клетках хозяина, могут быть очищены и при желании переведены в фармацевтические композиции обычными способами.

В качестве предпочтительного аспекта настоящего изобретения стрептокиназы, экспрессированные рекомбинантным путем, реагируют с целевыми реакционноспособными агентами на тиольную группу в условиях, позволяющих осуществить присоединение остатка, реагирующего с тиольной группой, к сульфгидрильной группе введенных цистеиновых остатков в стрептокиназах.

Термин «реагирующий с тиольной группой» определяется здесь как любое соединение, имеющее реакционноспособную группу или способное активироваться с образованием реакционноспособной группы, способной присоединяться к сульфгидрильной группе (-SH) цистеинового остатка. К числу таких соединений относятся полимеры, например, полипропиленгликоль и ПЭГ, полимеры на основе углеводов и полимерные аминокислоты и производные биотина. Соединение, подлежащее конъюгированию, можно активировать сульфгидрильными остатками, например, сульфгидрильной группой, тиолом, трифлатом, трезилатом, азиридином или оксираном или предпочтительно иодацетамидом или малеимидом. Конъюгирующая группа может иметь различные молекулярные массы, предпочтительно, от 5000 до 40000 для ПЭГ. Одним из важнейших признаков настоящего изобретения является придание позиционной селективности пэгилированию или другим типам присоединения при сохранении функциональных свойств белка.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает мутантный полипептид стрептокиназы с последовательностью аминокислот, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-24, где по меньшей мере один цистеиновый остаток заменен или внедрен. В таблице 34 представлены остатки, соответствующие остаткам SEQ ID NO: 1, которые, возможно, нетолерантны к мутациям или замене.

В одном из вариантов настоящего изобретения полученный мутант стрептокиназы является функциональным фрагментом, имеющим SEQ ID NO: 2-6.

В одном из вариантов настоящего изобретения полученные мутанты стрептокиназы являются мутеинами стрептокиназы, имеющими SEQ ID NO: 7-19.

В одном из вариантов настоящего изобретения полученный мутант стрептокиназы представляет собой видовые варианты стрептокиназы, имеющие SEQ ID NO: 20-21.

В одном из вариантов настоящего изобретения для видовых вариантов стрептокиназы гомология аминокислотной последовательности составляет 75%-100% относительно нативной стрептокиназы, имеющей SEQ ID NO: 1.

В другом варианте настоящего изобретения, по меньшей мере, один цистеиновый остаток, замещенный по меньшей мере одной аминокислотой, расположенной по меньшей мере, в одной области стрептокиназы, выбранной из группы, состоящей из: петли 48-64, петли 88-97, области 103-106 или 119-124 или спиралеобразующей области 196-207, или петлеобразующей области 170-181, или петлеобразующей области 254-264, или суперспиральной области 318-347, или области 360-372 в SEQ ID NO: 1 или ее мутеинов или их функциональных фрагментов, где указанное производное обладает биологической активностью, измеренной стандартным тестом.

* В другом варианте настоящего изобретения полипептид мутанта стрептокиназы содержит от одной до трех цистеиновых замен, где цистеиновая замена представляет собой кислоту, локализованную, по меньшей мере, в одной области, соответствующей нативной последовательности аминокислотных остатков стрептокиназы (SEQ ID NO: 1), в области, выбранной из группы, состоящей из петли аминокислотных остатков 48-64, петли аминокислотных остатков 88-97, области аминокислотных остатков 102-106, области аминокислотных остатков 119-124, спиралеобразующей области аминокислотных остатков 196-207, петлеобразующей области аминокислотных остатков 170-181, петлеобразующей области аминокислотных остатков 254-264, суперспиральной области аминокислотных остатков 318-347 и области аминокислотных остатков 360-372, где мутант может активировать плазминоген.

Так, как используется здесь, термин «соответствующий» используют для обозначения пронумерованных положений в эталонном белке, например, в стрептокиназе (СК) дикого типа или SEQ ID NO: 1, и этих положений в запрашиваемом белке (например, мутантной СК), которые выравнивают с положениями в эталонном белке. Таким образом, когда аминокислотная последовательность испытуемой СК, т.е. SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и т.д., выровнена с аминокислотной последовательностью эталонного белка, т.е. SEQ ID NO: 1, аминокислоты в последовательности испытуемой СК, которая «соответствует» определенным пронумерованным положениям последовательности эталонной СК, является таковой, которая согласовывается с этими положениями в последовательности эталонной СК, но необязательно в этих точных обозначенных цифрами положениях последовательности эталонной СК. Например, мутант Gly34Cys в SEQ ID NO: 4 должен "соответствовать" мутанту Gly49Cys в SEQ ID NO: 1.

** В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, дополнительно содержащий фибринсвязывающий домен, присоединяют к С-концу, N-концу или к обоим концам.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в предыдущем варианте, где фибринсвязывающий домен содержит по меньшей мере одну замену цистеином.

*** В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в предыдущем варианте, где фибринсвязывающий домен присоединен к мутанту стрептокиназы при помощи гибкого связывающего олигопептида.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, где мутант стрептокиназы дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену, причем аминокислотная замена соответствует аминокислотной замене, выбранной из группы, состоящей из Asn90Ala, HisI07Ala, Serl08Ala, Asp227Tyr, Asp238Ala, Glu240Ala, Arg244Ala, Lys246Ala, Leu260Ala, Lys278Ala, Lys279Ala и Asp359Arg в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, где мутант стрептокиназы содержит делецию, причем делеция соответствует аминокислотной делеции, выбранной из группы, состоящей из Asn90, Asp227 и Asp359.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, где мутант дополнительно содержит аминокислотное удлинение у N и/или С-конца.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, где мутант стрептокиназы содержит по меньшей мере одну цистеиновую мутацию в положении, соответствующем G49, S57, А64, 188, S93, D95, D96, DI02, S105, D120, К121, D122, Е148, К156, D173, D174, L179, DI81, S205, А251, 1254, N255, К256, К257, S258, L260, Е281, К282, F287, D303, L32I, L326, А333, D347, D360 или R372 в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, где мутант стрептокиназы содержит по меньшей мере две цистеиновых мутации в положении, соответствующем G49; S57, А64, 188, S93, D95, D96, 0102, S105, D120, К121, D122, Е148, К156, D173, D174, L179, D181, S205, А251, 1254, N255, К256, К257, S258, 1260, Е281, К282, F287, D303, L321, L326, А333, 0347, D360 or R372 SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют мутант, который упомянут в абзаце *, где мутант стрептокиназы со