Питание, стимулирующее иммунную систему

Питание, стимулирующее иммунную систему

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к питанию для улучшения ответа иммунной системы и к способу его получения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Иммунная система характеризуется различными возможными путями реагирования на антиген. Решающей стадией для типа иммунного ответа является стимуляция различных субпопуляций T-клеток. Так называемые Th1-клетки, главным образом, продуцируют цитокины, которые стимулируют клеточный иммунный ответ (IFN-y, IL-12, IL-2), например, по отношению к патогенам и вакцинам. Напротив, Th2-клетки, главным образом, продуцируют IL-4, IL-5 и IL-10. Указанные цитокины усиливают IgE-опосредованную аллергическую реакцию и воспаление. Th1- и Th2- связанные цитокины действуют антагонистически, и ответы Th1 и Th2 в нормальных физиологических условиях находятся в хорошо контролируемом равновесии. Не преобладает ни Th1-ответ, ни Th2-ответ. При дисбалансе преобладание Th1- или Th2- иммунного ответа играет роль в нескольких патологических состояниях.

Международные патенты WO 2005/039319 и WO 2006/091103 имеют отношение к лекарственному препарату, включающему в себя Bifidobacterium breve, и к смеси неперевариваемых углеводов для грудных детей на негрудном или частично грудном вскармливании, а также к его применению для лечения или предотвращения иммунных нарушений у грудных детей на негрудном или частично грудном вскармливании. Международный патент WO 2005/039597 относится к применению кислого олигосахарида и нейтрального олигосахарида для усиления иммунной системы и для лечения и/или предотвращения нарушений, связанных с иммунной системой. Международный патент WO 01/642255 имеет отношение к пищевой композиции, включающей в себя пребиотик для усиления иммунного ответа. Международные патенты WO 2004/0938998 и WO 2004/0938999 имеют отношение к иммуномодуляторным продуктам, полученным из культуры Bifidobacterium.

Значительные усилия направлены на обнаружение новых растворов для баланса и стимулирования иммунной системы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация i) продукта, полученного при инкубировании водного субстрата с бифидобактериями, где субстрат представляет собой один субстрат, выбранный по меньшей мере из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу, и последующего инактивирования бифидобактерий путем нагревания инкубированной смеси и/или путем удаления клеток бифидобактерий из инкубированной смеси путем центрифугирования и/или фильтрации, и ii) по меньшей мере двух различных неперевариваемых углеводов, где по меньшей мере один, предпочтительно два углевода, выбирают из группы, включающей в себя фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды, арабиноолигосахариды, маннанолигосахариды, ксилоолигосахариды, фукоолигосахариды, арабиногалактоолигосахариды, глюкоманноолигосахариды, галактоманноолигосахариды, рафинозу, лактосахарозу, олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, синергически стимулируют иммунную систему. Обнаружили, что настоящий препарат, т.е. препарат, включающий в себя комбинацию, которая описана выше, уменьшал Th2-ответ и/или увеличивал Th1-ответ. Наблюдаемый эффект был неожиданно выше, чем сумма эффектов отдельных компонентов.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили более сильный эффект в двух различных экспериментальных моделях на животных. Увеличенный ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа, характерной для повышенного Th1-ответа, наблюдали после вакцинации вакциной от гриппа у животных, получавших настоящий препарат, по сравнению с животными, получавшими отдельные компоненты. Комбинация продукта, полученного при инкубировании субстрата с бифидобактериями, и продукта, полученного при инкубировании со стрептококками, с добавлением двух неперевариваемых углеводов давала, в результате, еще более высокий ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Сниженный ответ в реакции гиперчувствительности немедленного типа, характерный для сниженного Th2-ответа, наблюдали после воздействия аллергена через легкие у животных, получавших настоящий препарат, по сравнению с животными, получавшими отдельные компоненты.

Синергический эффект комбинации инградиентов i) и ii), как описано выше, является неожиданным. Он не может быть объяснен симбиотическим эффектом, при котором неперевариваемые углеводы (ii)) специфически стимулируют рост полезных микроорганизмов, представленных в аналогичном препарате, поскольку живые клетки бифидобактерий не представлены в настоящем препарате. Удаление и/или инактивация живых клеток бифидобактерий характеризуется тем преимуществом, что препарат может быть пастеризован и/или стерилизован, и поэтому снижается возможность загрязнения вредными микроорганизмами. Данное преимущество особенно благоприятно для грудных детей, поскольку младенцы имеют повышенную кишечную проницаемость. Кроме того, поскольку бифидобактерии удаляют или инактивируют, сами они не могут являться причиной инфекций.

Другое преимущество заключается в том, что можно лучше контролировать дозу биологически активных компонентов, получаемых каждым субъектом. Также хранение продукта преимущественно является более простым и менее затратным. Кроме того, преимущественно не происходит постокисления в сохраняемых продуктах, что позволяет избежать побочных эффектов, связанных с коагуляцией белков, и неприятного вкуса. Еще одно преимущество заключается в том, что инактивированные и/или удаленные бифидобактерии больше не расщепляют и не потребляют неперевариваемые углеводы.

Настоящий препарат особенно эффективен для субъектов, демонстрирующих сниженный Th1-ответ по сравнению со здоровыми взрослыми, в особенности для новорожденных детей, пожилых людей, страдающих от старения иммунной системы, для субъектов, страдающих от СПИДа или инфицированных вирусом иммунодефицита человека, и для раковых пациентов, которые подвергаются или подвергались химиотерапии, облучению, и для раковых пациентов с кахексией. Настоящий препарат особенно эффективен для лечения и/или профилактики заболеваний, которые могут быть предотвращены и/или вылечены путем уменьшения Th2-ответа, в особенности для аллергии, атопического дерматита, астмы, пищевой аллергии, аллергического ринита (например, аллергия на пыльцу), аллергии на пылевого клеща и других форм гиперчувствительности, таких как общая анафилактическая реакция и острая крапивница. Настоящий препарат применим для лечения и/или профилактики инфекций и/или для поддержания ответа на вакцинацию до, во время и/или после вакцинации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение имеет отношение к способу производства препарата, включающему в себя стадии a: инкубирования водного субстрата с бифидобактериями, где субстрат включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу, для получения инкубационной смеси; b: инактивирование бифидобактерий с помощью нагревания инкубационной смеси и/или удаления клеток бифидобактерий из инкубационной смеси с помощью центрифугирования и/или фильтрования; и c: комбинирование композиции, содержащей смесь, полученную на стадии a, или полученную на стадии b, предпочтительно полученную на стадии b по меньшей мере с двумя различными неперевариваемыми углеводами, где по меньшей мере один, предпочтительно два углевода выбирают из группы, включающей в себя фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды, арабиноолигосахариды, маннанолигосахариды, ксилоолигосахариды, фукоолигосахариды, арабиногалактоолигосахариды, глюкоманноолигосахариды, галактоманноолигосахариды, раффинозу, лактосахарозу, олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту.

В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к препарату, получаемому по способу, согласно настоящему изобретению. В одном воплощении изобретение имеет отношение к питательной композиции, включающей в себя или состоящей из препарата, полученного по способу, согласно настоящему изобретению.

Изобретение также имеет отношение к способу лечения и/или профилактики заболевания у млекопитающего, указанный способ включает в себя введение настоящего препарата млекопитающему. Изобретение также имеет отношение к способу для предоставления питания для грудного ребенка, указанный способ включает в себя введение настоящего препарата или питательной композиции, содержащей настоящий препарат, грудному ребенку.

Способ, включающий в себя инкубирование субстрата с бифидобактериями

Настоящее изобретение имеет отношение к препарату, получаемому или полученному с помощью инкубирования водного субстрата с бифидобактериями, где водный субстрат включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу (в дальнейшем обозначаемого как стадия (a)). Инкубационную смесь, полученную или получаемую на стадии (a), подвергают стадии (b), включающей в себя стадию инактивации с помощью тепловой обработки и/или стадию удаления клеток бифидобактерий с помощью центрифугирования и/или фильтрования. Стадию (b) проводят, чтобы уменьшить количество живых бифидобактерий в препарате, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%.

В одном воплощении стадия инкубирования включает в себя стадию ферментации и/или стадию биоконверсии. Во время ферментации водный субстрат ферментируется бифидобактериями. Во время биоконверсии водный субстрат подвергается биоконверсии под действием бифидобактерий.

Препарат, полученный или получаемый с помощью (в дальнейшем в любом месте, где упоминается только "полученный", также подразумевается "получаемый") настоящего способа, предпочтительно включает в себя фрагменты бактериальных клеток, такие как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (LTA), липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды. Указанные фрагменты вызывают иммунный ответ. Преимуществом является применение продукта, полученного путем инкубирования водного субстрата, содержащего по меньшей мере один субстрат из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу с бифидобактериями и с последующим инакивированием и/или удалением бифидобактерий, поскольку присутствие бифидобактерий будет давать, в результате, более высокую концентрацию фрагментов бактериальных клеток. После инкубирования водного субстрата с бифидобактериями могут образоваться дополнительные биоактивные компоненты, такие как органические кислоты, биологически активные пептиды и/или олигосахариды, которые стимулируют иммунную систему. Если используют коммерческие препараты пробиотиков, пробиотические бактериальные клетки обычно отмывают и выделяют из водной ростовой среды, которая содержит фрагменты бактериальных клеток, тем самым значительно уменьшая или даже удаляя супернатант инкубированного субстрата, содержащий фрагменты бактериальных клеток. В настоящем изобретении указанного уменьшения не происходит. Присутствие интактных клеток (живых или убитых) не является необходимым для иммунного ответа; водный субстрат сам по себе после настоящей стадии инкубирования с бифидобактериями уже обладает положительными эффектами на иммунную систему.

Бифидобактерии

Бифидобактерии, применяемые в настоящем способе, предпочтительно предоставлены в виде моно- или смешанной культуры. Бифидобактерии представляют собой грамположительные, анаэробные, палочковидные, продуцирующие молочную кислоту бактерии. Настоящие виды Bifidobacterium предпочтительно характеризуются по меньшей мере 95% идентичности последовательности 16 S рРНК при сравнении с типовым штаммом соответствующих видов Bifidobacterium, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности, как описано в руководствах по данному вопросу, например Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Используемые предпочтительно бифидобактерии также описаны Scardovi, V. Genus Bifidobacterium, p.1418-p.1434. В: Bergey's manual of systematic Bacteriology. Vol.2. Sneath, P.H.A., N.S. Mair, M.E. Sharpe and J.G. Holt (ed.). Balti более: Williams & Wilkins. 1986. 635 p. Предпочтительно бифидобактерии, используемые для получения настоящего препарата, представляют собой по меньшей мере один вид Bifidobacterium, выбранный из группы, включающей в себя B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. thermophilum, B. gallicum, B. animalis или lactis, B. angulatum, B. pseudocatenulatum, B. thermacidophilum и B. longum, более предпочтительно B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. longum, более предпочтительно B. longum и B. breve, еще более предпочтительно B. breve, наиболее предпочтительно B. breve 1-2219, депонированный в CNCM в Париже, Франция. B. breve CNCM 1-2219 депонирован в рамках Будапештского соглашения в Национальную коллекцию микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция, 31 мая 1999 компанией Gervais Danone. Данный штамм описан в международной патентной заявке WO 2004/093899.

Предпочтительно композиция также включает в себя продукт, полученный с помощью инкубирования водного субстрата, включающего в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, казеин, гидролизат казеина и лактозу, предпочтительно из группы молочной сыворотки и лактозы, со стрептококками, и предпочтительно с помощью последующего инактивирования и/или удаления стрептококков. Стрептококки представляют собой грамположительные, анаэробные, сферической формы бактерии, продуцирующие молочную кислоту. Виды Streptococcus предпочтительно характеризуются по меньшей мере 95% идентичности последовательности рРНК 16 S при сравнении с типовым штаммом соответствующих видов Streptococcus, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности, как определено в руководствах по данному вопросу, например, Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Предпочтительно производство продукта, получаемого путем инкубирования водного субстрата со стрептококками с последующим инактивированием стрептококков выполняют с видами Streptococcus, выбранными из группы, включающей в себя S. salivarius и S. thermophilus, более предпочтительно S. thermophilus, еще более предпочтительно штамм S. thermophilus CNCM 1-1620 или штамм CNCM 1-1470, наиболее предпочтительно штамм CNCN 1-1620. S. thermophilus CNCM 1-1620 и 1-1470 успешно продуцируют в больших количествах бета-галактозидазу. S. thermophilus CNCM 1-1620 депонирован в рамках Будапештского соглашения в Национальную коллекцию микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция 23 августа 1995 компанией Gervais Danone. S. thermophilus CNCM 1-1470 депонирован в рамках Будапештского соглашения в Национальную коллекцию микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция 25 августа 1994 компанией Gervais Danone. Указанные штаммы описаны в европейской патентной заявке EP 778885.

Стадия процесса a) инкубирование водного субстрата

Стадию (a) предпочтительно осуществляют с помощью:

a1 посева бифидобактерий в водный субстрат в количестве от 1×10² до 1×10¹¹ КОЕ бифидобактерий/мл, указанный водный субстрат характеризуется значением pH от 4 до 8 и включает в себя по меньшей мере один субстрат, выбранный из группы, включающей в себя молоко, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу,

a2 инкубирования указанных бифидобактерий в указанной водной среде, в аэробных или анаэробных условиях и при температуре от 20°C до 50°C в течение по меньшей мере 2 часов.

Водный субстрат, который инкубируют с бифидобактериями, включает в себя по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два субстрата, выбранные из группы, включающей в себя молоко, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, гидролизат казеина и лактозу. Предпочтительно субстрат не содержит интактный казеин. Обнаружили, что образовывались менее иммуностимулирующие субстанции, если водный субстрат содержал в больших количествах интактный казеин. Таким образом, водный субстрат включает в себя предпочтительно менее 25 г/л казеина, более предпочтительно менее 15 г/л, еще более предпочтительно менее 5 г/л, наиболее предпочтительно менее 1 г/л интактного казеина. Водный субстрат, таким образом, еще более предпочтительно включает в себя молочную сыворотку и/или белок молочной сыворотки, и/или гидролизат белка молочной сыворотки.

Молоко может представлять собой цельное молоко, полуобезжиренное молоко и/или обезжиренное молоко. Предпочтительно используют обезжиренное молоко. Молочная сыворотка может представлять собой сладкую молочную сыворотку, кислую молочную сыворотку или молочную сыворотку, из которой удален казеин, например, с помощью фильтрования, или пермеат молочной сыворотки. Предпочтительно молочная сыворотка представлена в концентрации 3-80 г сухого веса на литр (л) водного субстрата, более предпочтительно 40-60 г на л. Предпочтительно используют концентрат белка молочной сыворотки. Предпочтительно используют гидролизат белка молочной сыворотки, который представлен в количестве 2-80 г сухого веса на л водного субстрата, более предпочтительно 5-15 г/л. Предпочтительно лактоза представлена в количестве 5-50 г сухого веса на л водного субстрата, более предпочтительно 1-30 г/л. Предпочтительно водный субстрат включает в себя буферные соли, чтобы обеспечить значение pH в пределах желаемого диапазона. Предпочтительно в качестве буферной соли используют дигидрофосфат натрия или калия, предпочтительно в количестве от 0,5 до 5 г/л, более предпочтительно от 1,5 до 3 г на литр. Предпочтительно, водный субстрат включает в себя цистеин в количестве от 0,1 до 0,5 г на литр водного субстрата, более предпочтительно от 0,2 до 0,4 г/л. Присутствие цистеина дает в результате низкий окислительно-восстановительный потенциал субстрата, который благоприятен для активности бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в частности для бифидобактерий. Предпочтительно водный субстрат включает в себя дрожжевой экстракт в количестве от 0,5 до 5 г/л водного субстрата, более предпочтительно от 1,5 до 3 г/л. Дрожжевой экстракт является богатым источником кофакторов ферментов и факторов роста для бактерий, продуцирующих молочную кислоту. Присутствие дрожжевого экстракта усиливает биоконверсию и/или фермантацию с помощью бифидобактерий.

Предпочтительно водный субстрат, который инкубируют, включает в себя высокую концентрацию твердых частиц, предпочтительно больше 20% масс. твердых частиц на основании объема, более предпочтительно больше 40% масс. твердых частиц. Высокая концентрация эффективна при выполнении дальнейших стадий обработки, таких как, например, сушка распылением, центрифугирование или фильтрование.

Соответственно, водный субстрат пастеризуют перед стадией инкубирования, чтобы устранить присутствие нежелательных живых бактерий. Продукт пастеризуют после инкубации, чтобы инактивировать ферменты. Инактивация ферментов соответственно происходит при 75°C в течение 1 мин. Соответственно, инактивация ферментов проходит при 75°C в течение 3 мин. Соответственно, водный субстрат гомогенизируют до и/или после стадии инкубирования. Гомогенизация дает в результате более стабильный продукт, особенно в присутствии жира (липидов).

Плотность инокуляции составляет предпочтительно 1×10²-1×10¹¹, предпочтительно 1×10⁴-1×10¹⁰ КОЕ бифидобактерий на мл водного субстрата, более предпочтительно 1×10⁷-1×10⁹ КОЕ бифидобактерий/мл водного субстрата. Способы получения концентрированной стартовой культуры бифидобактерий, которую инокулируют в водный субстрат, известны в данной области техники. Конечная плотность бифидобактерий после инкубации составляет предпочтительно от 1×10³ до 1×10¹¹, более предпочтительно от 1×10⁴ до 1×10⁹ КОЕ/мл водного субстрата.

Инкубацию с бифидобактериями предпочтительно осуществляют при температуре приблизительно от 20°C до 50°C, более предпочтительно от 30°C до 45°C, еще более предпочтительно приблизительно от 37°C до 42°C. Оптимальная температура для роста и/или активности бифидобактерий составляет 37°C-42C.

Инкубация с бифидобактериями происходит предпочтительно в анаэробных условиях, поскольку рост бифидобактерий и ферментативная активность многих ферментов бифидобактерий уменьшается в аэробных условиях. Однако ацидификация не всегда желательна. Таким образом, в одном воплощении стадия инкубирования соответственно происходит в аэробных условиях.

Инкубацию с бифидобактериями предпочтительно осуществляют при значении pH от 4 до 8, более предпочтительно от 5,6 до 7,5, еще более предпочтительно от 6 до 7,5. Указанное значение pH не вызывает осаждения белка и/или неприятного вкуса, в то же время бифидобактерии могут взаимодействовать с водным субстратом.

Время инкубации составляет предпочтительно по меньшей мере 2 часа, предпочтительно от 4 до 48 часов, более предпочтительно от 6 до 24 часов, еще более предпочтительно от 6 до 15 часов. Достаточно длительное время инкубации обеспечивает взаимодействие между бифидобактериями и водным субстратом и/или продукцию клеточных фрагментов, таких как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (LTA), липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды, которые происходят в большом объеме, хотя время инкубации не должно быть чрезмерно большим по экономическим причинам.

Способы инактивации и/или физического удаления живых клеток бифидобактерий

На стадии (b) настоящего способа живые клетки бифидобактерий после инкубирования на стадии a) предпочтительно в основном все элиминируют, например, путем инактивации с помощью тепловой обработки и/или физического удаления. Клетки предпочтительно инактивируют с помощью тепловой обработки. Предпочтительно бифидобактерии убивают нагреванием после стадии инкубирования a). Предпочтительными способами теплового уничтожения являются пастеризация, стерилизация, ультравысокотемпературная обработка, варка распылением и/или сушка распылением при таких температурах, что бифидобактерии не выживают.Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере при 50°C, более предпочтительно по меньшей мере при 65°C. Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере в течение 5 минут, более предпочтительно по меньшей мере в течение 10 минут. Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере в течение 5 минут, по меньшей мере при 50°C, более предпочтительно по меньшей мере в течение 10 минут, по меньшей мере при 65°C. Тепловую обработку предпочтительно осуществляют по меньшей мере в течение 1 минуты при 75°C, более предпочтительно по меньшей мере в течение 3 минут при 75°C.

Предпочтительно интактные клетки бифидобактерий убирают из инкубированного продукта путем физического удаления, такого как фильтрация и/или центрифугирование, например центрифугирование в течение 1 часа при 3000 g, при этом интактные клетки остаются в осадке или в ретентате и продукт, полученный при инкубировании молока и/или субстрата, полученного из молока, с бифидобактериями и последующем инактивировании клеточных фрагментов бифидобактерий, остается в супернатанте и/или фильтрате, соответственно. Тепловая инактивация и/или физическое удаление живых клеток являются такими, что количество живых бифидобактерий после обработки является ниже предела обнаружения, используемого в общепринятых методах пластинчатого посева, известных в данной области техники. Указанный предел обнаружения составляет менее 10⁴ КОЕ живых клеток бифидобактерий, исходя из г сухого веса композиции, более предпочтительно менее 10³ КОЕ/г.Предпочтительно стадия тепловой инактивации и/или удаления представляет собой такую стадию, что по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 99% клеток, представленных в инкубационной смеси после стадии a), устраняется.

Требование инактивации живых клеток обладает тем преимуществом, что после получения конечная питательная композиция может быть пастеризована и/или стерилизована, и, следовательно, уменьшается вероятность заражения вредными микроорганизмами. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет жидкую, готовую к применению композицию, которую можно приготовить и хранить при комнатной температуре. Кроме того, проще контролировать дозу биоактивных компонентов, получаемых каждым субъектом, поскольку не происходит дальнейшего роста ни в жидком продукте, ни в кишечнике человека. Последнее из названного является переменным фактором, зависящим от кишечной среды субъекта, и, таким образом, приводит к изменениям в степени выраженности полезных эффектов у отдельных субъектов. Еще одно преимущество заключается в том, что инактивированные и/или удаленные бифидобактерии и стрептококки уже не могут расщеплять и потреблять неперевариваемые углеводы.

Дополнительные преимущества заключаются в том, что хранение питательной композиции является более простым и менее затратным, поскольку не нужно предпринимать специальных мер предосторожности для поддержания жизнеспособности бифидобактерий на приемлемом уровне. Данное утверждение особенно верно для продуктов с водной активностью выше 0,3. Также не происходит пост-окисления в сохраняемых продуктах с высокой водной активностью и/или в порошкообразных пищевых композициях в период после восстановления водой и перед употреблением. Таким способом избегают неблагоприятных эффектов, имеющих отношение к коагуляции белков и неприятному вкусу.

Внесение дополнительных компонентов и другие дополнительные стадии способа

По желанию одна или более нижеследующих стадий могут следовать за упомянутой выше стадией способа b):

i) Ультрафильтрование продукта после инкубации через фильтрующие мембраны, характеризующиеся порогом отсечения 100 - 300 кДа, для получения концентрированного ретентата. Мембраны представляют собой предпочтительно полиэфирсульфоновые мембраны, и фильтрование осуществляют предпочтительно при температуре ниже 60°C.

ii) Отмывание концентрированного ретентата водой.

iii) Дегидрирование концентрированного ретентата, предпочтительно, с помощью лиофилизации.

iv) Растворение дегидрированного ретентата в буфере, предпочтительно в Трис-буфере со значением pH 6-8.

v) Проведение эксклюзионной гель-хроматографии раствора ретентата на колонке, характеризующейся порогом исключения 600 кДа, предпочтительно на колонке с декстраном или агарозой, такой как Superdex^® 200.

vi) Восстановление отфильтрованной или исключенной фракции в конце хроматографии.

vii) Обессоливание продукта с помощью мембраны с пороговым значением 10 кДа. Восстановление исключенной фракции в конце хроматографии.

Указанные стадии предпочтительно выполняют в стерильных условиях. Дополнительные ингредиенты, которые могут быть полезны для получения желаемой заключительной питательной композиции, могут быть добавлены после стадии способа a), предпочтительно непосредственно перед стадией b) или после стадии b) способа. Предпочтительно ингредиенты добавляют после стадии b). В отношении композиции детского молока могут быть добавлены такие ингредиенты, как обезжиренное молоко, молочная сыворотка, лактоза, растительный жир, микроэлементы, витамины, которые известны в данной области техники.

Предпочтительно, водный субстрат, включающий в себя молочную сыворотку, белок молочной сыворотки и/или гидролизат белка молочной сыворотки, пастеризуют, охлаждают и инкубируют с одним или более штаммами Bifidobacterium, предпочтительно со штаммом B. breve CNCM 1-2219, после чего инкубированный продукт подвергают термообработке и сохраняют. По желанию инкубированный продукт смешивают с другими компонентами, составляя питательную композицию. Жировой компонент может быть включен или не включен в состав, но предпочтительно жировой компонент не включают в состав на данной стадии. Предпочтительно, смесь предварительно нагревают и затем добавляют жир (также в описании используют термин "липиды") в одной линии, гомогенизируют, подвергают термообработке и высушивают.

Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта настоящего изобретения раскрыт в международном патенте WO 01/01785, более конкретно - в примерах 1 и 2. Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта по настоящему изобретению описан в международном патенте WO 2004/093899, более конкретно - в примере 1.

Предпочтительно конечная питательная композиция включает в себя от 5 до 100% масс., исходя из сухого веса препарата, полученного на стадии b, более предпочтительно от 5 до 99,5% масс., более предпочтительно от 5 до 95% масс., еще более предпочтительно от 5 до 80% масс., еще более предпочтительно от 5 до 40% масс., наиболее предпочтительно от 10 до 40% масс. Предпочтительно, конечная питательная композиция включает в себя от 0,5 до 20% масс. продукта, полученного на стадии b, на 100 мл, более предпочтительно от 0,5 до 14% масс., более предпочтительно от 1 до 10% масс., еще более предпочтительно от 1 до 5% масс. на 100 мл.

Предпочтительно настоящая конечная питательная композиция включает в себя инактивированные бифидобактерии и/или бактериальные фрагменты бифидобактерий, полученные более чем из 1×10³ КОЕ бифидобактерий на г исходя из сухого веса конечной композиции, более предпочтительно более чем из 1×10⁴ КОЕ, еще более предпочтительно более чем из 1×10⁵ КОЕ. Предпочтительно инактивированные бифидобактерии и/или бактериальные фрагменты бифидобактерий получают менее чем из 1×10¹¹ КОЕ бифидобактерии на г, исходя из сухого веса конечной композиции, более предпочтительно менее чем из 1×10¹⁰ КОЕ, еще более предпочтительно менее чем из 1×10⁹ КОЕ. Указанные значения могут быть рассчитаны путем определения количества бифидобактерий в смеси после инкубации как количество бифидобактерий на стадии a) и перед стадией b), с последующим пересчетом на количество грамм настоящего препарата, представленного в конечной композиции, исходя из ее сухого веса.

Дополнительные ингредиенты, которые могут быть полезны для получения желаемой конечной питательной композиции, могут быть добавлены после стадии a) или b) способа. Предпочтительно дополнительные ингредиенты добавляют после стадии a). В отношении композиции детского молока, могут быть добавлены такие ингредиенты, как обезжиренное молоко, молочная сыворотка, лактоза, растительный жир, микроэлементы, витамины, которые известны в данной области техники. Предпочтительно способ включает в себя дополнительные стадии

d: инкубирование субстрата с Streptococcus thermophilus, предпочтительно со штаммом S. thermophilus CNCM 1-1620 или со штаммом CNCM 1-1470, где субстрат выбран из группы, включающей в себя молоко, белок молока, молочную сыворотку, белок молочной сыворотки, гидролизат белка молочной сыворотки, казеин, гидролизат казеина и лактозу для получения инкубационной смеси, и

e: инактивирование S. thermophilus с помощью нагревания инкубационной смеси стадии e и/или удаления клеток S. thermophilus из инкубационной смеси стадии e с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Стадию e и b предпочтительно осуществляют одновременно. Предпочтительно интактные клетки стрептококков удаляют из инкубированного продукта путем физического удаления, такого как фильтрация и/или центрифугирование, например центрифугирование в течение 1 часа при 3000 g, при этом интактные клетки остаются в осадке или в ретентате, и продукт, полученный при инкубировании молока и/или субстрата, полученного из молока, со стрептококками и последующем инактивировании клеточных фрагментов стрептококков, остается в супернатанте и/или фильтрате соответственно.

Тепловая инактивация и/или физическое удаление живых клеток являются такими, что количество живых стрептококков после обработки является ниже предела обнаружения, используемого в общепринятых методах пластинчатого посева, известных в данной области техники. Указанный предел обнаружения составляет менее 10⁴ КОЕ живых клеток стрептококков, исходя из г сухого веса композиции, более предпочтительно меньше 10³ КОЕ/г. Таким образом, предпочтительно в одном воплощении согласно изобретению препарат после стадии e включает в себя меньше 10³ КОЕ живых стрептококков на г сухого веса препарата. Предпочтительно стадия тепловой инактивации и/или удаления является такой стадией, что по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 99% клеток, представленных в инкубационной смеси после стадии d), устраняется.

Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта со штаммами S. thermophilus по настоящему изобретению раскрыт в европейской патентной заявке EP 0778885, более конкретно - в примерах 5 и 6. Другой предпочтительный способ получения инкубированного продукта со штаммами S. thermophilus по настоящему изобретению раскрыт в патентной заявке FR2723960, в примерах 2-6.

Предпочтительно, водный субстрат, включающий в себя молочную сыворотку, белок молочной сыворотки и/или гидролизат белка молочной сыворотки, пастеризуют, охлаждают и инкубируют с одним или более штаммами Bifidobacterium, предпочтительно со штаммом B. breve CNCM 1-2219, после чего инкубированный продукт подвергают тепловой обработке и сохраняют. Предпочтительно второй водный субстрат, включающий в себя молочную сыворотку и/или лактозу, инкубируют с S. thermophilus, предпочтительно со штаммом CNCM 1-1620 или со штаммом CNCM 1-1470. Затем два инкубированных продукта предпочтительно смешивают друг с другом и смешивают с другими компонентами, дополняющими питательную композицию. Жировой компонент может быть включен или не включен в состав, но предпочтительно жировой компонент еще не включают в состав на данной стадии. Предпочтительно, смесь предварительно нагревают и затем добавляют жир (также в описании используют термин “липиды”) на одной линии, гомогенизируют, подвергают тепловой обработке и высушивают.

Стадия инкубирования d может быть осуществлена одновременно со стадией инкубирования с бифидобактериями на стадии a. Предпочтительно инкубацию с S. thermophilus осуществляют на стадии способа отдельно от инкубации с бифидобактериями. Раздельное инкубирование обеспечивает оптимальные условия для каждого вида различных бактерий и/или предотвращает нежелательное взаимодействие различных бактерий с высвобождаемыми иммуностимулирующими компонентами. Предпочтительно инкубационную смесь, полученную после инкубации субстрата со стрептококками, добавляют к смеси, полученной на стадии a, стадии b или стадии c, более предпочтительно после стадии a). Улучшенный эффект на реакцию гиперчувствительности замедленного типа наблюдают, если настоящая композиция содержит также смесь, полученную после инкубирования с S. thermophilus. Таким образом, в одном воплощении способ в соответствии с изобретением включает в себя дополнительную стадию: f: объединение инкубационной смеси, полученной на стадии d или e, предпочтительно стадии d, с инкубационной смесью, полученной на стадии a, b или c, предпочтительно на стадии a. В одном воплощении инкубационную смесь, полученную на стадии d, соединяют с инкубационной смесью, полученной на стадии a, и стадии b и e осуществляют одновременно.

Предпочтительно конечная питательная композиция включает в себя от 2 до 94,5% исходя из сухого веса препарата, полученного с помощью стадии d, более предпочтительно от 5 до 80% масс., еще более предпочтительно от 5 до 40% масс. Предпочтительно, конечная питательная композиция включает в себя от 0,2 до 20% масс. продукта, полученного с помощью стадии d, на 100 мл, более предпочтительно от 0,5 до 14% масс., более предпочтительно от 1 до 10% масс., еще