Иммунологические тесты на активность эндопептидаз с измененной нацеленностью

Иммунологические тесты на активность эндопептидаз с измененной нацеленностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[01] Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет в соответствии с §119(е) раздела 35 Свода законов США согласно предварительной заявке на патент США №61/160217, поданной 13 марта 2009 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[02] Последовательности, охарактеризованные в настоящем описании, приведены в перечне последовательностей, поданном совместно с настоящей заявкой, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[03] Способность токсинов клостридий, таких как, например, ботулинические нейротоксины (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G, и столбнячный нейротоксин (ТеМТ), ингибировать нейронную передачу сигнала находит широкое применение в терапии и косметологии, см., например, William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004). Токсины клостридий, коммерчески доступные в форме фармацевтических композиций, включают препараты BoNT/A, такие как, например, ВОТОХ^® (Allergan, Inc., Ирвин, Калифорния), DYSPORT^®/RELOXIN^® (Ipsen Ltd., Слау, Англия), PURTOX^® (Mentor Corp., Санта-Барбара, Калифорния), XEOMIN^® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Франкфурт, Германия), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Очанг-миеон, Южная Корея), ВТХ-А (Biogen-tech Ltd., University, Яньтай, Шаньдун, Китай); и препараты BoNT/B, такие как, например, MYOBLOC^®/NEL)ROBLOC® (Solstice Neurosciences, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния). Например, ВОТОХ^® в настоящее время одобрен в одной или нескольких странах для следующих показаний: ахалазия, мышечная спластичность у взрослых, анальные трещины, боль в спине, блефароспазм, бруксизм, шейная дистония, эссенциальный тремор, межбровные морщины или гиперкинетические лицевые морщины, головная боль, гемифациальный спазм, гиперактивность мочевого пузыря, повышенное потоотделение, детский церебральный паралич, рассеянный склероз, миоклонические нарушения, носогубные морщины, спастическая дисфония, косоглазие и поражение VII нерва.

[04] Обработка токсином клостридий приводит к ингибированию высвобождения нейромедиаторов и нейропептидов путем нарушения процесса экзоцитоза, с помощью которого осуществляется секреция нейромедиаторов и нейропептидов в синаптическую щель. Фармацевтическая промышленность стремится расширить терапевтическое применение токсина клостридий за пределы нынешнего использования в качестве миорелаксанта и применять его для лечения заболеваний, связанных с сенсорными нервами, таких как, например, различные виды хронической боли, нейрогенного воспаления и урогенитальных нарушений, а также других заболеваний, таких как, например, панкреатит. Один подход, используемый в настоящее время для расширения сферы применения способов лечения на основе токсина клостридий, включает модификацию токсина клостридий, в результате которой модифицированный токсин обладает измененной нацеленностью по отношению к нервным или не относящимся к нервным клеткам, представляющим интерес. Эти молекулы, называемые эндопептидазами с измененной нацеленностью или белками-модуляторами направленного везикулярного экзоцитоза (TVEMP), осуществляют свое ингибирующее действие в отношении экзоцитоза, используя рецептор-мишень, который присутствует на нервных или не относящихся к нервным клетках-мишенях, представляющих интерес. Такое изменение специфичности по отношению к клеткам-мишеням достигается за счет замены природного домена связывания токсина клостридий на нацеливающий домен, который демонстрирует избирательную связывающую активность по отношению к рецептору, отличному от рецептора токсина клостридий и присутствующему на нервных или не относящихся к нервным клетках-мишенях, представляющих интерес. Такие модификации домена связывания приводят к тому, что молекула приобретает способность избирательно связывать рецептор, отличный от рецептора токсина клостридий и присутствующий на клетках-мишенях. Эндопептидаза с измененной нацеленностью способна связываться с рецептором-мишенью, перемещаться в цитоплазму и проявлять свой протеолитический эффект по отношению к комплексу SNARE нервных или не относящихся к нервным клеток-мишеней, представляющих интерес.

[05] Одна группа эндопептидаз с измененной нацеленностью включает молекулы, имеющие домен связывания с опиоидными рецепторами. Эти эндопептидазы с измененной опиоидной нацеленностью включают домен связывания с опиоидными рецепторами, транслокационный домен токсина клостридий и ферментативный домен токсина клостридий. Неограничивающие примеры эндопептидаз с измененной опиоидной нацеленностью или опиоидно-TVEMP описаны, например, в Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, патенте США 5989545; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, патенте США 7132259; Stephan Donovan, Closthdial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, патенте США 7244437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, патенте США 7413742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, патенте США 7415338; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, патенте США 7514088; Keith A. Foster, Fusion Proteins, публикации заявки на патент США 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, публикации заявки на патент США 2009/0035822; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, публикации заявки на патент США 2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, публикации заявки на патент США 2009/0162341; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, публикации международной заявки WO 2005/023309; и Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Closthdial Toxin Target Cells, публикации международной заявки WO 2008/008805; содержание каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[06] Одно из главных различий между эндопептидазами с измененной нацеленностью и токсинами клостридий заключается в том, что поскольку мотонейроны обычно не являются мишенями эндопептидаз с измененной нацеленностью, смертность, связанная с превышением дозы эндопептидаз с измененной нацеленностью, у млекопитающих значительно снижена или даже полностью исключена. Например, эндопептидазы с измененной опиоидной нацеленностью можно ввести в дозе, превышающей терапевтически эффективную дозу в 10000 раз без проявления свидетельств летальности, которая в данном случае является результатом пассивной диффузии молекулы, а не процесса интоксикации. Таким образом, эндопептидазы с измененной нацеленностью представляют собой нелетальные молекулы при любых практических применениях. Хотя это свойство отсутствия летальности имеет большие преимущества для применения в терапии, возникает проблема, связанная с производством, поскольку стандартным тестом на активность, используемым в производстве биопрепаратов на основе токсина клостридий, является биотест ЛД₅₀ на мышах, тест на летальность. S.S.Arnon et al., JAMA 285: 1059-1070 (2001). В настоящее время биотест ЛД₅₀ на мышах используется всеми производителями фармацевтической продукции для выражения активности их препаратов на основе токсина клостридий. Фактически, единицы активности токсинов клостридий представляют собой единицы ЛД₅₀ у мышей. Однако, вследствие того, что эндопептидазы с измененной нацеленностью по существу нелегальны, биотест ЛД₅₀ на мышах нельзя использовать для оценки активности этих молекул. Таким образом, простой, надежный, проверенный и приемлемый с точки зрения государственных органов тест на активность, позволяющий оценить надежность всех этапов, необходимых для поглощения эндопептидазы с измененной нацеленностью, имел бы значительную ценность.

[07] Согласно настоящей заявке предложены новые композиции, клетки и способы для оценки активности эндопептидаз с измененной нацеленностью, подходящие для применения в различных отраслях промышленности, таких как, например, фармацевтическая и пищевая промышленность, с обеспечением связанных с этим преимуществ. Эти композиции, клетки и способы не предполагают использования живых животных или тканей, взятых у живых животных, но позволяют оценить все этапы, необходимые для действия эндопептидаз с измененной нацеленностью.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[08] На ФИГ.1 показана схема современной парадигмы высвобождения нейромедиатора и токсического действия токсина клостридий в центральном и периферическом нейроне. На ФИГ.1А показана схема механизма высвобождения нейромедиатора в центральном и периферическом нейроне. Процесс высвобождения можно описать как состоящий из двух этапов: 1) стыковки пузырька, при которой связанный с пузырьком белок SNARE пузырька, содержащего молекулы нейромедиатора, взаимодействует со связанными с мембраной белками SNARE, расположенными на плазматической мембране; и 2) высвобождения нейромедиатора, при котором пузырек сливается с плазматической мембраной и происходит экзоцитоз молекул нейромедиатора. На ФИГ.15 показана схема механизма токсического действия столбнячного и ботулинического токсинов в центральном и периферическом нейроне. Этот процесс интоксикации можно описать как состоящий из четырех этапов: 1) связывания рецептора, при котором токсин клостридий связывается с рецепторным комплексом клостридий и инициирует процесс интоксикации; 2) интернализации комплекса, при которой после связывания токсина происходит перенос пузырька, содержащего комплекс токсин/рецепторная система, в клетку путем эндоцитоза; 3) транслокации легкой цепи, при которой, как предполагают, имеет место множество событий, включая изменение pH внутри пузырька, формирование канала поры, включающего домен H_N тяжелой цепи токсина клостридий, разделение легкой и тяжелой цепей токсина клостридий и высвобождение легкой цепи, и 4) ферментативной модификации мишени, при которой легкая цепь токсина клостридий протеолитически расщепляет свои субстраты-мишени SNARE, такие как, например, SNAP-25, VAMP или Syntaxin, таким образом предотвращая стыковку пузырька и высвобождение нейромедиатора.

[09] На ФИГ.2 показан полнодозовый ответ на эндопептидазу с измененной нацеленностью Noc/A в клональной клеточной линии ORL-1 Clone #6 с повышенной экспрессией ORL-1. Специфичное поглощение Noc/A можно наблюдать в клональной клеточной линии ORL-1 Clone #6, сверхэкспрессирующей ORL-1. Обработка Noc/A (LHN/A плюс вариант связывающего лиганда ноцицептина) и LH_N/A (LC/A и H_N без домена связывания), проведенная на клоне №6 стабильной клеточной линии ORL-1 в тесте методом твердофазного ИФА в модификации ECL на расщепленный SNAP-25₁₉₇, продемонстрировала, что поглощение Noc/A является специфичным в этой клональной клеточной линии. Клональная клеточная линия также демонстрирует значительную чувствительность к Noc/A, характеризующуюся значением EC₅₀, равным 1,2 нМ.

[010] На ФИГ.3 показан полнодозовый ответ на Noc/A в клонах №3 и №22 SK-N-DZ, полученных из одной клетки. Специфичное поглощение Noc/A в клонах №3 и №22 SK-N-DZ по сравнению с LH_N/A (n=4 проведенных независимых эксперимента). Клетки рассевали на 96-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином, в СБС RPMI+N2+B27+NGF. Обработка веществами длилась 22 часа. Тест методом твердофазного ИФА в модификации ECL на расщепленный SNAP-25₁₉₇ продемонстрировал, что поглощение Noc/A является специфичным в этих клональных клеточных линиях. Клональные клеточные линии также демонстрируют значительную чувствительность к Noc/A, характеризующуюся значением EC₅₀, равным 0,3 нМ для клона №3 и 0,9 нМ для клона №22.

[011] На ФИГ.4 показаны результаты анализа "сэндвич"-методом твердофазного ИФА в модификации ECL на клонах 1С11, 4 В7 и 4С9 ORL1 ND7, обработанных эндопептидазой с измененной нацеленностью Noc/A. Родительские клоны ND7 и ORL1 ND7 обрабатывали Noc/A в течение 24 часов, после чего проводили инкубацию в течение двух дней. EC₅₀ для родительского ND7 невозможно было вычислить, так как расщепление SNAP-25₁₉₇ происходило лишь примерно на 50%. В клонах 4 В7 и 1С11 расщепление SNAP-25₁₉₇ происходило более чем на 80%. Вычисленные значения EC₅₀ составляли соответственно 5,7±0,5, 6,7±1 и 8,6±2 нМ.

[012] На ФИГ.5 показано, что поликлональные антитела против ноцицептина способны блокировать поглощение эндопептидазы с измененной нацеленностью Noc/A в клеточных линиях клона №3, клона №22 SK-N-DZ и клона №6 AGN Р33 ORL-1. Клетки рассевали на 96-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином, в СБС RPMI+N2+B27+NGF и обрабатывали в течение 22 часов средой без сыворотки, содержащей поликлональные антитела против ноцицептина в различных разбавлениях (0-3 мкг/мл) в 1 нМ Noc/A.

[013] На ФИГ. 6 показаны клетки клона AF4 SiMa и стабильной клеточной линии PC-12, обработанные эндопептидазой с измененной нацеленностью Dyn/A в концентрации от 0,017 нМ до 1 мкМ, как представлено на изображении Вестерн блота. У обеих клеточных линий наблюдали дозозависимое поглощение.

[014] На ФИГ. 7 показаны нормированные кривые анализа методом поверхностного плазмонного резонанса SPR BIAcore с использованием 7,8 нМ антител 2Е2А6, 1D3B8, 3С1А5 и 2С9 В10 и коммерческих МС-6050 и МС-6053. На ФИГ.7А показаны нормированные данные по скорости ассоциации для каждого антитела. На ФИГ.7Б показаны нормированные данные по скорости диссоциации для каждого антитела.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[015] Согласно настоящему изобретению предложены новые тесты для анализа присутствия или отсутствия в образце активной эндопептидазы с измененной нацеленностью и для анализа активности эндопептидазы с измененной нацеленностью. Новые клеточные тесты, описанные в настоящей заявке, основаны на клетках, реагентах и способах детектирования, благодаря которым данные тесты можно использовать для детектирования наномолярных количеств эндопептидазы с измененной нацеленностью в образце. Клеточные тесты, описанные в настоящей заявке, предназначены для анализа множественных функций эндопептидазы с измененной нацеленностью, а именно, связывания эндопептидазы с измененной нацеленностью с рецептором на поверхности клетки, интернализации комплекса эндопептидаза-рецептор, транслокации ферментативного домена в цитоплазму и расщепления субстрата ферментативным доменом. Как более подробно обсуждается ниже, новые способы и композиции можно использовать для анализа как необработанных и объединенных образцов, так и высокоочищенных двуцепочечных эндопептидаз с измененной нацеленностью и составов на основе эндопептидаз с измененной нацеленностью, а также в формате автоматизированного высокопроизводительного анализа.

[016] Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены вызывающие иммунный ответ композиции для получения анти-ЗМАР-25 антител, избирательно связывающихся с эпитопом, содержащим продукт расщепления SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A. Вызывающие иммунный ответ композиции могут включать адъювант и вызывающую иммунный ответ композицию, включая антиген SNAP-25, носитель, связанный с антигеном SNAP-25, или носитель, связанный с гибким спейсером, в свою очередь связанным с антигеном SNAP-25, где между антигеном SNAP-25 и носителем помещен гибкий линкер. Предполагается, что все без исключения антигены SNAP-25, которые вызывают иммунный ответ, приводящий к выработке анти-SNAP-25 антител, способных избирательно связываться с эпитопом SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A, могут быть пригодны в качестве антигенов SNAP-25, включая, но не ограничиваясь перечисленными: антигены SNAP-25, полученные из природного SNAP-25, антигены SNAP-25, полученные из не встречающегося в природе SNAP-25, и антигены SNAP-25, включающие иммунореактивные фрагменты SNAP-25, SNAP-25 из природного SNAP-25 или не встречающегося в природе SNAP-25. Антигены SNAP-25, пригодные для получения анти-SNAP-25 антител, способных избирательно связываться с эпитопом SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A, включают, без ограничения, антигены SNAP-25, включающие пептид SNAP-25, на С-конце которого находится карбоксилированный остаток глутамина, связанный с пептидом-носителем, включая, без ограничения, SEQ ID NO: 38. Другие вызывающие иммунный ответ композиции, пригодные для получения aHTH-SNAP-25 антител, способных избирательно связываться с эпитопом SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A, включают, без ограничения, вызывающие иммунный ответ композиции, содержащие носитель, связанный с гибким линкером, в свою очередь связанным с антигеном SNAP-25-карбоксилированным С-концевым глутамином, причем гибкий линкер помещен между антигеном SNAP-25 и носителем. Предполагается, что в такой вызывающей иммунный ответ композиции могут применяться любые адъюванты, включая, но не ограничиваясь перечисленными: полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), поливинилалкоголь (ПВА), полный и неполный адъювант Фрейнда.

[017] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены способы получения анти-SNAP-25 антител, избирательно связывающихся с эпитопом, содержащим продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку Pi разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A. Аспекты настоящего способа включают этапы (а) введения животным композиции, вызывающей иммунный ответ в отношении SNAP-25, которая описана в настоящей заявке; (б) отбор у животных образца, содержащего анти-SNAP-25 антитело или клетку, продуцирующую анти-SNAP-25 антитело; и (в) выделение анти-SNAP-25 антитела из образца. Описанные способы пригодны для получения моноклональных анти-SNAP-25 антител, избирательно связывающихся с эпитопом, содержащим продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A, или поликлональных анти-SNAP-25 антител, избирательно связывающихся с эпитопом, содержащим продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A.

[018] Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены анти-SNAP-25 антитела, избирательно связывающиеся с эпитопом, содержащим SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A. Такие анти-SNAP-25 антитела включают как природные антитела, так и не встречающиеся в природе антитела, а также моноклональные антитела или поликлональные анти-SNAP-25 антитела. Моноклональные анти-SNAP-25 антитела, пригодные в качестве анти-SNAP-25 антител, которые избирательно связываются с антигеном SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A, включают, без ограничения, моноклональные анти-SNAP-25 антитела, полученные в гибридомных клеточных линиях 1D3B8, 2С9 В10, 2Е2А6, ЗС1А5 и 3С3Е2.

[019] Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены иммунологические способы детектирования активности эндопептидаз с измененной нацеленностью. Аспекты настоящего способа включают этапы (а) обработки клетки из стабильной клеточной линии образцом, содержащим эндопептидазу с измененной нацеленностью, причем клетка из стабильной клеточной линии чувствительна к активности эндопептидазы с измененной нацеленностью; (б) выделения из обработанных клеток компонента SNAP-25, содержащего продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A; (в) приведения компонента SNAP-25 в контакт с анти-SNAP-25 антителами, описанными в настоящей заявке; и (г) детектирования присутствия комплекса антитело-антиген, включающего анти-SNAP-25 антитело и продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A; при этом детектирование с использованием комплекса антитело-антиген является показателем активности эндопептидазы с измененной нацеленностью. анти-SNAP-25 антитела с этапа (в) необязательно могут быть связаны с твердофазной подложкой.

[020] Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены иммунологические способы детектирования активности опиоидно-TVEMP. Аспекты настоящего способа включают этапы (а) обработки клетки из стабильной клеточной линии образцом, содержащим эндопептидазу с измененной нацеленностью, причем клетка из стабильной клеточной линии обладает способностью к поглощению эндопептидазы с измененной нацеленностью; (б) выделения из обработанных клеток компонента SNAP-25, содержащего SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A; (в) осуществления контакта компонента SNAP-25 с анти-SNAP-25 антителами, описанными в настоящей заявке; и (г) детектирования присутствия комплекса антитело-антиген, включающего анти-SNAP-25 антитело и SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A; при этом детектирование с использованием комплекса антитело-антиген является показателем активности эндопептидазы с измененной нацеленностью. анти-SNAP-25 антитела с этапа (в) необязательно могут быть связаны с твердофазной подложкой.

[021] Согласно дальнейшему аспекту настоящего изобретения предложены способы определения иммунной резистентности млекопитающих по отношению к эндопептидазе с измененной нацеленностью. Аспекты настоящего способа включают этапы (а) добавления эндопептидазы с измененной нацеленностью к тестируемому образцу, полученному из организма млекопитающего, исследуемого на наличие или отсутствие нейтрализующих антител против эндопептидазы с измененной нацеленностью; (б) обработки клетки из стабильной клеточной линии тестируемым образцом, причем клетка из стабильной клеточной линии чувствительна к активности эндопептидазы с измененной нацеленностью; (в) выделения из обработанных клеток компонента SNAP-25, содержащего продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку Р, разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A; (г) осуществления контакта компонента SNAP-25 с анти-SNAP-25 антителами, описанными в настоящей заявке; (д) детектирования присутствия комплекса антитело-антиген, включающего анти-SNAP-25 антитело и продукт расщепления SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A; (е) повторения этапов а-д с образцом для отрицательного контроля вместо тестируемого образца; (ж) сравнения количества комплекса антитело-антиген, детектированного на этапе (д), с количеством комплекса антитело-антиген, детектированным на этапе (е), при этом детекция меньшего количества комплекса антитело-антиген, детектированного на этапе (д), по сравнению с количеством комплекса антитело-антиген, детектированным на этапе (е), свидетельствует о присутствии нейтрализующих антител против эндопептидазы с измененной нацеленностью. Анти-SNAP-25 антитела с этапа (г) необязательно могут быть связаны с твердофазной подложкой. Контрольный образец с этапа (е) может также включать образец для положительного контроля в дополнение к образцу для отрицательного контроля.

[022] Токсины кпостридий, вырабатываемые Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Closthdium baratii и Clostridium butyn'cum, являются наиболее широко используемыми в терапевтических и косметических целях у человека и других млекопитающих. Штаммы С.botulinum вырабатывают семь иммунологически отличных серотипов ботулинических токсинов (BoNTs), которые были обнаружены при исследовании вспышек ботулизма у человека (BoNT/A, BoNT/B, BoNT/E и BoNT/F), животных (BoNT/C1 и BoNT/D) или были изолированы из почвы (BoNT/G). Хотя все семь серотипов ботулинического токсина обладают сходной структурой и биологическими свойствами, каждый из них также демонстрирует гетерогенные характеристики, такие как, например, различные фармакологические свойства. Напротив, токсин столбняка (TeNT) вырабатывает однородная группа С.tetani. Два другие вида Clostridia, С.baratii и С.butyricum, также вырабатывают токсины, подобные соответственно BoNT/F и BoNT/E.

[023] Каждый из токсинов клостридий транслируется в виде одной полицепи массой приблизительно 150 кДа, которая впоследствии протеолитически разрезается в пределах дисульфидной петли природной протеазой, такой как, например, эндогенная протеаза токсина клостридий или природной протеазой, вырабатываемой в окружающей среде. Этот посттрансляционный процессинг приводит к образованию молекулы, состоящей из двух цепей и включающей легкую цепь (LC) массой приблизительно 50 кДа и тяжелую цепь (НС) массой приблизительно 100 кДа, удерживаемые вместе единственной дисульфидной связью и нековалентными взаимодействиями. Каждая зрелая двуцепочечная молекула включает три функционально отличных домена: 1) ферментативный домен, расположенный в LC, который включает металлопротеазную область, имеющую цинк-зависимую эндопептидазную активность, специфической мишенью которой являются основные компоненты аппарата высвобождения нейромедиатора; 2) транслокационный домен, который содержится в пределах амино-концевой половины HC (H_N) и облегчает высвобождение LC из внутриклеточных пузырьков в цитоплазму клетки-мишени; и 3) связывающий домен, находящийся в пределах карбокси-концевой половины HC (H_C), который определяет связывающую активность и специфичность связывания токсина с рецепторным комплексом, расположенным на поверхности клетки-мишени.

[024] Связывающая, транслокационная и ферментативная активности этих трех функциональных доменов необходимы для токсичности. Хотя детали этого процесса еще не известны полностью, общие механизмы клеточной интоксикации, благодаря которым токсины клостридий проникают в нейрон и ингибируют высвобождение нейромедиатора, являются сходными, независимо от серотипа или подтипа. Хотя заявители не подразумевают, что настоящее описание будет ограничивать данное изобретение, механизм интоксикации можно описать как включающий по меньшей мере четыре этапа: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи и 4) ферментативная модификация мишени (ФИГ.1). Процесс начинается, когда домен НС токсина клостридий связывается с токсин-специфичной рецепторной системой, расположенной на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Специфичность связывания рецепторного комплекса, как полагают, частично обеспечивается определенными комбинациями ганглиозидов и белковых рецепторов, которые, по-видимому, включают каждый отдельный рецепторный комплекс токсина клостридий. После образования комплекса токсин/рецептор он интернализируется по механизму эндоцитоза, а интернализированные пузырьки направляются по определенным внутриклеточным маршрутам. Предполагают, что этап транслокации инициируется закислением компартмента пузырька. Этот процесс, по-видимому, инициирует важные зависимые от pH структурные перестройки, которые увеличивают гидрофобность, способствуют формированию поры и облегчают разделение тяжелых и легких цепей токсина. После разделения эндопептидаза легкой цепи токсина высвобождается из внутриклеточного пузырька в цитозоль, где, как предполагают, ее специфическими мишенями являются основные компоненты аппарата высвобождения нейромедиатора. Эти основные белки, связанный с пузырьком мембранный белок (VAMP, vesicle-associated membrane рго1ет)/синаптобревин, связанный с синаптосомой белок массой 25 кДа (SNAP-25, synaptosomal-associated protein of 25 kDa) и Синтаксин, необходимы для стыковки синаптических пузырьков и слияния в нервном окончании и являются членами семейства растворимых белковых рецепторов прикрепления N-этилмалеимид-чувствительного фактора (SNARE, soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor). BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP-25 в карбокси-концевой области, высвобождая фрагмент, состоящий соответственно из девяти или двадцати шести аминокислот, a BoNT/C1 также расщепляет SNAP-25 около карбоксильного конца, высвобождая фрагмент, состоящий из восьми аминокислот. Ботулинические серотипы BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G и токсин столбняка воздействуют на консервативную центральную часть VAMP и высвобождают амино-концевую часть VAMP в цитозоль. BoNT/C1 расщепляет синтаксин в единственном месте около поверхности цитоплазматической мембраны. Избирательный протеолиз синаптических белков SNARE приводит к блокировке высвобождения нейромедиатора, вызываемой токсинами клостридий in vivo. Мишени токсинов клостридий, белки SNARE, характерны для экзоцитоза во множестве типов клеток, не относящихся к нейронам; в этих клетках, как и в нейронах, пептидазная активность легкой цепи ингибирует экзоцитоз, см., например, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalii et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

[025] Эндопептидазы с измененной нацеленностью обычно замещают сайт расщепления природных двуцепочечных протеаз с петлевой структурой сайтом расщепления экзогенных протеаз. См., например, Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, патент США 7419676, включенный в настоящую заявку посредством ссылки. Хотя эндопептидазы с измененной нацеленностью варьируют по общей молекулярной массе из-за размера нацеливающего домена, процесс активации и его зависимость от расщепления по экзогенному сайту расщепления с образованием двуцепочечной молекулы является, по существу, тем же самым, как и для токсинов клостридий. См., например, Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, публикация заявки на патент США 2009/0005313; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Closthdial Toxin Target Cells, заявка на патент США 11/776,075; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, публикация заявки на патент США 2008/0241881, содержание каждого из которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[026] Часть аспектов настоящего описания включает вызывающую иммунный ответ композицию для получения анти-SNAP-25 антител, способных избирательно связываться со SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A. В настоящей заявке термин "вызывающая иммунный ответ композиция" относится к композиции, включающей антиген SNAP-25, которая при введении животному стимулирует иммунный ответ в отношении антигена SNAP-25, тем самым приводя к образованию анти-SNAP-25 антител, способных избирательно связываться со SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A. Термин "иммунный ответ" относится к любому ответу иммунной системы животного на вызывающую иммунный ответ композицию. Примеры иммунных ответов включают, но не ограничиваются перечисленными: клеточный, а также местный и системный гуморальный иммунитет, такие как, например, ответы цитолитических лимфоцитов, включая антиген-специфичную индукцию CD8+цитолитических лимфоцитов, ответы Т-клеток-хелперов, включая пролиферативные ответы Т-клеток и высвобождение цитокинов, и ответы В-клеток, включая, например, ответ образования антител. Термин "стимуляция иммунного ответа" относится к введению вызывающей иммунный ответ композиции или полинуклеотида, кодирующего вызывающую иммунный ответ композицию, при котором затронут иммунный ответ, т.е. он стимулируется, инициируется или индуцируется.

[027] Композиция, вызывающая иммунный ответ в отношении SNAP-25, включает антиген SNAP-25. В настоящей заявке термин "антиген" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ и включает, но не ограничивается перечисленными: пептиды, полисахариды и конъюгаты липидов, такие как, например, липопротеины и гликолипиды. В настоящей заявке термин "антиген SNAP-25" относится к любому антигену, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A, способному вызывать иммунный ответ. Антиген SNAP-25, используемый в составе вызывающей иммунный ответ композиции, должен быть достаточно большим для того, чтобы его последовательность являлась по существу уникальной, чтобы обеспечить снижение вероятности получения антител, обладающих перекрестной нацеленностью в отношении антигенов, отличных от SNAP-25. Кроме того, антиген SNAP-25, используемый в составе вызывающей иммунный ответ композиции, должен быть достаточно небольшим для того, чтобы вызывать иммунный ответ существенной интенсивности только против SNAP-25, карбоксильный конец которого соответствует остатку P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления токсином BoNT/A, для повышения вероятности получения анти-SNAP-25 антител, способных отличать SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A, от SNAP-25, на карбоксильном конце которого отсутствует остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A. Кроме того, очень желательно также получить с хорошим выходом анти-SNAP-25 антитела одной аминокислотной последовательности, которые воспроизводимо избирательны и связываются с приемлемой авидностью, чтобы сделать возможной разработку высокочувствительного теста.

[028] Последовательность, окружающая сайт расщепления BoNT/A, присутствующий в SNAP-25, обозначена как P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅', где P₁-P₁' означает разрезаемую связь. После расщепления эндопептидазой с измененной нацеленностью, образующиеся продукты расщепления содержат фрагмент, включающий последовательность P₅-P₄-P₃-P₂-P₁, и фрагмент, включающий P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'. Таким образом, в настоящей заявке термин "SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится остаток Pi разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A" относится к любому SNAP-25, у которого карбокси-концевой аминокислотой является остаток Pi. Например, Q₁₉₇-R₁₉₈ SNAP-25 человека (SEQ ID NO: 5) представляет собой разрезаемую связь P₁-P₁' сайта расщепления BoNT/A. В связи с этим "SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится глутамин разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A" является любой продукт расщепления SNAP-25, у которого карбокси-концевой аминокислотой является глутамин, причем глутамин представляет собой Q₁₉₇ разрезаемой связи. В качестве другого примера можно привести K₂₀₄-H₂₀₅ SNAP-25 Torpedo marmorata (SEQ ID NO: 16), который представляет собой разрезаемую связь P₁-P₁' сайта расщепления BoNT/A. В связи с этим "SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится лизин разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/А" является любой продукт расщепления SNAP-25, у которого карбокси-концевой аминокислотой является лизин, причем лизин представляет собой K₂₀₄ разрезаемой связи.

[029] Антиген SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A, можно модифицировать с повышением иммуногенности антигена SNAP-25, гаптена или любого другого антигенного соединения, которое в отсутствие модификации является иммуногенным, неиммуногенным или слабоиммуногенным. Согласно одному аспекту настоящего варианта реализации, карбокси-концевой остаток P₁ разрезаемой связи антигена SNAP-25 может карбоксилироваться. Карбоксилирование увеличивает желаемые иммуногенные свойства антигена SNAP-25 в двух отношениях. Во-первых, поскольку заряженные аминокислоты увеличивают иммуногенность, добавление COO^--группы к карбокси-концевому остатку увеличит общую иммуногенность антигена SNAP-25. Во-вторых, поскольку остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A находится в заряженном состоянии после расщепления, добавление COO^--группы к карбокси-концевому остатку повысит сходство данного антигена с исходным антигеном, для избирательного связывания с которым разработаны анти-SNAP-25 антитела, описанные в настоящей заявке.

[030] Согласно одному аспекту настоящего варианта реализации, амино-концевой остаток антигена SNAP-25 может быть модифицирован путем добавления аминокислоты, приспособленной для присоединения антигена SNAP-25 к белку-носителю, такому как, например, гемоцианин фиссуреллы (KLH), овальбумин (OVA), тиреоглобулин (THY), бычий сывороточный альбумин (BSA), соевый ингибитор трипсина (STI) или пептид множественного прикрепления (MAP). Например, остаток цистеина может быть помещен на N-конец с тем, чтобы присоединить белок-носитель KLH.

[031] Таким образом, согласно одному варианту реализации, длина антигена SNAP-25, на карбоксильном конце которого находится остаток P₁ разрезаемой связи в сайте расщепления BoNT/A, может составлять, например, по меньш