Применение бактерий, относящихся к группе нокардиоформных актиномицетов, для получения фармацевтической композиции и способ использования такой фармацевтической композиции

Применение бактерий, относящихся к группе нокардиоформных актиномицетов, для получения фармацевтической композиции и способ использования такой фармацевтической композиции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для защиты животного от расстройства, возникающего в результате инфекции бактерией, которая относится к группе нокардиоформных актиномицетов. Изобретение также относится к применению живых ослабленных бактерий данной группы для получения указанной композиции и к способу лечения животного данной композицией.

Среди бактерий класса Actinobacteria имеется отряд бактерий, называемый Actinomycetales, обычно именуемый актиномицетами. Бактерии, которые относятся к этому отряду, представляют собой жгутиковые грамположительные бактерии (однако несколько видов имеют сложные структуры клеточной стенки, что делает классическое окрашивание по Граму менее подходящим или даже неподходящим, что имеет место, например, со многими видами, которые относятся к семейству Actinomycetales Mycobacteriaceae) с высоким содержанием G+C (гуанина+цитозина). Они лучше всего известны как обитающие в почве организмы, хотя различные штаммы населяют растения и животных, включая людей. Они образуют устойчивые споры, которые часто прикрепляются к воздушному мицелию или гифам.

Актиномицеты играют роль в разрушении органического материала. Несколько видов используются в промышленности и фармацевтических исследованиях ввиду их типичных свойств.

Большинство актиномицетов являются непатогенными для животных (термин «животные», используемый в связи с настоящим изобретением, включает людей). Однако внутри многих подотрядов актиномицетов (наряду с другими Streptosporangineae, Micrococcineae, Streptomycineae и Frankineae) имеется один подотряд, а именно Corynebacterineae, который включает наряду с большим количеством непатогенных бактерий существенное число патогенов животных. Представляется, что данные патогены относятся к филогенетической группе, известной как нокардиоформные актиномицеты, которая включает семейства Mycobacteriaceae, Nocardiaceae и Corynebacteriaceae (см. наряду с другими источниками главу 11, озаглавленную: Rhodococus equi: Pathogenesis and Replication in Macrophages, in «Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity», by Lois J. Paradise et al. (eds.), New York, 1999). Примечательно, против большей части заболеваний, связанных с инфекцией указанными патогенными микроорганизмами, едва ли существует какое-либо адекватное профилактическое лечение (т.е. лечение перед или по существу одновременно с вызывающим заболевание патогенным микроорганизмом, которое может быть способно или предотвратить возникновение заболевания, или, по меньшей мере, смягчить воздействия заболевания). В течение последних лет было подтверждено признание того, что семейства Mycobacteriaceae, Nocardiaceae и Corynebacteriaceae филогенной группы нокардиоформных актиномицетов представляют собой очень тесно связанные семейства внутри подотряда Corynebacterineae (см. также источник University of California, San Diego, Outline of Senior Project, Marelle L. Yehuda, June 2, 2005). Стало также ясно, что, в частности, патогенные бактерии в данной группе, по меньшей мере, те, по поводу инфекции которыми нет адекватного профилактического лечения (таких, как, например, Mycobacterium uberculosis, Nocardia seriolae и Rhodococcus equi), имеют важное общее свойство: инфекция обычно происходит через кожу или слизистую оболочку с последующей диссеминацией бактерий внутри макрофагов и репликацией внутри указанных макрофагов (см. наряду с другими источниками Microbes and Infection 7, 2005, 1352-1363; Proceedings of the National Academy of Sciences, June 7, 2005, Vol. 102, no 23, pp 8327 - 8332; Nature Medicine 13, 282-284, 2007; Transplantation Proceedings, Volume 36, Issue 5, June 2004, pp 1415-1418). Действительно, макрофаги находятся на передней линии иммунной защиты организма от микробных инфекций, но в отличие от бактерий, которые зависят от избегания фагоцитоза для выживания в организме хозяина, предусматриваемые в настоящее время патогенные бактерии внутри данной группы нацелены на макрофаги для выживания и даже реплицируются в организме хозяина. Настоящее изобретение относится к данным бактериям, которые обладают способностью выживать внутри макрофагов животного и в связи с настоящим изобретением будут именоваться нокардиоформными актиномицетами, выживающими в макрофагах.

Очевидно, нокардиоформные актиномицеты, выживающие в макрофагах, эволюционировали для избегания основных функций защиты животного от микробов. В частности, Mycobacterium tuberculosis, микроб, вызывающий туберкулез, представляет собой вид, который успешно эксплуатировал макрофаги в качестве своей первичной ниши in vivo, но другие бактериальные виды, которые относятся к группе нокардиоформных актиномицетов, включая Mycobacteriaceae, Nocardiaceae и Corynebacteriaceae, приняли такую же стратегию. Они представляют собой, например, Mycobacterium ulcerans, которая вызывает язву Бурули, Mycobacterium avium paratuberculosis, которая вызывает болезнь Джона у крупного рогатого скота и которая связана с болезнью Крона у людей, Mycobacterium bovis, которая вызывает бычий туберкулез, Mycobacterium avium, которая связана с оппортунистической инфекцией индивидов с нарушенным иммунитетом, таких как пациенты со СПИДом, Nocardia seriolae и Nocardia farcinia, которые вызывают нокардиоз у рыб, Nocardia asteroids, которая вызывает инфекцию у реципиентов почечного трансплантата, Rhodococcus equi (ранее известный как Corynebacterium), который вызывает пневмонию у жеребят и который также связан с оппортунистическими инфекциями у индивидов с нарушенным иммунитетом, Corynebacterium pseudotuberculosis, которая вызывает абсцессы наряду с другими органами в легких у овец, коз, лошадей и иногда также у людей и т.д. Все эти бактериальные виды имеют общую способность выживать внутри макрофагов, инфицировать их и реплицироваться внутри указанного типа клетки-хозяина.

Данное типичное свойство серьезно препятствует лечению расстройств (в настоящем описании термин «расстройство» используется в качестве эквивалента «заболевания»), возникающих в результате инфекции бактерией, которая относится к группе выживающих в макрофагах нокардиоформных актиномицетов. Во многих случаях, когда клинические признаки действительно присутствуют, проводится лечение антибиотиками. Однако это обременительно, поскольку внутри макрофагов присутствует значительное количество бактерий и они труднодостижимы антибиотиками. Поэтому лечение антибиотиками часто занимает много времени и дает неоднозначный эффект. По поводу таких заболеваний, как туберкулез у людей, нокардиоз у рыб и пневмония у жеребят, было бы предпочтительно профилактическое лечение. Такое профилактическое лечение обычно основано на применение вакцины, содержащей убитые или живые ослабленные бактерии, происходящие из бактерий дикого типа. Оказалось, что в отношении выживающих в макрофагах нокардиоформных актиномицетов убитые (инактивированные) вакцины (т.е. вакцины, содержащие убитые бактерии или их одну или более субъединиц в качестве терапевтического средства) неэффективны. В настоящее время в целом считается, что для успешного профилактического лечения против выживающих в макрофагах нокардиоформных актиномицетов необходимы живые бактерии, поскольку только они способны достичь макрофагов и имитировать бактерии дикого типа в степени, достаточной для запуска адекватного иммунного ответа. Действительно, для лечения туберкулеза имеется живая вакцина (БЦЖ, бацилла Кальметта-Герена), основанная на виде Mycobacterium bovis, который тесно связан с видом Mycobacterium tuberculosis. Однако защитный эффект был незначительным. В отношении вида Nocardiaceae, таких как Rhodococcus equi и Nocardia seriolae, в настоящее время нет выпускаемых промышленностью вакцин. В отношении вида Corynebacterium pseudotuberculosis была предпринята попытка борьбы с использованием аутогенных вакцин, однако это имело неоднозначный эффект (RUMA Guidelines, National Office of Animal health, Hertfordshire, United Kingdom, 2006).

Существует очевидная потребность в адекватном профилактическом лечении для защиты животного от расстройства, возникающего в результате инфекции выживающими в макрофагах нокардиоформными актиномицетами. Лечение в этом смысле означает стимуляцию иммунной системы животного-мишени в степени, достаточной, по меньшей мере, для уменьшения негативных эффектов заражения микроорганизмами дикого типа. Целью является то, что это ведет к защите от расстройства, т.е. предотвращается возникновение расстройства или, по меньшей мере, уменьшается уровень инфекции или клинические признаки заболевания у животного и, следовательно, также уменьшается тяжесть заболевания. Тот факт, что выживающие в макрофагах нокардиоформные актиномицеты приняли такую же стратегию выживания в организме хозяина, приводит к идее общей стратегии для профилактического лечения против инфекции указанными бактериями.

В этом отношении отмечается описание в литературе решающей роли, которую играет метаболизм холестерина в выживании нокардиоформных актиномицетов в макрофагах, который может быть важным фактором вирулентности (Proceedings of the National Academy of Science, February 6, 2007, vol. 104, no. 6, pp 1947-1952). Предполагалось также, что указанный метаболизм обеспечивает логические мишени для новых терапевтических средств для борьбы с вызывающими заболевания штаммами, т.е. лекарственных средств для лечения после возникновения инфекции. Действительно, при ретроспективном анализе можно найти другое подтверждающее доказательство установленного факта, что для всех выживающих в макрофагах нокардиоформных актиномицетов метаболизм холестерина играет роль в выживании и персистенции бактерий в макрофагах хозяина. Например, из главы 11 (озаглавленной: «Rhodococus equi: Pathogenesis and Replication in Macrophages (Патогенез и репликация в макрофагах) ») в монографии «Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity (Оппортунистические внутриклеточные бактерии и иммунитет)», под редакцией Lois J. Paradise et al., New York, 1999) известно, что существуют большие сходства в клинической симптоматологии между инфекциями, вызванными несколькими нокардиоформными актиномицетами, и было определено, что холестеролоксидаза является ферментным компонентом или фактором вирулентности. В руководстве «Veterinary Microbiology (Ветеринарная микробиология)», том 56, выпуск 3-4, июнь 1997, 269-276, показано, что Corynebacterium pseudotuberculosis вовлечена в процесс холестеролоксидазы вместе с Rhodococcus equi.

Поэтому на первый взгляд представляется привлекательной разработка фармацевтической композиции для защиты животного против расстройства, возникающего в результате инфекции выживающими в макрофагах нокардиоформными актиномицетами (такая композиция может также именоваться вакциной) с использованием признания того, что метаболизм холестерина играет решающую роль в выживании этих бактерий в макрофагах. Однако, понимая, что предложения, высказанные в приведенной выше в настоящем описании статье PNAS (статье 2007), относительно лекарственного средства и таким образом нацеленные на полное уничтожение бактерий вмешательством в их метаболизм холестерина, преследующие такую же стратегию, представляются неподходящими для живой вакцины: если предпринимается попытка ослабления бактерии прекращением ее выживания в существенном сайте репликации, то бактерия не будет реплицироваться и выживать у животного-хозяина. Действительно, для лечения лекарственными средствами это является идеальной ситуацией. Однако для живой вакцины, если полностью блокируется выживание бактерии, то ожидается имитация вакцины, содержащей убитые бактерии. Оказалось, что такие вакцины неэффективны для лечения инфекции выживающими в макрофагах нокардиоформными актиномицетами. Все же предпринимались попытки оценки применения живых бактерий, у которых нарушен метаболизм холестерина, в фармацевтической композиции для защиты животного от заражения болезнетворными нокардиоформными актиномицетами дикого типа. Примером таких попыток является живая вакцина на основе мутанта холестеролоксидазы (ChoE) штамма 103+ Rhodococcus equi дикого типа (Prescott in Veterinary Microbiology 118, 2006, pp 240-246). Данная попытка была безуспешной. Однако не потому, что она не вызывала защиты, что следовало бы ожидать на основании технических положений приведенной выше в настоящем описании в качестве ссылки статьи PNAS (PNAS February 6, 2007, vol. 104, no. 6, pp 1947-1952), а потому, что мутантный штамм был все еще слишком вирулентным. Мутант еще был способен выживать и размножаться в макрофагах на уровне, сравнимом с R. Equi дикого типа. Также представляется, что антигенная нагрузка этого аномального в отношении холестерина мутанта сравнима с антигенной нагрузкой организма дикого типа. Поэтому мутант все же был способен вызывать заболевание. Действительно, тем временем было также установлено, что живая мутантная Rhodococcus equi, которая вообще неспособна захватывать холестерин (мутант пермеазы захвата стерина supAB, как представлено в публикациях Van der Geize et al. at the 4^th Havemeyer Workshop on Rhodococcus equi, Edinburgh, 13-16 July, 2008; и Van der Geize et al.: «A novel method to generate unmarked gene deletions in the intracellular pathogen Rhodococcus equi using 5-fluorocytosine conditional lethality» в монографии Nucleic Acids Research 2008; doi: 10.1093/nar/gkn811, далее также приводимые в качестве ссылки как «Van der Geize et al., 2008»), что означает полную блокаду метаболизма холестерина (по меньшей мере, когда холестерин используется в качестве исходного соединения), все же способна выживать и продолжает оставаться в макрофагах (Van der Geize et al., 2008) и таким образом является еще слишком вирулентной. Представляется, что для ослабления живой Rhodococcus equi требуется дополнительная мутация, оказывающая эффект вне метаболизма холестерина (Prescott: Veterinary Microbiology 125, 2007, 100-110). На основании данных результатов был сделан вывод, что сам метаболизм холестерина не является важным фактором вирулентности и не может использоваться для достаточного ослабления данных бактерий. Очевидно, бактерии, имеющие мутации их метаболизма холестерина, имеют такую же или, по меньшей мере, сравнимую антигенную нагрузку, как организм дикого типа, и таким образом, хотя они способны обеспечить адекватную защиту (то есть, если обсуждаемое животное выживает заражение мутированными бактериями), они еще слишком вирулентны для использования в фармацевтической композиции. Таким образом считалось, что нацеливание на фармацевтическую композицию для профилактического лечения, причем на композицию, содержащую живые бактерии, которые ослаблены инактивацией генов, участвующих в метаболизме холестерина, является тупиковым.

Однако, к удивлению, заявитель обнаружил, что для защиты животного от расстройства, возникающего в результате инфекции выживающей в макрофаге нокардиоформной актиномицетой, можно применять фармацевтическую композицию, содержащую живые бактерии вида нокардиоформных актиномицетов (обычно являющиеся таким же видом, как инфицирующая бактерия, или, альтернативно, являющиеся очень близко родственным видом, таким образом, имеющие много общих эпитопов T-клеток, как в случае с Mycobacterium tuberculosis в сравнении с Mycobacterium bovis), причем живые бактерии ослаблены инактивацией гена, который кодирует протеин, участвующий в разрушении метилгексагидроиндандиона пропионата, и фармацевтически приемлемый носитель для переноса бактерий.

«Ослабленные» в данном смысле означает неспособные вызвать полный набор симптомов заболевания, который обычно связан с вирулентным (часто дикого типа) патогенным аналогом ослабленной бактерии.

«Инактивация» в контексте настоящего изобретения означает, что ген, например, хотя и является частью оперона (т.е. набора генов, необходимого для действительной экспрессии протеина на функциональном уровне), или полностью удаляется из генома, или заменяется (любой известной или даже еще подлежащей разработке в будущем методикой; см., например, публикацию Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A.J. Nair, INFINITY SCIENCE PRESS LLC, 2008, главу 13 "Genetic Techniques", pp 476-496 и главу 15 "Recombinant DNA Technology", pp 563-612) с тем, чтобы он больше не кодировал соответствующий протеин дикого типа или был больше недоступен для полной транскрипции, или любым другим изменением в геноме с тем, чтобы протеин дикого типа не был получен ослабленной бактерией in vivo, по меньшей мере, на уровне, подходящем для поддержания нормального катаболизма метилгексагидроиндандиона пропионата по сравнению с ситуацией, при которой ген (или оперон, если это применимо) представлен в форме, подходящей для поддержания нормального метаболизма.

«Кодирующий протеин» в контексте настоящего изобретения значит, что ген (например, хотя и являющийся частью оперона) непосредственно кодирует протеин или субъединицу протеина (множественные субъединицы, вместе образующие ферментативно активный протеин), или кодирует одно или более промежуточных соединений, которые превращаются или непосредственно, или через множество стадий в протеин или его субъединицу (множественные субъединицы, вместе образующие ферментативно активный протеин).

«Фармацевтически приемлемый носитель» может представлять собой растворитель, дисперсионную среду, покрытие, противобактериальное и противогрибковое средство, изотонический или задерживающий всасывание агент и тому подобные, которые физиологически совместимы с животным-мишенью и приемлемы для него, например, наряду с другими моментами, изготовлены в стерильном виде. Некоторыми примерами таких несущих сред являются вода, солевой раствор, солевой раствор с фосфатным буфером, жидкость для бактериальной культуры, декстроза, глицерин, этанол и тому подобные, а также их комбинации. Они могут обеспечить получение жидкой, полутвердой и твердой лекарственной форм в зависимости от предполагаемого способа введения. Общеизвестно, что присутствие несущей среды несущественно для эффективности вакцины, но она может значительно упростить дозирование и введение антигена. Кроме носителя и антигена, фармацевтическая композиция может содержать другие вещества, такие как адъюванты, стабилизаторы, модификаторы вязкости или другие компоненты, добавляемые в зависимости от предполагаемого применения или требуемых свойств композиции.

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению присутствуют живые бактерии, причем указанные бактерии мутируют с тем, чтобы инактивировался ген, который кодирует протеин, участвующий в разрушении метилгексагидроиндандиона пропионата. Общеизвестно, что метилгексагидроиндандион пропионат (также известный как HIP или 3aα-H-4α(3'-пропионовая кислота)-7αβ-метилгексагидро-1,5-индандион) и 5-гидрокси-метилгексагидроинданон пропионат (также известный как HIL или 3aα-H-4α(3'-пропионовая кислота)-5α-гидрокси-7aβ-метилгексагидро-1-инданон-δ-лактон) образуются во время разрушения холестерина актинобактериями, включая выживающие в макрофагах нокардиоформные актиномицеты. Недавно в бактериальных видах, которые относятся к подотряду Corynebacterineae, был идентифицирован оперон (называемый ipdAB: разрушение инданона пропионата Альфа+Бета), кодирующий α и β субъединицу трансферазы, которая участвует в разрушении HIP (см. одновременно рассматриваемую международную патентную заявку PCT/EP2008/060844, поданную 19 августа 2008 г, основанную на первичной заявке на патент США, поданной 21 августа 2007 г.). Известный мутант с нокаутом трансферазы больше неспособен разрушать HIP и HIL (см. фиг.3 патентной заявки, приведенной выше в настоящем описании в качестве ссылки) и он не растет на HIP, HIL или 4-андростен-3,17-дионе. В любом случае «участвует в разрушении HIP» значит, что нокаутный мутант больше неспособен расти на HIP в качестве единственного источника углерода и энергии или, по меньшей мере, неспособен расти на HIP на уровне, который может быть получен немутантной бактерией. В настоящем неясно, катаболизирует ли трансфераза разрушение HIP сама, или реакция катализируется, отчего зависит разрушение HIP. Однако разрушение HIP происходит на относительно поздней стадии метаболизма холестерина и представляет собой очень специфическую стадию в пути разрушения холестерина. На основании общедоступных представлений о мутациях в метаболизме холестерина (указанные выше в настоящем описании ссылки на работы Prescott) следовало ожидать, что эта мутация привела бы к тому, что живая бактерия, хотя и обеспечивает защитный эффект, была бы слишком вирулентной. Однако к удивлению заявителя оказывается, что такой мутант адекватно ослаблен, что связано со значимо сниженной выживаемостью мутанта внутри макрофагов. Причина того, почему ген, который участвует в разрушении HIP, играет такую важную роль в выживании внутри макрофагов, неясна, это даже представляется противоречащим результатам предшествующего уровня техники, которые показывают, что даже полная блокада метаболизма холестерина оказывает недостаточный ослабляющий эффект, по-видимому, поскольку нокардиоформные актиномицеты не оказывают эффекта на выживаемость макрофагов. Поэтому было достаточно удивительным обнаружение того, что настоящая мутация, которая воздействует на второстепенную стадию катаболизма холестерина, создает серьезные препятствия выживанию патогенных нокардиоформных актиномицетов в макрофагах. В частности, было обнаружено, что мутантные живые бактерии все же способны поступать в макрофаги и оставаться в них (следовательно, обеспечивая стимул защитного иммунного ответа), но на очень низком уровне, который, как представляется, значительно снижает их вирулентность, что в свою очередь делает их приемлемыми для профилактического лечения.

В одном варианте осуществления инактивируется множество генов в одном опероне. Путем инактивации множества генов уменьшается вероятность изменения бактерии в фенотип, напоминающий дикий тип. В частности, инактивируются гены ipdA и ipdB. Путем инактивации указанных генов может быть обеспечено эффективное и безопасное ослабление. В предпочтительном варианте осуществления инактивация достигается делецией, по меньшей мере, одного гена делецией немаркированного гена. Преимущество немаркированной мутации состоит в том, что она обеспечивает возможность повторного введения мутаций в тот же штамм. Инородная ДНК (векторная ДНК) удаляется в процессе введения мутации. Поэтому вновь введенная векторная ДНК для введения второй мутации не может интегрироваться в сайте предыдущей мутации (путем гомологичной рекомбинации между векторными ДНК). Интеграция определенно произойдет, если векторная ДНК еще присутствует в хромосоме, и вызовет появление большого числа ложноположительных интегрантов. Система обеспечивает возможность использования одного антибиотического гена для введения бесконечного числа мутаций. Немаркированная мутация также обеспечивает возможность легкого использования в промышленности ввиду отсутствия гетерогенной ДНК, обеспечивающей возможность легкого удаления ферментационного бульона. Инактивация генов делецией генов обеспечивает возможность конструирования устойчивых ревертирующих мутантов. Особенно маленькие гены (<500 пар оснований) легче инактивируются делецией генов по сравнению с разрывом генов интеграцией одной рекомбинации. Генный делеционный мутагенез может также применяться для инактивации кластера нескольких генов из генома. Стратегия генного делеционного мутагенеза может также применяться для замещения генов (например, изменения дикого типа в мутантный ген).

В одном варианте осуществления бактерии относятся к семейству Nocardiaceae или Mycobacteriaceae. Предпочтительно бактерии относятся к родам Rhodococcus, Nocardia или Mycobacterium и в частности относятся к любому из видов Rhodococcus equi, Nocardia seriolae, Mycobacterium tubercolosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium bovis или Mycobacterium avium paratubercolosis. В отношении этих видов до настоящего времени промышленностью не выпускаются адекватные вакцины. Настоящее изобретение обеспечивает возможность получения фармацевтических композиций, которые могут применяться в качестве вакцин для борьбы с этими бактериями и поэтому смягчают течение соответствующих заболеваний, которые они вызывают у животного.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представлена в форме, подходящей для перорального введения. Кроме того, это очень удобный путь введения, в частности, стало ясно, что данный путь введения является безопасным. Парентеральное введение может вызвать развитие абсцессов. Предпочтительно, живые бактерии присутствуют в концентрации от 1×10⁴ до 1×10¹⁰ CFU (колониеобразующих единиц) на дозу.

Настоящее изобретение также относится к бактериям Rhodococcus equi, происходящим из штамма, депонированного в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов Института Пастера в Париже, Франция, под № CNCM 1-4108 или № CNCM 1-4109, и к бактериям, которые относятся к данному штамму.

Настоящее изобретение также относится к использованию живых бактерий, которые относятся к группе нокардиоформных актиномицетов, способных выживать внутри макрофагов животного, причем живые бактерии ослабляются инактивацией гена, который кодирует протеин, участвующий в разрушении метилгексагидроиндандиона пропионата, для получения фармацевтической композиции для защиты животного от расстройства, возникающего в результате инфекции соответствующей бактерией дикого типа.

Изобретение также относится к способу лечения животного для защиты его от расстройства, возникающего в результате инфекции бактерией, относящейся к группе нокардиоформных актиномицетов, обладающих способностью выживать внутри макрофагов животного, включающему введение животному фармацевтической композиции, содержащей живые бактерии вида нокардиоформных актиномицетов, причем живые бактерии ослаблены инактивацией гена, который кодирует протеин, участвующий в разрушении метилгексагидроиндандиона пропионата.

Изобретение будет далее объяснено с использованием следующих примеров, описывающих определенные варианты осуществления настоящего изобретения, причем указанные варианты осуществления распространяются на три части:

Часть A: Идентификация и конструирование штаммов

Часть B: Выживание в макрофагах как модель для ослабления in vivo

Часть C: Эффективность мутантных бактерий в защите против инфекции диким типом

ЧАСТЬ A: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ

A1 Культуральные среды и условия роста

Штаммы R. equi выращивали при 30°C (200 об/мин) в среде Luria-Bertani (LB), состоящей из бактотриптона (BD), Дрожжевого экстракта (BD) и 1% NaCl (Merck) или минеральной среде с ацетатом. M. smegmatis mc²155 (Snapper et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:1911-1919) выращивали при 37°C (200 об/мин) в триптическом соевом бульоне BBL (TSB; BD) с добавкой 0,05% Твин 80. Минеральная среда с ацетатом (MM-Ac) содержала K₂HPO₄ (4,65 г/л), NaH₂PO₄-H₂O (1,5 г/л), Na-ацетат (2 г/л), NH₄Cl (3 г/л), MgSO₄·7H₂O (1 г/л), тиамин (40 г/л, стерилизованный фильтрацией; Sigma) и основной раствор Vishniac (1 мл/л). Основной раствор Vishniac получали следующим образом (модифицированным способом Vishniac and Santer, 1957, Rev. 21: 195-213): EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту) (10 г/л) и ZnSO₄·7H₂O (4,4 г/л) растворяли в дистиллированной воде (pH 8 с использованием 2 M KOH). Затем добавляли CaCl₂·2 H₂O (1,47 г/л), MnCl₂·7H₂O (1 г/л), FeSO₄·7H₂O (1 г/л), (NH₄)₆ Mo₇O₂₄·4 H₂O (0,22 г/л), CuSO₄·5 H₂O (0,315 г/л) и CoCl₂·6 H₂O (0,32 г/л) в указанном порядке при pH 6 и, наконец, хранили при pH 4.

Для роста на твердых средах добавляли бактоагар (15 г/л; BD). Основной раствор 5-фторцитозина (Sigma- Aldrich) (10 мг/мл) получали в дистиллированной воде, растворяли нагреванием до 50°C, стерилизовали фильтрацией и добавляли к автоклавированной среде.

Штамм INS436 Nocardia seriola обычным образом выращивали при 26°С (200 об/мин) в бульоне Eugon (BD) с добавлением Твин 80 (0,05%). Для роста на твердых средах добавляли бактоагар (15 г/л; BD). К агаровой среде добавляли сахарозу (2%) для sacB-зависимого сахарозного отбора.

A2 Идентификация ipdA, ipdB и fadE30 в штамме 103+ R. equi и ipdAB в штамме INS436 N. seriolae

Как указано выше в настоящем описании, обнаружено, что гены ipdA и ipdB Rhodococcus участвуют в разрушении метилгексагидроиндандиона пропионата (HIP; 3aα-H-4α(3'-пропионовая кислота)-7aβ-метилгексагидро-1,5-индандиона) и 5-гидрокси-метилгексагидроиндандиона пропионата (HIL; 3aα-H-4α(3'- пропионовая кислота)-5α-гидрокси-7aβ-метилгексагидро-1-инданон-δ-лактона). Биоинформационные анализы протеиновых последовательностей IpdA и IpdB штамма SQ1 R. erythropolis в геномных базах данных выявили, что гены, кодирующие IpdA и IpdB, и их видимая оперонная организация сохранились в геноме R. equi 103+ (штамма дикого типа, полученного от J. F. Prescott, Ontario, Canada; как приведено в качестве ссылки в руководстве Veterinary Microbiology 118 (2006) 240-246). Геномная последовательность R. equi 103+ была определена группой секвенирования R. equi в Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, UK (геном, опубликованный как «R. equi 103S»). Анализ генома, кроме того, выявил, что R. equi 103+ содержит дополнительные паралогичные гены ipdA и ipdB, обозначенные соответственно как ipdA2 и ipdB2. Данные гены локализуются снаружи от кластера катаболических генов холестерина. Аминокислотные последовательности IpdA, IpdB, IpdA2 и IpdB2 изображены в прилагаемых идентичностях SEQ ID соответственно под №№ 1, 2, 3 и 4. Идентичности аминокислотных последовательностей протеинов IpdA и IpdB R. equi 103+ данными паралогичными и несколькими другими актинобактериальными ортологами приведены в таблице 6. Эта таблица представляет обзор генов, идентифицированных в других геномах нокардиоформных актиномицетов, кодирующих ортологи IpdA и IpdB Rhodococcus equi 103+. В связи с настоящим изобретением данные и другие ортологи называются IpdA и IpdB. Идентичность протеинов указывает процентную долю идентичности аминокислотных последовательностей полной длины с IpdA и IpdB R. equi 103S. Актинобактериальные геномные последовательности были получены из геномного сервера BLAST для микробных геномов Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI). Данные о последовательности R. equi 103+ были получены группой секвенирования R. в Sanger Institute. Геном штамма 103+ (известный как 103S) использовали для этих целей идентификации. Практическая работа с Rhodococcus equi, как иллюстрируется ниже в настоящем описании, проводилась со штаммом RE1 R. equi (выделенным у жеребенка, страдающего грануломатозной пневмонией, вызванной инфекцией Rhodococcus equi).

Второй ген, участвующий в разрушении метилгексагидроиндандиона пропионата, представляет собой fadE30. Рост мутанта ΔfadE30 значительно нарушен на HIL и HIP по существу без проявления роста после 24 часов инкубации. Ген fadE30 Rhodococcus equi был идентифицирован исследованием сходства протеиновых последовательностей, выполненным на геноме R. equi 103+, имеющемся в институте Sanger (http://www.sanger.ac.uk). Аннотированную протеиновую последовательность FadE30 штамма RHA1 Rhodococcus jostii (Ro4596, номер доступа в Генном банке ABG96382) использовали в качестве матрицы протеиновой последовательности (McLeod et al., 2006, in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:15582-15587; и Van der Geize et al., 2007, в Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:1947-1952). Исследование базы данных сходства с использованием Ro04596 выявило ген R. equi 103S, кодирующий протеин, который проявил идентичность аминокислотной последовательности 73% с Ro04596. Данный протеин был аннотирован как FadE30 R. equi 103S (SEQ ID No 43) и его соответствующий ген был назван fadE30. Ортологичные гены, кодирующие FadE30 у других актинобактерий, могут быть идентифицированы аналогичным образом. Их отбор представлен в таблице 8.

Геномный локус ipdAB N. seriola амплифицировали PCR (ПЦР, полимеразной цепной реакцией) в трех частях с использованием олигонуклеотидных праймеров, разработанных на высококонсервативных нуклеотидных последовательностях актинобактериального локуса ipdAB. Данные консервативные области были идентифицированы совмещением нуклеотидных последовательностей нескольких известных актинобактериальных последовательностей генов ipdAB. Нуклеотидную геномную последовательность области ipdAB Nocardia farcinica (nfa05080- nfa05090) (DDBJ номер доступа AP006618) использовали в качестве первичной матрицы для разработки олигонуклеотидных ПЦР-праймеров. Используемые олигонуклеотидные праймерные последовательности перечислены в таблице 5. Хромосомную ДНК N. seriola INS436 использовали в качестве матрицы для ПЦР. Гены ipdAB N. seriola амплифицировали с использованием праймеров ipdA-actino-F и ipdB-actino-R (ПЦР 22), и находящуюся выше по ходу транскрипции область ipdAB амплифицировали с использованием ipd-актино-F2 и ipdA-актино-R (ПЦР 23), а находящуюся ниже по ходу транскрипции область амплифицировали с использованием ipdB-актино-F и ipd-актино-R (ПЦР 21). Продукты ПЦР клонировали в вектор клонирования pGEM-T и определяли нуклеотидные последовательности вставок. В последующем были разработаны другие пары праймеров на полученной последовательности ДНК и использованы для реклонирования и ресеквенирования локуса ipd. Это привело к получению полной нуклеотидной последовательности локуса ipdAB N. Seriola, охватывающей 4139 пар оснований. Секвенированный фрагмент ДНК содержал гены ipdA и ipdB N. Seriola и их соседние гены. Выведенные протеиновые последовательности IpdA и IpdB N. seriola INS436 показаны соответственно в SEQ ID NO 58 и SEQ ID NO 59.

A3 Клонирование, ПЦР и выделение геномной ДНК

DH5α Escherichia coli использовали в качестве хозяина для всех процедур клонирования. Рестрикционные ферменты были получены у компании Fermentas GmbH. Хромосомную ДНК клеточных культур выделяли с использованием набора бактериальной геномной ДНК GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя.

ПЦР выполняли в реакционной смеси (25 мкл), состоящей из Трис-HCl (10 мМ, pH 8), 1x стандартного полимеразного буфера, dNTP (деоксинуклеотид трифосфат) (0,2 мМ), DMSO (диметилсульфоксид) (2%), ПЦР-праймеры (каждого по 10 нг/мкл, таблица 5) и высокоспецифичной ДНК-полимеразы (Fermentas) или ДНК-полимеразы Pwo (Roche Applied Science). Для ПЦР колоний клеточный материал смешивали со 100 мкл хлороформа и 100 мкл 10 мМ Tris-HCl при pH 8, энергично перемешивали вихревой мешалкой и центрифугировали (2 мин, 14000×g). Образец верхней водной фазы (1 мкл) в последующем использовали в качестве матрицы для ПЦР. Стандартная ПЦР включала 5-минутную стадию плавления ДНК при 95°C с последующими 30 циклами по 45 сек денатурации при 95°C, 45 сек отжига при 60°C и 1-3 мин удлинения при 72°C. Используемое время удлинения зависело от длины ожидаемого ПЦР ампликона, принимая 1,5 мин/1 тысячу оснований в качестве общего правила.

A4 Электротрансформация R. equi, M. smegmatis и N. seriolae

Клетки штаммов R. equi трансформировали электропорообразованием, по существу, как описано (Van der Geize et al., в принятой к публикации в NAR статье, приведенной выше в качестве ссылки; Navas et al., 2001, J. Bacteriol. 183: 4796-4805). Вкратце, клеточные культуры выращивали в 50 мл среды LB при 30°C до тех пор, пока OD₆₀₀ (оптическая плотность при длине волн 600 нм) не достигала 0,8-1,0. Клетки подвергали пеллетированию (20 мин при 4500×g) и дважды промывали 10% ледяным глицерином. Подвергнутые пеллетированию клетки ресуспендировали в 0,5-1 мл ледяного 10% глицерина и делили на аликвоты по 200 мкл.

Клетки M. smegmatis mc²155 трансформировали электропорообразованием, по существу, как описано в литературе (Jacobs et al., 1991, Methods Enzymol. 204:537-555). Вкратце, клеточные культуры (250 мл) выращивали при 37°C в среде TSB+0,05% Твин 80 до тех пор, пока OD₆₀₀ достигала 0,8, клали на лед на полтора часа и центрифугировали (10 мин при 5000×g) для пеллетирования клеток. Клеточные пеллеты дважды промывали дистиллированной водой и ресуспендировали в конечном объеме 1 мл 10% глицерина и делили на аликвоты по 200 мкл.

Элюированную MilliQ плазмидную ДНК (5-10 мкл; набор GenElute Plasmid Miniprep Kit, Sigma-Aldrich) добавляли к 200 мкл клеток в кюветы с зазорами 2 мм. Электропорообразование выполняли одиночным импульсом 12,5 кВ/см, 1000 Ом и 25 мкфарад. Подвергнутые электропорообразованию клетки осторожно смешивали с 1 мл среды LB (R. equi) или 1 мл TSB+0,05% Твин 80 (M. smegmatis) и давали возможность восстановиться в течение 2 ч (R. equi) или 5 ч (M. smegmatis) при 37°C и 200 об/мин. Аликвоты (200 мкл) восстановленных клеток высевали на селективную агаровую среду. Трансформанты R. equi отбирали на агаре LB, содержащем апрамицин (50 мкг/мл) и появлялись после 2-3 дней инкубации при 30°C. Трансформанты M. smegmatis отбирали на агаровой среде с TSB+0,05% Твин 80, содержащей канамицин (10 мкл/мл), и они появлялись после 4-5 дней инкубации при 37°C.

Для N. seriolae прекультуру (20 мл) штамма INS436 выращивали в течение 5 дней при 26°C (200 об/мин) в бульоне Eugon+0,05% Твин 80 (OD_6oonm=6) и использовали для инокуляции 100 мл свежего бульона Eugon+0,05% среды Твин 80 (1:100). Первичную культуру выращивали в течение ночи при 26°C в течение 20 ч до OD_600нм=1,3.

Клетки подвергали пеллетированию (20 мин, 4000 g) при 4°C и дважды промывали 50 мл ледяного 10% глицерина. Подвергнутые пеллетированию клетки ресуспендировали в 500 мкл 10% глицерина, делили на аликвоты по 200 мкл и немедленно использовали для электротрансформации. Подвергнутую элюированию MilliQ плазмидную ДНК (5-10 мкл; набор GenElute Plasmid Miniprep Kit, Sigma-Aldrich) добавляли к 200 мкл клеток в кювету с зазором 2 мм, смешивали и оставляли на 1 мин на льду. Электропорообразование выполняли одиночным импульсом 1,75 кВ/см, 200 Ом и 50 мкфарад (приблизительная продолжительность импульса 9,3 мс). Подвергнутые порообразованию клетки осторожно смешивали с 1 мл бульонной с