Способ получения полимерсодержащих волокон

Способ получения полимерсодержащих волокон

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу прядения полимерного волокна. Кроме того, оно относится к полимерному волокну, получаемому по упомянутому способу, и к вариантам его применения. Изобретение также относится к продуктам, включающим упомянутое полимерное волокно.

Уровень техники

Обычным способам получения полимерного волокна свойственны значительные недостатки в отношении как способов, так и продуктов. K способам обычно предъявляются требования, чрезмерно жесткие для включения биологического материала, такого как белки или клетки, в отношении условий, касающихся температуры, давления или использования химических реагентов и растворителей. Продукты обычно разрабатывают для демонстрации превосходства в одном свойстве, таком как прочность, упругость или масса. Однако объединение всех данных свойств оказалось затруднительным.

Натуральный шелк паука может принимать различные формы в зависимости от железы, в которой он образуется (Gosline et al., J. Exp. Biol. (202): 3295, 1999). Его свойства достойны внимания: его предел прочности при растяжении может превосходить соответствующую характеристику стали и быть равным пределу прочности при растяжении арамидных элементарных волокон, например, марки кевлар. Шелк паука также может быть очень податливым будучи растяжимым вплоть до приблизительно 300% его длины без разрыва. Помимо прочего, он является легким по массе.

Поскольку получение нативного шелка паука является непрактичным вследствие территориальной и каннибалистической природы пауков, научный и коммерческий интерес инициировал исследование искусственного изготовления шелка паука с целью возможного получения в промышленном масштабе. Однако отыскание коммерчески конкурентоспособного способа массового получения шелка паука оказалось затруднительным. Искусственное получение столкнулось с проблемами достижения как достаточного выхода белка, так и качественной сборки нитей. На решение проблемы источника белка направлено получение рекомбинантных белков шелка паука при использовании бактерий (Scheibel, Microb. Cell. Fact., (1): 14, 2004). Тем не менее, вытяжка волокна из водных растворов данных белков невозможна, поскольку такой раствор, сам по себе, не демонстрирует достаточную продольную вязкость.

Прядение волокон представляет собой способ, по которому деформирующие напряжения в направлении оси волокна конкурируют с поверхностным натяжением прядильного сиропа. Например, невозможно вытягивать стабильное текучее элементарное волокно из воды вследствие высокого поверхностного натяжения воды.

Это иллюстрирует неустойчивость Рэлея, которая вызывает разрушение струи воды, которая истекает из водопроводного крана, на капли. Данный эффект вызывается поверхностным натяжением воды.

Соотношение между вязкостными силами и силами поверхностного натяжения описывает число Онезорге Oh.

O h = η ρ σ R

Небольшое значение числа Oh (Oh<<1) означает то, что текучее элементарное волокно будет разрушаться на небольшие капли, что стимулирует поверхностное натяжение. Большое значение числа Oh означает то, что текучее элементарное волокно будет оставаться стабильным (Edmond, Schofield et al. 2006). В результате это означает то, что прядильный сироп должен демонстрировать большое значение числа Онезорге. Очевидно, значение числа Oh может быть увеличено в результате увеличения вязкости. У текучих сред, характеризующихся высоким коэффициентом Трутона, в процессах продольного течения будет доминировать продольная вязкость и поэтому большие значения числа Oh могут быть достигнуты для текучих сред, которые характеризуются довольно низкой сдвиговой вязкостью η, но высоким коэффициентом Трутона Tr.

Рекомбинантный белок шелка паука может быть получен при использовании бактерий, его сборка была подробно исследована (Scheibel, Microb. Cell. Fact., (1): 14, 2004; Huemmerich et al., Curr. Biol., (22): 2070-4, 2004; Rammensee et al., PNAS, (105):6590-6595, 2008). Искусственные прядильные сиропы, имеющие низкие концентрации белка (10-20 мг/мл eADF3 и eADF4), не обнаруживают соотношения Tr>>1. Поверхностное натяжение является все еще намного большим, чем эффекты вязкости, таким образом, также имеет место и Oh<<1, поэтому получение волокна из данных растворов, имеющих низкую концентрацию белка, было невозможным. Получение волокна обеспечивали только растворы рекомбинантного белка шелка паука, имеющие очень высокие концентрации белка (~200 мг/мл), (Exier et al., Angewandte Chemie-Intemational Edition, (19): 3559-3562, 2007). Однако увеличение концентрации белка приводит к увеличению сдвиговой вязкости раствора, а перерабатываемость текучей среды, характеризующейся очень высокой (>1 Па-сек) сдвиговой вязкостью, является довольно плохой.

Изобретатели настоящего изобретения, к своему удивлению, обнаружили то, что для прядения волокна по способу настоящего изобретения требуются только очень низкие концентрации полимера. Использованию очень низких концентраций полимера свойственно преимущество, заключающееся в отсутствии увеличения сдвиговой вязкости раствора, что, в свою очередь, улучшает перерабатываемость текучей среды.

К удивлению, получение волокна из очень низкоконцентрированных полимеров, например полипептидов шелка, таких как полипептиды шелка паука, в мягких условиях облегчалось включением улучшителей продольной вязкости. Хотя прядильные сиропы шелка паука по их природе и описывались как характеризующиеся очень высокими процентными уровнями содержания белка шелка паука, настоящий способ, к удивлению, требует использования только очень низких концентраций полипептидов шелка, начиная от концентраций, составляющих всего лишь 0,15 мг/мл.

Кроме того, настоящий способ, к удивлению, требует использования только очень низких концентраций вышеупомянутых улучшителей продольной вязкости. Низкие концентрации упомянутых улучшителей, с одной стороны, являются достаточными для увеличения продольной вязкости раствора, но, с другой стороны, по существу не увеличивают сдвиговую вязкость раствора, так что образование волокон улучшается.

Таким образом, использование очень низких концентраций полимеров и/или очень низких концентраций улучшителей продольной вязкости в способе настоящего изобретения облегчает прядение волокон из прядильного раствора. Кроме того, технические препятствия в способе невелики, поскольку проводят непосредственную вытяжку волокон из раствора полипептида шелка в условиях окружающей среды или условиях, близких к ним.

Краткое изложение изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу прядения волокна из прядильного раствора, включающему стадии:

(a) получения прядильного раствора, содержащего (i) полимер, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединение, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворитель; и

(b) вытяжки волокна из прядильного раствора или комбинирования экструдирования и вытяжки волокна из прядильного раствора, в результате чего получают волокно.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к прядильному раствору для реализации способа настоящего изобретения, содержащему (i) полимер, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединение, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворитель.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к волокну, получаемому по способу первого аспекта, и к его применению.

В четвертом аспекте настоящее изобретение предлагает продукты, включающие волокно второго аспекта.

Данное краткое изложение изобретения необязательно описывает все признаки изобретения.

Подробное описание изобретения

До приведения ниже подробного описания настоящего изобретения необходимо понять то, что данное изобретение не ограничивается конкретными методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьироваться. Также необходимо понимать то, что терминология в соответствии с использованием в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, которое будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если только не будет определено другого, то все технические и научные термины в соответствии с использованием в настоящем документе имеют те же самые значения, что и обычно понимаемые специалистами в соответствующей области техники.

Предпочтительно термины в соответствии с использованием в настоящем документе определяются согласно описанию в публикации «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», Leuenberger, H.G.W., Nagel, B. and Kölbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

По ходу всего изложения текста данного описания изобретения цитируются несколько документов. Каждый из документов, процитированных в настоящем документе (в том числе все патенты, заявки на получение патента, научные публикации, технические описания от производителя, инструкции, представления последовательностей с номерами доступа GenBank и тому подобное), будь выше или ниже в настоящем документе, во всей своей полноте посредством ссылки включается в настоящий документ. Ничто в настоящем документе не должно восприниматься как допущение того, что изобретение не имеет права на испрашиваемую дату приоритета на основании приоритетной заявки.

В последующем изложении будут описываться элементы настоящего изобретения. Данные элементы перечисляются совместно с конкретными вариантами осуществления, однако необходимо понимать то, что для создания дополнительных вариантов осуществления они могут быть объединены любым образом и в любом количестве. Различным образом описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны восприниматься как ограничивающее настоящее изобретение только подробно описанными вариантами осуществления. Данное описание изобретения должно пониматься как обосновывающее и охватывающее варианты осуществления, которые объединяют подробно описанные варианты осуществления с любым количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, раскрытыми в описании настоящей заявки должны считаться любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке, если только контекст не будет указывать на другое.

По ходу всего изложения данного описания изобретения и формулы изобретения, которая следует далее, если только контекст не будет требовать другого, слово «включать» и вариации, такие как «включает» и «включающий», будут пониматься как подразумевающие включение указанных целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любых других целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий.

В соответствии с использованием в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа (например, один, некий и данный) включают соответствия во множественном числе, если только содержание ясно не будет диктовать другого.

Остатки в двух и более полипептидах считаются «соответствующими» друг другу, если остатки занимают аналогичное положение в полипептидных структурах. Как хорошо известно на современном уровне техники, аналогичные положения в двух и более полипептидах могут быть определены в результате выравнивания полипептидных последовательностей на основе подобия аминокислотной последовательности или структурного подобия. Средства для такого выравнивания специалистам в соответствующей области техники хорошо известны и могут быть, например, получены в Интернете, например, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) или Align (http://www.ebi.ac.uk//emboss/align/index.html) при использовании стандартных установок, предпочтительно для выравнивания EMBOSS: needle, Матрица: Blosum62, Штраф за открытие пробела: 10.0, Штраф за продолжение пробела 0.5.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу прядения волокна из прядильного раствора, включающему, по существу, состоящему из или состоящему из следующих стадий:

(а) получения прядильного раствора, содержащего (i) полимер, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединение, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворитель; и

(b) вытяжки волокна из прядильного раствора или комбинирования экструдирования и вытяжки волокна из прядильного раствора, в результате чего получают волокно.

В контексте настоящего изобретения термин «полимер» относится к молекуле, образованной из повторяющихся структурных звеньев, обычно соединенных ковалентными химическими связями.

В одном предпочтительном варианте осуществления полимер представляет собой биополимер, такой как полипептид или синтетический полимер.

Термин «биополимер» в соответствии с использованием в настоящем документе относится к молекуле, включающей мономерные звенья, которые ковалентно связаны с образованием более крупных структур. Биополимеры при классификации могут быть разделены на три основных класса на основании различающихся использующихся мономерных звеньев и структуры полученных биополимеров. Первый класс биополимеров представляет собой полинуклеотиды, которые являются полимерами, образованными из нуклеотидных мономеров, например полимерами, образованными из 10 и более нуклеотидных мономеров. Второй класс биополимеров представляет собой полипептиды, которые являются полимерами аминокислот. Третий класс биополимеров представляет собой полисахариды, которые зачастую являются линейными связанными полимерными углеводными структурами. Предпочитается, чтобы биополимер представлял бы собой полипептид.

Предпочтительно биополимер является биоразлагаемым, а более предпочтительно также и компостируемым. Биоразлагаемые биополимеры разлагаются с образованием COz и воды под действием микроорганизмов. Биоразлагаемые биополимеры, которые также являются и компостируемыми, могут быть введены в способ промышленного компостирования и будут разлагаться в течение месяцев.

Также предпочитается, чтобы биополимер был бы биосовместимым. Это означает то, что полимер является нетоксичным, немутагенным и вызывает нулевую или только минимальную воспалительную реакцию.

Таким образом, также и волокна, спряденные из биополимеров по способу настоящего изобретения, могут демонстрировать вышеупомянутые выгодные характеристики, а именно могут быть биоразлагаемыми, компостируемыми и/или биосовместимыми или могут быть в основном биоразлагаемыми, компостируемыми и/или биосовместимыми. В частности, поскольку количество улучшителей продольной вязкости в прядильном растворе способа настоящего изобретения предпочтительно является очень низким.

Как уже упоминалось выше, в полипептиде повторяющиеся структурные звенья представляют собой аминокислоты, соединенные ковалентными амидными связями (пептидными связями).

Если только не будет указано другого, термины «полипептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемым образом и обозначают любую пептидно-соединенную цепь аминокислот вне зависимости от длины или посттрансляционной модификации.

Предпочтительно полипептидом являются полипептид шелка, включающий, по меньшей мере, два идентичных повторяющихся звена, бычий сывороточный альбумин (БСА), зеин или казеин. Полипептид также может представлять собой коллаген, фибронектин или кератин.

Бычий сывороточный альбумин (БСА), также известный как «Fraction V», представляет собой сывороточный альбуминовый белок. Зеин представляет собой проламиновый белок, встречающийся в кукурузе. Казеин (от латинского caseus «сыр») представляет собой преобладающий фосфопротеин (αS1, αS2, β, κ), который отвечает почти за 80% белков в коровьих молоке и сыре.

В контексте настоящего изобретения термин «полипептид шелка» относится к полипептиду или белку шелка (необходимо отметить то, что, если только не будет указано другого, данные два термина в соответствии с использованием в настоящем документе являются взаимозаменяемыми), который экспрессируют в рекомбинантной экспрессирующей системе (например, микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих), то есть отделяют от его естественной среды в железе паука (рекомбинантный полипептид или белок шелка). Предпочтительно «полипептид шелка» выделяют или очищают. В частности, «очищенный полипептид шелка» или «выделенный полипептид шелка» является свободным или по существу свободным от клеточного материала или других загрязняющих белков из клеточного или тканевого источника, из которого белок выделяют или производят. Формулировка «по существу свободный от клеточного материала» включает препараты полипептида шелка, в которых полипептид шелка отделен от клеточных компонентов клеток, из которых его рекомбинантно получают. Таким образом, полипептид шелка, который является по существу свободным от клеточного материала, включает препараты полипептидов шелка, содержащие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (в расчете на сухую массу) загрязняющего белка. В случае экспрессии полипептида шелка в клеточной культуре он также будет свободным или по существу свободным от культуральной среды, то есть культуральная среда будет представлять собой менее чем приблизительно 20%, 10%, 5% или 1% от объема полипептидного препарата.

«Полипептид шелка» в соответствии с контекстом настоящего изобретения дополнительно относится к полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая включает или состоит из, по меньшей мере, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95%, а наиболее предпочтительно 100%, множественных копий одного идентичного повторяющегося звена (например, А₂, Q₆ или С₁₆, где позиции 2, 6 или 16 представляют собой количество повторяющихся звеньев) или множественных копий двух и более различных повторяющихся звеньев (например, (AQ)₂₄ или (AQ)₁₂, C₁₆).

Термины «повторяющееся звено» и «звено повтора» в контексте настоящего изобретения могут быть использованы взаимозаменяемым образом,

В контексте настоящего изобретения термин «полипептид шелка» также относится к полипептиду шелка, который включает или состоит из по меньшей мере двух идентичных повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из идентичных копий аминокислотных последовательностей полипептидов шелка, встречающихся в природе, или вариаций аминокислотных последовательностей полипептидов шелка, встречающихся в природе, или комбинаций обоих вариантов.

В контексте настоящего изобретения «повторяющееся звено» относится к области, которая в аминокислотной последовательности соответствует области, которая включает или состоит из по меньшей мере одного пептидного мотива (например, АААААА (SEQ ID NO:13) или GPGQQ (SEQ ID NO:4)), который повторяющимся образом присутствует в полипептиде шелка, встречающемся в природе, (например, MaSpI, ADF-3, ADF-4 или Flag) (то есть к идентичной аминокислотной последовательности), или к аминокислотной последовательности, по существу подобной ей (то есть к варианту аминокислотной последовательности). В данном отношении термин «по существу подобный» относится к степени аминокислотной идентичности, по меньшей мере, для 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%, предпочтительно по всей длине, соответствующей эталонной аминокислотной последовательности, встречающейся в природе. «Повторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «по существу подобной» соответствующей аминокислотной последовательности в полипептиде шелка, встречающемся в природе (то есть повторяющееся звено дикого типа), также является подобным и в отношении своих функциональных свойств, например, полипептид шелка, включающий «по существу подобное повторяющееся звено», все еще обладает способностью образовывать волокно. Предпочтительно из полипептида шелка, включающего «по существу подобное повторяющееся звено», все еще можно проводить вытяжку гладкого и однородного волокна при скорости, составляющей, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно 10 см/сек, а более предпочтительно 10 м/сек. Специалист в соответствующей области техники может провести визуальную оценку того, будет ли все еще иметь место получение волокна. Гладкий и однородный внешний вид упомянутого волокна можно контролировать при использовании электронной микроскопии.

«Повторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «идентичной» аминокислотной последовательности полипептида шелка, встречающегося в природе, например, может представлять собой часть полипептида шелка, соответствующую одному или нескольким пептидным мотивам MaSpI (SEQ ID NO:43), MaSpII (SEQ ID NO:44), ADF-3 (SEQ ID NO:1) и/или ADF-4 (SEQ ID NO:2). «Повторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «по существу подобной» аминокислотной последовательности полипептида шелка, встречающегося в природе, например, может представлять собой часть полипептида шелка, соответствующую одному или нескольким пептидным мотивам MaSpI (SEQ ID NO:43), MaSpII (SEQ ID NO:44), ADF-3 (SEQ ID NO:1) и/или ADF-4 (SEQ ID NO:2), но включающее одно или несколько аминокислотных замещений в специфических аминокислотных положениях.

«Повторяющееся звено» не включает неповторяющихся гидрофильных аминокислотных доменов, в общем случае предположительно присутствующих на карбокси- и амино-концах полипептидов щелка, встречающихся в природе.

«Повторяющееся звено» в соответствии с настоящим изобретением дополнительно относится к аминокислотной последовательности, имеющей длину от 3 до 200 аминокислот или от 5 до 150 аминокислот, предпочтительно имеющую длину от 10 до 100 аминокислот или от 15 до 80 аминокислот, а более предпочтительно имеющую длину от 18 до 60 аминокислот или от 20 до 40 аминокислот. Например, повторяющееся звено, соответствующее настоящему изобретению, может иметь длину 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 аминокислот. Наиболее предпочтительно повторяющееся звено, соответствующее изобретению, состоит из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 аминокислот.

Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, предпочтительно состоит из аминокислот в количестве от 6 до 1500, аминокислот в количестве от 50 до 1500 или аминокислот в количестве от 200 до 1300, а наиболее предпочтительно аминокислот в количестве от 250 до 1200 или аминокислот в количестве в от 500 до 1000.

Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев. Например, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев. Наиболее предпочтительно полипептид шелка включает 4, 8, 12, 16, 24, 32 или 48 повторяющихся звеньев. Как упоминалось выше, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья. Таким образом, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать множественные копии одного идентичного повторяющегося звена (например, А₂ или С₁₆, где позиции 2 или 6 представляют количество повторяющихся звеньев) или множественные копии двух и более различных повторяющихся звеньев (например, (AQ)₂₄ или (QAQ)₈). Например. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 из 80 повторяющихся звеньев, которые могут быть включены в полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.

Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из аминокислотной последовательности любого полипептида шелка, известного специалисту в соответствующей области техники. Предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы или состоял бы из аминокислотной последовательности полипептида шелка насекомого, предпочтительно полипептида членистоногого или полипептида шелка паука. Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, также может включать или состоять из аминокислотной последовательности полипептида шелка митилид.

Предпочитается, чтобы полипептид шелка паука включал бы или состоял бы из аминокислотной последовательности полипептида большой ампуловидной железы (MaSp), такого как полипептид каркасной нити шелка паука, полипептида малой ампуловидной железы (MiSp), полипептида ловчей спиральной нити (flagelliform), полипептида шелка паука из древовидной железы (aggregate), полипептида шелка паука из дольковидной железы (aciniform) или полипептида шелка паука из грушевидной железы (pyriform). Наиболее предпочтительно полипептид шелк паука включает или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка паука каркасной нити или полипептида шелка паука ловчей спиральной нити. В общем случае предпочитается, чтобы аминокислотная последовательность полипептида каркасной нити или полипептида ловчей спиральной нити была бы выбрана из полипептида каркасной нити или полипептида ловчей спиральной нити пауков-кругопрядов Araneidae или Araneoid.

Предпочитается, чтобы полипептид шелка насекомого выключал бы или состоял бы из аминокислотной последовательности полипептида шелка Lepidoptera. Более предпочтительно полипептид шелка насекомого включает или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка Bombycidae, наиболее предпочтительно Bombyx mori.

Предпочтительно вышеупомянутые полипептиды шелка получаются рекомбинантным образом, то есть представляют собой рекомбинантные полипептиды шелка. Например, полипептиды шелка, использующиеся в способе настоящего изобретения, являются рекомбинантными полипептидами шелка паука, такими как полипептиды шелка паука каркасной нити или полипептиды шелка паука ловчей спиральной нити, рекомбинантными полипептидами шелка насекомого или рекомбинантными полипептидами шелка митилид.

Повторяющееся звено полипептида шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из аминокислотной последовательности любой области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка, известном специалистам в соответствующей области техники. Предпочтительно повторяющееся звено полипептида шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, включает или состоит из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует в полипептиде шелка насекомого, более предпочтительно в полипептиде шелка членистоногого или полипептиде шелка паука. Повторяющееся звено полипептида шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, также может включать или состоять из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует в полипептиде шелка митилид.

Предпочитается, чтобы повторяющееся звено шелка паука включало бы или состояло бы из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде большой ампуловидной железы (MaSp), таком как полипептид шелка паука каркасной нити, полипептиде малой ампуловидной железы (MiSp), полипептиде ловчей спиральной нити, полипептиде шелка паука из древовидной железы, полипептиде шелка паука из дольковидной железы или полипептиде шелка паука из грушевидной железы. Наиболее предпочтительно повторяющееся звено включает или состоит из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка паука каркасной нити или полипептиде шелка паука ловчей спиральной нити.

Предпочитается, чтобы повторяющееся звено шелка насекомого включало бы или состояло бы из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка Lepidoptera. Более предпочтительно повторяющееся звено шелка насекомого включает или состоит из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка насекомого Bombycidae, наиболее предпочтительно Bombyx mori.

Термин «консенсусная последовательность» в соответствии с использованием в контексте настоящего изобретения относится к аминокислотной последовательности, которая включает аминокислоты, которые часто присутствуют в определенном положении (например, «G») и где другие аминокислоты, которые не определяют дополнительно, заменяют символом-заполнителем «X».

Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из, по меньшей мере, двух идентичных повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно одну, консенсусную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из:

i) GPGXX (SEQ ID NO:3), где X представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из A, S, G, Y, Р, N и Q;

ii) GGX, где Х представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р и Q; и

iii) A_x, где х представляет собой целое число в диапазоне от 5 до 10.

Также предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы или состоял бы из, по меньшей мере, двух идентичных повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).

Повторяющиеся (пептидные) мотивы GPGXX (SEQ ID NO:3) и GGX, то есть мотивы, обогащенные глицином, придают гибкость полипептиду шелка и, таким образом, нити, полученной из белка шелка, включающего упомянутые мотивы. Говоря подробно, повторяющийся мотив GPGXX (SEQ ID NO:3) образует спиральные структуры β-поворот, которые придают полипептиду шелка эластичность. Как шелк большой ампуловидной железы, так и шелк ловчей спиральной нити включают мотив GPGXX (SEQ ID NO:3). Повторяющийся мотив GGX связан со спиральной структурой, включающей три аминокислоты на один виток, и встречается в большинстве шелков паука. Мотив GGX может придавать шелку дополнительные эластические свойства. Повторяющийся полиаланиновый А_х (пептидный) мотив образует кристаллическую структуру β-лист, которая придает полипептиду шелка прочность, (WO 03/057727). (Пептидные) мотивы GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19) выбирали из ресилина (WO 08/155304). Ресилин представляет собой эластомерный белок, встречающийся у большинства членистоногих (arthropodd). Он располагается в специализированных областях кутикулы, придавая низкую жесткость и высокую прочность (Elvin et al. Nature (473): 999-1002, 2005).

Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое 14 из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7). GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGQG (SEQ ID NO:40) и GPGGS (SEQ ID NO:11). В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7 или 8), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN и GGQ. В одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из ААААА (SEQ ID NO:12), АААААА (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16) и АААААААААА (SEQ ID NO:17).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGQG (SEQ ID NO:40), GPGGS (SEQ ID NO:11), GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN, GGQ, ААААА (SEQ ID NO:12), АААААА (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16), АААААААААА (SEQ ID NO:17), GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).

Наиболее предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из:

(i) GPGAS (SEQ ID NO:5), АААААА (SEQ ID NO:13), GGY и GPGSG (SEQ ID NO:6) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(ii) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGY (SEQ ID NO:7) и GPGGP (SEQ ID NO:8) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(iii) GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4) и GPGQQ (SEQ ID NO:4) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(iv) GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9) и GGP в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(v) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15),GPGQG (SEQ ID NO:40) и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(vi) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGG (SEQ ID NO:10), GGR, GGN и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(vii) GGA, GGA, GGA, GGS, GGA и GGS в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,

(viii) GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11) и GPGGY (SEQ ID NO:7) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке.

Необходимо отметить то, что, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в вышеупомянутые полипептиды шелка, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.

Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2