Высокоаффинные человеческие антитела к человеческому ангиопоэтину-2

Высокоаффинные человеческие антитела к человеческому ангиопоэтину-2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителам и их антиген-связывающим фрагментам, которые специфичны к ангиопоэтину-2 (Ang-2).

Уровень техники

Ангиогенез представляет собой биологический процесс, в результате которого образуются новые кровеносные сосуды.

Аберрантный ангиогенез ассоциирован с несколькими болезненными состояниями, включающими, например, пролиферативные ретинопатии, ревматоидный артрит и псориаз. Кроме того, хорошо известно, что ангиогенез является критическим для роста и поддержания опухоли. Ангиопоэтин-2 (Ang-2) является лигандом для рецептора Tie-2 (Tie-2), и, как было продемонстрировано, он играет роль в ангиогенезе. Ang-2 также обозначается в данной области техники как лиганд Tie-2 (США 5643755; Yancopoulos et al., 2000, Nature 407:242-248).

Антитела и другие пептидные ингибиторы, которые связываются с Ang-2, упомянуты в US 6166185; 7521053; 7205275; 2006/0018909 и 2006/0246071. Существует потребность в данной области техники в создании новых Ang-2-модулирующих агентов, включающих Ang-2-антитела, которые могут использоваться для лечения заболеваний и патологических состояний, вызванных или отягощенных ангиогенезом.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предлагаются человеческие антитела, которые связываются с человеческим Ang-2. Авторы настоящего изобретения ввиду различных очевидных сведений и исследований поняли необходимость создания Ang-2-ингибиторов, которые не связываются и не являются антагонистами родственной молекуле Ang-1. Например, предыдущие исследования продемонстрировали или предположили полезную роль Ang-1 в гемостазе (см., например, Li et al., 2001, Thrombosis and Haemostasis 85:191-374) и в защите сосудистой системы взрослого от просачивания плазмы (см., например, Thurston et al., 2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston et al., 1999, Science 286:2511-2514). Таким образом, авторам настоящего изобретения понятно, что в определенных анти-ангиогенных терапевтических случаях может быть полезным сохранение активности Ang-1. Соответственно, в настоящем изобретении предлагаются антитела, которые специфично связываются с Ang-2, но по существу не связываются с Ang-1. Настоящее изобретение также включает антитела, которые блокируют взаимодействие между Ang-2 и его рецептором Tie-2, но по существу не блокируют взаимодействие между Ang-1 и Tie-2. Антитела по изобретению применяются среди прочего для ингибирования ангиогенез-стимулирующих активностей Ang-2 и для лечения заболеваний и нарушений, вызванных или связанных с процессом ангиогенеза.

Антитела по изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут включать только антиген-связывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv), и могут быть модифицированы с воздействием на функциональность, например, с исключением остаточных эффекторных функций.

В одном воплощении, изобретение включает антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, включающего вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 514 и 516, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности. В одном воплощении, изобретение включает антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, включающие HCVR, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 42, 66, 162, 210, 266 и 434.

В одном воплощении, изобретение включает антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, включающие вариабельный участок легкой цепи (LCVR), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500 и 504, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или по меньшей мере, 99% идентичности последовательности. В одном воплощении, изобретение включает антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, включающие LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 44, 68, 164, 212, 274 и 442.

В конкретных воплощениях, антитело или его антиген-связывающий фрагмент включают пары аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 и 502/504. В одном воплощении, антитело или его фрагмент включают HCVR и LCVR, выбранные из пар аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 и 434/442.

В следующем аспекте, в изобретении предлагается антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, включающие домен тяжелой цепи CDR3 (HCDR3), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488 и 512, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; и домен легкой цепи CDR3 (LCDR3), выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472 и 496, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности.

В конкретных воплощениях, антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела включают пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 296/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472 и 488/496. В одном воплощении, антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела включают пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 152/160, 200/208, 272/280 и 440/448. Не ограничивающие примеры анти-Ang-2 антител, содержащих эти пары HCDR3/LCDR3, представляют собой антитела, обозначенные H1 H685, H1 H690, H1 H691, H1 H696, H1 H706, H1 M724 и H2M744, соответственно.

В следующем воплощении, изобретение включает антитело или его фрагмент, дополнительно включающие домен HCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484 и 508, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; домен тяжелой цепи CDR2 (HCDR2), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486 и 510, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; домен LCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468 и 492, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; и домен LCDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470 и 494, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности.

Конкретные не ограничивающие типичные антитела и антиген-связывающие фрагменты по изобретению включают домены HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, соответственно, выбранные из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14 и 16 (например, H1 H685); (ii) SEQ ID NO: 28, 30, 32, 36, 38 и 40 (например, H1 H690); (iii) SEQ ID NO: 52, 54, 56, 60, 62 и 64 (например, H1 H691 ); (iv) SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 и 160 (например, H1 H696); (v) SEQ ID NO: 196, 198, 200, 204, 206 и 208 (например, H1 H706); (vi) SEQ ID NO: 268, 270, 272, 276, 278 и 280 (например, H1 M724); и (vii) SEQ ID NO: 436, 438, 440, 444, 446 и 448 (например, H2M744).

В родственном воплощении, изобретение включает антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, которые специфично связывается с Ang-2, где антитело или фрагмент включают домены тяжелой и легкой цепи CDR (т.e., CDR1, CDR2 и CDR3), содержащиеся в последовательностях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 и 502/504. В одном воплощении, антитело или его фрагмент включают последовательности CDR, содержащиеся внутри HCVR и LCVR, выбранные из пар аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 и 434/442.

В другом аспекте, в изобретении предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие анти-Ang-2 антитела или их фрагменты. Также изобретением охватываются рекомбинантные экспрессирующие векторы, несущие нуклеиновые кислоты по изобретению, и клетки-хозяева, в которые вводятся такие векторы, а также способы получения антител путем культивирования клеток в условиях, дающих возможность продуцирования антител и извлечения полученных антител.

В одном воплощении, в изобретении предлагается антитело или его фрагмент, включающие HCVR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 513 и 515, или по существу из идентичной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности. В одном воплощении, антитело или его фрагмент включают HCVR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 41, 65, 161, 209, 265 и 433.

В одном воплощении, в изобретении предлагается антитело или его фрагмент, включающие LCVR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475, 479, 489, 499 и 503, или по существу из идентичной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности. В одном воплощении, антитело или его фрагмент включают LCVR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 43, 67, 163, 211, 273 и 441.

В одном воплощении, в изобретении предлагается антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, включающие домен HCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 415, 439, 463, 487 и 511, или из по существу идентичной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; и домен LCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471 и 495, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или по меньшей мере, 99% идентичности последовательности. В одном воплощении, антитело или его фрагмент включают последовательности HCDR3 и LCDR3, кодируемые парой последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7/15, 31/39, 55/63, 151/159, 199/207, 271/279 и 439/447.

В следующем воплощении, антитело или его фрагмент дополнительно включают: домен HCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 411, 435, 459, 483 и 507, или из по существу идентичной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; домен HCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485 и 509, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; домен LCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467 и 491, или из по существу идентичной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности; и домен LCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421, 445, 469 и 493, или из по существу подобной им последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности.

В одном воплощении, антитело или его фрагмент включают последовательности CDR тяжелой и легкой цепи, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 17 и 19; SEQ ID NO: 41 и 43; SEQ ID NO: 65 и 67; SEQ ID NO: 161 и 163; SEQ ID NO: 209 и 211; SEQ ID NO: 265 и 273; или SEQ ID NO: 433 и 441.

Изобретение охватывает анти-Ang-2 антитела, имеющие модифицированный профиль гликозилирования. В некоторых применениях может использоваться модификация для удаления сайтов гликозилирования. Например, настоящее изобретение охватывает модифицированные варианты любого антитела, представленного в настоящем документе, где модифицированный вариант лишен фукозного компонента, присутствующего на олигосахаридной цепи, например, для увеличения функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других применениях, может быть осуществлена модификация галактозилирования с целью модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC).

В другом аспекте, в изобретении предлагается фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантное человеческое антитело или его фрагмент, которые специфично связываются с Ang-2, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В родственном аспекте, изобретение описывает композицию, которая представляет собой комбинацию ингибитора Ang-2 и второго терапевтического агента. В одном воплощении, ингибитор Ang-2 представляет собой антитело или его фрагмент. В одном воплощении, второй терапевтический агент представляет собой любой агент, который преимущественно объединяется с ингибитором Ang-2. Типичные агенты, которые могут преимущественно объединяться с ингибитором Ang-2, включают без ограничения любой агент, который ингибирует или уменьшает ангиогенез, другие противораковые терапевтические агенты, противовоспалительные агенты, ингибиторы цитокинов, ингибиторы факторов роста, противогемопоэтические факторы, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), противовирусные агенты и антибиотики.

Еще в одном аспекте, в изобретении предлагаются способы ингибирования активности Ang-2 с применением анти-Ang-2 антитела или антиген-связывающего фрагмента антитела по изобретению, где терапевтические способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела по изобретению. Нарушение, подвергаемое лечению, представляет собой любое заболевание или патологическое состояние, которое улучшается, ослабляется, ингибируется или предотвращается путем удаления, ингибирования или уменьшения активности Ang-2. Предпочтительно, анти-Ang-2 антитело или фрагмент антитела по изобретению применяются для лечения любого заболевания или патологического состояния, вызванного, ассоциированного или сохраняющегося с помощью процесса ангиогенеза. В конкретных воплощениях изобретения, анти-Ang-2 антитела или их антиген-связывающие участки применяются для лечения рака. В контексте противораковых терапий, анти-Ang-2 антитела по изобретению или их антиген-связывающие участки могут вводиться отдельно или в комбинации с другими противораковыми терапевтическими антителами, химиотерапевтическими агентами и/или с лучевой терапией. В других воплощениях настоящего изобретения анти-Ang-2 антитела или их антиген-связывающие фрагменты применяются для лечения одного или нескольких глазных нарушений, например, возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии и т.д., и/или одного или нескольких воспалительных или инфекционных заболеваний.

Другие воплощения становятся очевидными в результате обзора подробного описания.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой выравнивание последних 88 C-концевых аминокислот человеческого Ang-2 (остатки 409-496 SEQ ID NO:518) с соответствующей аминокислотной последовательностью человеческого Ang-1 (SEQ ID NO:531). Остатки, которые отличаются у hAng-1 и hAng-2, отмечены белым шрифтом и черной штриховкой. Звездочками (*) отмечены аминокислоты hAng-2, которые, как было продемонстрировано с помощью анализа кристаллической структуры, взаимодействуют с человеческим Tie-2. См. Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 73:524-532 (2006). Треугольниками (▲^) отмечены положения аминокислот, взаимодействующих с Tie-2, которые отличаются у hAng-2 и hAng-1.

Фиг.2 (Панели A-C) изображает результаты Вестерн-блот анализов, которые иллюстрируют степень, до которой Ang-2-связывающие молекулы ингибируют или не способны ингибировать индуцированное с помощью Ang-1 фосфорилирование Tie-2.

Фиг.3 представляет собой краткое изложение эксперимента связывания с точечным мутантом Ang-2FD-mFc Примера 13, демонстрирующего аминокислотные замены, которые приводят в результате к более чем пятикратному уменьшению T_1/2 диссоциации (изображено закрашенными кругами •) по отношению к дикому типу для различных тестированных антител и пептител (peptibodies).

Подробное описание

Перед тем как настоящее изобретение будет дополнительно описано, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными описанными методами и экспериментальными условиями, поскольку такие методы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что использованная в настоящем документе терминология необходима только для целей описания конкретных воплощений, и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которые будут ограничены только прилагаемой формулой изобретения.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение. При использовании в настоящем документе, термин "примерно", когда он используется в отношении конкретного приведенного значения, обозначает, что значение может варьироваться относительно приведенного значения не более чем на 1%. Например, при использовании в настоящем документе, выражение "примерно 100" включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).

Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, также могут использоваться на практике или при тестировании настоящего изобретения, далее будут описаны предпочтительные методы и материалы.

Определения

При использовании в настоящем документе, термин "ангиопоэтин-2" или "Ang-2", пока не определено, что он имеет происхождение из вида, отличного от человека, (например, "мышиный Ang-2", "обезьяний Ang-2" и т.д.), обозначает человеческий Ang-2 или его биологически активный фрагмент (например, фрагмент белка Ang-2, который способен индуцировать ангиогенез in vitro или in vivo). Человеческий Ang-2 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:517, и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:518. Аминокислотные последовательности мышиного и обезьяньего белков Ang-2 доступны из базы данных NCBI белковых последовательностей под Регистрационными номерами NP_031452 и BAE89705.1, соответственно.

Термин "ангиопоэтин-1" или "Ang-1 ", пока не определено, что он имеет происхождение из вида, отличного от человека, (например, "мышиный Ang-1", "обезьяний Ang-1" и т.д.), обозначает человеческий Ang-1 или его биологически активный фрагмент. Человеческий Ang-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в базе данных NCBI белковых последовательностей под Регистрационным номером AAB50557. Термин "Tie-2" (также обозначаемый в уровне техники как "TEK"), пока не определено, что он имеет происхождение из вида, отличного от человека, (например, "мышиный Tie-2", "обезьяний Tie-2" и т.д.), обозначает человеческий Tie-2 или его биологически активный фрагмент. Человеческий Tie-2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в базе данных NCBI белковых последовательностей под Регистрационным номером AAA61130.

Термин "антитело", при использовании в настоящем документе, предназначен для обозначения молекул иммуноглобулинов, включающих четыре полипептидные цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанных между собой дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (обозначенный в настоящем документе как HCVR или V_H) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи включает три домена, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (обозначенный в настоящем документе как LCVR или V_L) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи включает один домен (C_L1). Участки V_H и V_L могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности, называемыми участками, отвечающими за комплементарность связывания (CDR), перемежаясь участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждый V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных воплощениях изобретения, FR-участки анти-Ang-2 антитела (или его антиген-связывающего участка) могут быть идентичны с человеческими зародышевыми последовательностями или могут быть естественно или искусственно модифицированы. Консенсусная аминокислотная последовательность может определяться на основе параллельного анализа двух или нескольких CDR.

При использовании в настоящем документе, термин "антитело" также включает антиген-связывающие фрагменты полноразмерных молекул антитела. При использовании в настоящем документе, термины "антиген-связывающий участок" антитела, "антиген-связывающий фрагмент" антитела и тому подобные, включают любой естественный, получаемый ферментативно, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфично связывается с антигеном с образованием комплекса. Антиген-связывающие фрагменты антитела могут быть выделены, например, из полноразмерных молекул антитела с использованием любых подходящих стандартных методов, таких как протеолитический гидролиз или методы генетической инженерии, включающие манипуляцию и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антитела. Такая ДНК известна и общедоступна, например, из коммерческих источников, ДНК-библиотек (включающих, например, фаговые библиотеки антител), или может быть синтезирована. ДНК может быть секвенирована, и с ней проводят манипуляции с использованием химических методов или с использованием методов молекулярной биологии, например, для расположения одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или для введения кодонов, создания цистеиновых остатков, модификации, вставки или делеции аминокислот и т.д.

Не ограничивающие примеры антиген-связывающих фрагментов включают: (i) Fab-фрагменты; (ii) F(ab')₂-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменты; и (vii) минимальные распознающие компоненты, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный участок антитела (например, выделенный участок, отвечающий за комплементарность связывания (CDR)). При использовании в настоящем документе, выражение "антиген-связывающий фрагмент" также охватывает другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и минитела.

Антиген-связывающий фрагмент антитела также будет включать, по меньшей мере, один вариабельный домен. Вариабельный домен может быть любого размера или аминокислотного состава и, как правило, будет включать, по меньшей мере, один CDR, который расположен по соседству или находится в одной рамке с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антиген-связывающих фрагментах, содержащих домен V_H, ассоциированный с доменом V_L, домены V_H и V_L могут находиться относительно друг друга в подходящем расположении. Например, вариабельный участок может быть димерным и может содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. Альтернативно, антиген-связывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен V_H или V_L.

В конкретных воплощениях, антиген-связывающий фрагмент антитела может содержать, по меньшей мере, один вариабельный домен, ковалентно связанный, по меньшей мере, с одним константным доменом. Не ограничивающие типичные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут обнаружиться внутри антиген-связывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению, включают: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (V) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включающей любую из типичных конфигураций, приведенных выше, вариабельные и константные домены могут быть связаны или непосредственно друг с другом, или могут быть связаны посредством полного или частичного шарнирного или линкерного участка. Шарнирный участок состоит, по меньшей мере, из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, которые приводят в результате к получению гибкой или полугибкой связи между соседними вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антиген-связывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может включать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) любой из конфигураций вариабельных и константных доменов, перечисленных выше, в нековалентной связи друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами V_H или V_L (например, с помощью дисульфидной связи(ей)).

Также как и полноразмерные молекулы антител, антиген-связывающие фрагменты могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными (например, биспецифичными). Мультиспецифичный антиген-связывающий фрагмент антитела, как правило, будет включать, по меньшей мере, два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен к специфичному связыванию с отдельным антигеном или с различными эпитопами на одном антигене. Любой мультиспецифичный формат антитела, включающий типичные биспецифичные форматы антител, раскрытых в настоящем документе, может быть адаптирован для применения в контексте антиген-связывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с использованием стандартных методов, доступных из уровня техники.

Константный участок антитела имеет значение для способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать клеточно-опосредованную цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основе того, целесообразно ли для антитела опосредование цитотоксичности.

При использовании в настоящем документе, подразумевается, что термин "человеческое антитело" включает антитела, содержащие вариабельные и константные участки, выделенные из последовательностей человеческих зародышевых иммуноглобулинов. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями зародышевых иммуноглобулинов (например, мутации, введенные неспецифическим или сайтспецифическим мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo), например, в участках CDR и особенно в CDR3. Однако, при использовании в настоящем документе, подразумевается, что термин "человеческое антитело" не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мыши, были пересажены в человеческие каркасные последовательности.

При использовании в настоящем документе, подразумевается, что термин "рекомбинантное человеческое антитело" включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицированного в клетку-хозяин (описано ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител (описано ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которые являются трансгенными для человеческих генов иммуноглобулинов (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любого другого способа, который включает сплайсинг последовательностей человеческих генов иммуноглобулинов с другими ДНК-последовательностями. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные и константные участки, полученные из последовательностей человеческих зародышевых иммуноглобулинов. В некоторых воплощениях, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты in vitro-мутагенезу (или, если используются трансгенные по отношению к человеку последовательности иммуноглобулинов животных, то соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности участков V_H и V_L рекомбинантных антител являются последовательностями, которые хотя и происходят из и относятся к человеческим зародышевым последовательностям V_H и V_L, при этом не могут существовать в естественных условиях в зародышевом репертуаре человеческих антител in vivo.

Человеческие антитела могут существовать в двух формах, которые связаны с шарнирной гетерогенностью. В одной форме, молекула иммуноглобулина включает стабильную конструкцию из четырех цепей приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры поддерживаются вместе с помощью взаимодействия дисульфидной связи тяжелой цепи. Во второй форме, димеры не связаны посредством дисульфидных связей между цепями, и образуется молекула с молекулярной массой примерно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепи (полу-антитело). Эти формы очень трудно разделить даже после аффинной очистки.

Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG ассоциирована в частности с изотипом шарнирного участка антитела. Единственная аминокислотная замена в шарнирном участке шарнира человеческого IgG4 может значительно уменьшать частоту появления второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровня, который, как правило, наблюдается с использованием шарнира человеческого IgG1. Настоящее изобретение охватывает антитела, содержащие одну или несколько мутаций в шарнирном участке, C_H2 или C_H3 участке, которые могут быть целесообразны, например, при получении антитела для улучшения выхода целевой формы антитела.

При использовании в настоящем документе, подразумевается, что "выделенное антитело" обозначает антитело, которое по существу свободно от других антител, обладающих отличными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим Ang-2 или с фрагментом человеческого Ang-2, по существу свободно от антител, которые специфично связываются с антигенами, отличными от человеческого Ang-2). Термин "специфично связывается" или ему подобные означает, что антитело или его антиген-связывающий фрагмент образуют с антигеном комплекс, который относительно стабилен при физиологических условиях. Специфичное связывание может характеризоваться K_D примерно 1×10^-8 M или менее. Методы определения того, специфично ли связываются две молекулы, хорошо известны из уровня техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и тому подобные. Выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим Ang-2, может однако обладать перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы Ang-2 из других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.

При использовании в настоящем документе, подразумевается, что "нейтрализующее" или "блокирующее" антитело обозначает антитело, связывание которого с Ang-2 блокирует взаимодействие между Ang-2 и его рецептором (Tie-2) и/или приводит в результате к ингибированию, по меньшей мере, одной биологической функции Ang-2. Ингибирование, вызванное антителом, нейтрализующим или блокирующим Ang-2, необязательно должно быть полным при условии, что оно детектируется при использовании подходящего анализа. Типичные анализы для детектирования ингибирования Ang-2 описаны в другом месте настоящего документа.

Полностью человеческие анти-Ang-2 антитела, раскрытые в настоящем документе, могут включать одну или несколько аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасном и/или в участках CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи по сравнению с соответствующими зародышевыми последовательностями. Такие мутации легко могут быть идентифицированы путем сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, с зародышевыми последовательностями, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антиген-связывающие фрагменты, которые получены из любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, где одна или несколько аминокислот внутри одного или нескольких каркасных и/или участков CDR мутировали обратно по отношению к соответствующим зародышевым остаткам или к консервативной аминокислотной замене (естественной или искусственной) соответствующих зародышевых остатков (такие замены последовательности обозначаются в настоящем документе как "зародышевые обратные мутации"). Специалист в данной области, имея исходно последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем документе, легко может получить множество антител и антиген-связывающих фрагментов, которые включают одну или несколько индивидуальных зародышевых обратных мутаций или их комбинацию. В некоторых воплощениях, каждый из остатков каркасных и/или CDR участков внутри доменов V_H и/или V_L мутируют обратно в зародышевую последовательность. В других воплощениях, только конкретные остатки мутируют обратно в зародышевую последовательность, например, только мутированные остатки обнаружены внутри первых 8 аминокислот FR1 или внутри последних 8 аминокислот FR4, или только мутированные остатки обнаружены внутри CDR1, CDR2 или CDR3. Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или нескольких зародышевых обратных мутаций внутри каркасных и/или CDR участков, т.e., где конкретные индивидуальные остатки мутируют обратно к зародышевой последовательности, в то время как некоторые другие остатки, которые отличаются от зар