Антитела к интегрину альфа-2 и их применения

Антитела к интегрину альфа-2 и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в основном относится к антителам, направленным на интегрин α2β1, и их применениям, включая гуманизированные антитела к интегрину альфа-2 (α2), и способам лечения антителами к интегрину α2. Конкретнее, настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к интегрину α2, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, константную область легкой цепи человека и вариантную константную область тяжелой цепи IgG1 человека, которые проявляют измененную эффекторную функцию.

ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Интегрин α2β1 («очень поздний антиген 2» - Very late antigen 2; VLA-2) экспрессируется на различных типах клеток, включая тромбоциты, эндотелиальные клетки сосудов, эпителиальные клетки, активированные моноциты/макрофаги, фибробласты, лейкоциты, лимфоциты, активированные нейтрофилы и тучные клетки (Hemler, Annu Rev Immunol 8:365:365-400 (1999); Wu and Santoro, Dev. Dyn. 206:169-171 (1994); Edelson et. al., Blood. 103(6):2214-20 (2004); Dickeson et al, Cell Adhesion and Communication. 5: 273-281 (1998)). Наиболее типичные лиганды для α2β1 включают коллаген и ламинин, оба из которых обнаруживаются во внеклеточном матриксе. Обычно I-домен интегрина α2 связывается с коллагеном зависимым от наличия двухвалентных катионов образом, в то время как этот же домен связывается с ламинином посредством как зависимого от наличия двухвалентных катионов, так и независимого от наличия двухвалентных катионов механизмов (Dickeson et al, Cell Adhesion and Communication. 5: 273-281 (1998)). Специфичность интегрина α2β1 варьирует в зависимости от типа клеток, и он служит рецептором коллагена и/или ламинина для определенных типов клеток, например, интегрин α2β1 известен как рецептор коллагена для тромбоцитов и рецептор ламинина для эндотелиальных клеток (Dickeson et al, J Biol. Chem. 272: 7661-7668 (1997)). Эховирус-1, декорин, Е-кадгерин, матриксная металлопротеиназа I (MMP-I), эндорепеллин и многочисленные коллектины, а также белок комплемента C1q также являются лигандами для интегрина α2β1 (Edelson et al., Blood 107(1): 143-50 (2006)). Интегрин α2β1 вовлечен в несколько биологических и патологических процессов, включая коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, миграцию клеток по коллагену, клеткозависимую реорганизацию коллагеновых волокон, а также коллагенозависимые клеточные ответы, которые приводят к увеличению экспрессии цитокинов и пролиферации (Gendron, J. Biol. Chem. 278:48633-48643 (2003); Andreasen et al., J. Immunol. 171:2804-2811 (2003); Rao et al., J. Immunol. 165(9):4935-40 (2000)), аспекты функционирования Т-клеток, тучных клеток и нейтрофилов (Chan et. al., J. Immunol. 147:398-404 (1991); Dustin and de Fougerolles, Curr Opin Immunol 13:286-290 (2001), Edelson et. al., Blood. 103(6):2214-20 (2004), Werr et al., Blood 95:1804-1809 (2000)), аспекты гиперчувствительности замедленного типа, контактной гиперчувствительности и коллаген-индуцированного артрита (de Fougerolles et. al., J. Clin. Invest. 105:721-720 (2000); Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002)), морфогенез протоков молочной железы (Keely et. al., J. Cell Sci. 108:595-607 (1995); Zutter et al., Am. J. Pathol. 155(3):927-940 (1995)), заживление эпидермальных ран (Pilcher et. al., J. Biol. Chem. 272:181457-54 (1997)) и процессы, связанные с VEGF-индуцированным ангиогенезом (Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002)).

Взаимодействия интегрин/лиганд могут способствовать выхождению лейкоцитов в воспаленные ткани (Jackson et al., J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997); Gadek et al., Science 295(5557):1086-9 (2002), Sircar et al., Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002)), а также играть важную роль в последующих событиях после первоначального выхождения лейкоцитов из кровотока в ткани в ответ на воспалительные стимулы, включая миграцию, рекрутинг и активацию провоспалительных клеток в месте воспаления (Eble J.A., Curr. Phar. Des. 11(7):867-880 (2005)). Сообщалось, что некоторые антитела, блокирующие интегрин α2β1, оказывают влияние на реакции гиперчувствительности замедленного типа и эффективность в мышиной модели ревматоидного артрита и модели воспалительного заболевания кишечника (Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002); de Fougerolles et. al., J. Clin. Invest. 105:721-720 (2000)) и, как сообщалось, ослабляют пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток in vitro (Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002)), что позволяет предположить, что блокирование интегрина α2β1 может предотвращать/ингибировать аномальный ангиогенез или ангиогенез выше нормального, который наблюдается при различных видах рака.

Предполагается, что терапевтическое антитело, связывающее интегрин α2β1, включая интегрин α2β1 на тромбоцитах, может приводить к осложнениям с кровотечениями. Например, антитела, нацеленные на другие рецепторы тромбоцитов, такие как GPIb (Vanhoorelbeke et al., Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2):125-40 (2003)) или GP IIb/IIIa (Schell et al., Ann. Hematol. 81:76-79 (2002), Nieswandt and Watson, Blood 102(2):449-461 (2003), Merlini et al., Circulation 109:2203-2206 (2004)), связаны с тромбоцитопенией, хотя механизмы, лежащие в основе этого, до конца не ясны. Была выдвинута гипотеза, что связывание антитела с рецептором тромбоцита может изменять его трехмерную структуру и делать доступными эпитопы, которые в норме недоступны, что в дальнейшем приводит к уничтожению тромбоцитов (Merlini et al., Circulation 109:2203-2206 (2004)). В самом деле, осложнения с кровотечениями, связанные с пероральными дозами антагонистов GP IIa/IIIb, были описаны как «темная сторона» этого класса соединений (Bhatt and Topol, Nat. Rev. Drug Discov. 2(1):15-28 (2003)). Если интегрин α2β1 играет важную роль в перемещении лейкоцитов через воспаленную ткань, то было бы желательным разработать терапевтические средства, которые могли бы нацеливаться на α2β1 при болезнях, нарушениях, связанных с интегрином α2β1, и/или клеточных процессах, связанных с данными нарушениями, включая рак, воспалительные заболевания и автоиммунные заболевания, если такие средства не будут активировать тромбоциты. Гуманизированные антитела, способные нацеливаться на интегрин α2β1, как, например, интегрин α2β1 на лейкоцитах, которые не связаны с побочными осложнениями с кровотечениями, описываются в WO2007/056858. Гуманизированные антитела к интегрину α2, описанные там, представляют собой новую подгруппу антител к α2, которые характеризуются неожиданным отсутствием осложнений с кровотечениями in vivo и/или отсутствием активации интегрина α2β1 тромбоцитов. Антитела IgG4, раскрытые в WO2007/056858, однако, не несут эффекторных функций, таких как ADCC и/или CDC, которые желательны при определенных обстоятельствах, например, для лечения нарушений, связанных с интегрином α2β1, таких как рак, где эти функциональные свойства приводят к повышенной эффективности лечения. Таким образом, желательно было бы разработать антитела к интегрину α2β1, которые будут проявлять эти эффекторные функции в высокой степени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 показан клеточный анализ CDC выбранных вариантов антител к VLA2: (1) IgG4 к VLA2; (2) IgG1 к VLA2; (3) IgG2 к VLA2; (4) IgG3 к VLA2; (5) IgG1133 к VLA2; (6) IgG3133 к VLA2; (7) IgG1-S324N к VLA2; (8) IgG1-S298A к VLA2; (9) IgG1-E269D к VLA2; (10) IgG1-E269D/S298A/S324N к VLA2; (11) IgG1-S298A/S324N к VLA2; (12) IgG1-контроль; (13) отрицательный контроль - без антител.

На фигуре 2 показан клеточный анализ ADCC выбранных вариантов антител к VLA2 в конечной концентрации 0,1 мкг/мл: (1) IgG4 к VLA2; (2) IgG1 к VLA2; (3) IgG2 к VLA2; (4) IgG3 к VLA2; (5) IgG1133 к VLA2; (6) IgG3133 к VLA2; (7) IgG1-S324N к VLA2; (8) IgG1-S298A к VLA2; (9) IgG1-E269D к VLA2; (10) IgG1-E269D/S298A/S324N к VLA2; (11) IgG1-S298A/S324N к VLA2; (12) IgG1-контроль; (13) отрицательный контроль - без антител.

На фигуре 3 показан клеточный анализ ADCC выбранных вариантов антител к VLA2 в конечной концентрации 0,01 мкг/мл: (1) IgG4 к VLA2; (2) IgG1 к VLA2; (3) IgG2 к VLA2; (4) IgG3 к VLA2; (5) IgG1133 к VLA2; (6) IgG3133 к VLA2; (7) IgG1-S324N к VLA2; (8) IgG1-S298A к VLA2; (9) IgG1-E269D к VLA2; (10) IgG1-E269D/S298A/S324N к VLA2; (11) IgG1-S298A/S324N к VLA2; (12) IgG1-контроль; (13) отрицательный контроль - без антител.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает гуманизированное антитело к интегрину α2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, константную область легкой цепи человека и вариантный константный домен тяжелой цепи IgG1 человека, при этом вариантная константная область тяжелой цепи IgG1 человека включает по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно константной области тяжелой цепи IgG1 человека исходного гуманизированного антитела к интегрину α2, и при этом данное антитело проявляет измененную эффекторную функцию по сравнению с исходным гуманизированным антителом к интегрину α2.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутое гуманизированное антитело к интегрину α2β1.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает вектор, содержащий вышеупомянутую нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает клетку-хозяина, содержащую вышеупомянутую нуклеиновую кислоту или вышеупомянутый вектор.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает композицию, содержащую вышеупомянутое гуманизированное антитело к интегрину α2 и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает набор, включающий вышеупомянутые гуманизированное антитело к интегрину α2 или вышеупомянутую композицию и инструкции для лечения нарушения, связанного с интегрином 2β1.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения нарушения, связанного с интегрином α2β1, у субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества вышеупомянутого антитела к интегрину α2 или вышеупомянутой композиции.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ ингибирования связывания лейкоцитов с коллагеном, включающий введение субъекту некоторого количества вышеупомянутого антитела к интегрину α2β1 или вышеупомянутой композиции, эффективное для ингибирования связывания лейкоцитов с коллагеном.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение вышеупомянутого гуманизированного антитела к интегрину α2 или вышеупомянутой композиции в качестве лекарственного препарата.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение вышеупомянутого гуманизированного антитела к интегрину α2 или вышеупомянутой композиции для лечения нарушения, связанного с интегрином α2β1.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает вышеупомянутое гуманизированное антитело к интегрину α2 или вышеупомянутую композицию для применения в способе лечения нарушения, связанного с интегрином α2β1.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение вышеупомянутого гуманизированного антитела к интегрину α2 или вышеупомянутой композиции для получения лекарственного препарата для лечения нарушения, связанного с интегрином α2β1.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает антитело, содержащее вариантную Fc-область IgG человека, которая содержит аминокислотную замену S324N, замещающую серин в аминокислотном положении 324 исходного антитела на аспарагин, при этом антитело демонстрирует улучшенную комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и улучшенную антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) по сравнению с исходным антителом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к интегрину α2, которые проявляют измененную эффекторную функцию по сравнению с исходным гуманизированным антителом к интегрину α2.

Интегрин α2β1 является молекулой, состоящей из субъединицы интегрина α2 из семейства альфа-интегринов и субъединицы интегрина β1 из семейства бета-интегринов, и может происходить от любого субъекта, включая млекопитающее, но предпочтительно происходит от человека. Интегрин α2β1 может быть очищен из любого естественного источника или может быть получен синтетически (например, с помощью технологии рекомбинантных ДНК). Кодирующие последовательности нуклеиновой кислоты для интегрина α2 и интегрина β1 описываются в Takada and Hemler J. Cell Biol. 109(1):397-407 (1989; номер регистрации в GenBank - X17033; впоследствии обновлена на запись NM 002203) и Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep 105(3):1183-90 (1987; номер регистрации в GenBank - X07979.1 и родственные последовательности, представляющие собой варианты, полученные в результате альтернативного сплайсинга) соответственно.

«I»-домен молекулы интегрина α2β1 относится к области данной молекулы интегрина α2β1 внутри субъединицы α2 и описывается, например, в Kamata et al., J Biol. Chem. 269:9659-9663(1994); Emsley et al., J. Biol. Chem. 272:28512 (1997) и Cell 101:47 (2000). I-домен интегрина α2 содержит лигандсвязывающий участок типа MIDAS (Metal Ion Dependent Adhesion Site - участок адгезии, зависимый от ионов металлов), который имеет потребность в данном двухвалентном катионе и специфичность к нему для поддержания связывания лигандов.

Нарушение, связанное с интегрином α2, включает нарушение, заболевание или состояние, которое вовлекает зависимые от интегрина α2 процессы/функцию (например, связывание, активность), опосредующие аберрантные клеточные реакции внутри ткани-мишени. Примеры зависимых от интегрина α2 процессов, вовлеченных в заболевание, включают коллагензависимые клеточные реакции, такие как вовлеченные в повышение экспрессии цитокинов и повышение пролиферации, аспекты функционирования Т-клеток, тучных клеток и нейтрофилов, воспалительные нарушения, морфогенез протоков молочной железы, заживление эпидермальных ран и ангиогенез. Примеры нарушений, связанных с интегрином α2, включают, но без ограничений, воспалительные заболевания или нарушения, которые включают, но без ограничений, воспалительное заболевание кишечника (такое как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), реакции на трансплантат (включая отторжение трансплантата), неврит зрительного нерва, травму спинного мозга, ревматоидный артрит, рассеянный склероз (включая лечение связанных с ними неврологических последствий, а также рассеянный склероз, характеризуемый рецидивами), аутоиммунные заболевания или нарушения (включая системную красную волчанку (СКВ), сахарный диабет, синдром Рейно, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, синдром Шегрена, склеродермию), юношеский сахарный диабет и нарушения, связанные с аномальным ангиогенезом или ангиогенезом выше нормального (такие как диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна, сердечно-сосудистое заболевание, псориаз, ревматоидный артрит и рак), а также инфекции, которые индуцируют воспалительную реакцию.

Лечение нарушения, связанного с интегрином α2β1, включает как терапевтическое применение, так и профилактическое или предупредительное применение антител к интегрину α2, описываемых в данном документе. Нуждающиеся в лечении включают пациентов с уже диагностированным расстройством, а также пациентов, у которых проявление нарушения необходимо предупредить или отсрочить.

Выражения «антитела к интегрину α2», или «антитело, которое связывается с α2», или «антитело, которое связывается с субъединицей интегрина α2», или «антитела к VLA-2», в настоящем документе применяются в качестве синонимов и включают антитела, предпочтительно гуманизированные IgG-антитела, которые связываются с интегрином α2 человека, например, которые связываются с иммобилизованным α2β1 с аффинностью (Kd) 50 нМ или меньше, предпочтительно 10 нМ или меньше, более предпочтительно 1 нМ или меньше, в частности 0,5 нМ или меньше.

Под выражениями «исходное гуманизированное антитело к интегрину α2», или «исходное антитело к интегрину α2», или «исходное антитело к VLA-2», которые в настоящем документе применяются в качестве синонимов, подразумевают антитело, которое связывается с интегрином α2 человека, например гуманизированное антитело IgG1 к интегрину α2, которое может быть модифицировано с тем, чтобы включать вариантную константную область тяжелой цепи IgG1 человека. Исходное гуманизированное антитело к интегрину α2 идентично антителу, которое включает вариантную константную область тяжелой цепи IgG1 человека, за исключением аминокислотной модификации в константной области тяжелой цепи IgG1 человека, и обычно является антителом с нативной константной областью тяжелой цепи IgG1 человека. Аминокислотная модификация предпочтительно не изотипна.

Выражение «антитело» или «иммуноглобулин» применяют в наиболее широком смысле, и оно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и полиспецифичные антитела, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. Выражение антитело или иммуноглобулин включает полноразмерные антитела, а также их фрагменты, которые обладают антигенсвязывающими свойствами, т.е. которые связываются с интегрином α2. Выражение «антитело» включает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий фрагмент. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в настоящем документе имеет аббревиатуру VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в настоящем документе имеет аббревиатуру VL) и константной области легкой цепи (в настоящем документе имеет аббревиатуру CL). Константная область легкой цепи состоит из одного домена. VH и VL области можно дополнительно разделить на области гипервариабельности, называемые гипервариабельными участками (CDR), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR или FW). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Выражение «полноразмерное антитело», применяемое в настоящем документе, включает структуру, которая устанавливает естественную биологическую форму антитела, включающую вариабельные и константные области. Например, у большинства млекопитающих, включая человека и мышей, полноразмерное антитело класса IgG является тетрамером и состоит из двух идентичных пар из двух иммуноглобулиновых цепей, при этом каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь, при этом каждая легкая цепь содержит домены иммуноглобулина VL и CL, и каждая тяжелая цепь содержит домены иммуноглобулина VH, CH1 (C[гамма]1), CH2 (C[гамма]2) и CH3 (C[гамма]3). У некоторых млекопитающих, например у верблюдов и лам, антитела IgG могут состоять только из двух тяжелых цепей, при этом каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен, прикрепленный к Fc-области.

Выражение «химерное антитело», применяемое в настоящем документе, включает антитела, у которых последовательности вариабельной области получены от одного вида, а последовательности константной области получены от другого вида, как, например, антитело, у которого последовательности вариабельной области получены от антитела мыши, а последовательности константной области получены от антитела человека.

Выражение «гуманизированное антитело», применяемое в настоящем документе, включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные от зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека. Дополнительные изменения каркасной области могут быть сделаны внутри каркасных последовательностей человека, а также в последовательностях CDR, полученных от зародышевой линии другого вида млекопитающего.

Выражение «антитело человека», применяемое в настоящем документе, включает антитела с вариабельными областями, в которых как каркасные области, так и CDR, получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также получена из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека настоящего изобретения могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, внесенные случайным или сайтспецифичным мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo). Однако выражение «антитело человека», применяемое в настоящем документе, не подразумевает включение антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, привиты на каркасные последовательности человека.

Моноклональное антитело включает антитело, полученное из популяции, по существу, гомогенных антител, например, отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и при этом направлены на один антигенный участок. Кроме того, в отличие от традиционных (например, поликлональных) препаратов антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные на различные детерминанты (например, эпитопы) на антигене, каждое моноклональное антитело направлено на по меньшей мере единственную детерминанту на антигене. Определение «моноклональный» указывает на характерную особенность антитела как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и не должно интерпретироваться как требующее получения антитела каким-либо особенным способом. Например, моноклональные антитела можно получать гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или можно получать с использованием способов рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела можно также выделять из фаговых библиотек антител, например, с помощью методик, описанных в Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Моноклональные антитела можно также выделять с помощью методик, описанных в патентах США №№ 6 025 155 и 6 077 677, а также в публикациях патентных заявок США №№ 2002/0160970 и 2003/0083293 (см. также, например, Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research 32 (21):0177 (2004)).

Гипервариабельная область включает в себя аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из гипервариабельного участка или CDR (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или аминокислотные остатки из гипервариабельной петли (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2), и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Остатки каркасной области или FR представляют собой остатки вариабельного домена, которые не являются остатками гипервариабельной области. Для антител, описанных в настоящем документе, CDR и каркасные области идентифицируются на основе системы нумерации Kabat, за исключением того, что CDR1 тяжелой цепи определяется на основе Oxford Molecular AbM как охватывающий остатки с 26 по 35. Программное обеспечение для моделирования антител Oxford Molecular AbM (http://people.cryst.cck.ac.uk/~ubc07s/) (Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203, 121-153 (1991); Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126 (1992); и Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172. (1996)) комбинирует системы нумерации гипервариабельных областей CDR Kabat и Chothia для определения CDR.

Выражение «аминокислотная модификация» в настоящем документе включает в себя замену, вставку и/или делецию аминокислоты в полипептидной последовательности. Под «аминокислотной заменой» или «заменой» в настоящем документе подразумевают замещение аминокислоты в определенном положении в исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой. Например, замена R94K означает вариантный полипептид, в данном случае вариант вариабельной каркасной области тяжелой цепи, в котором аргинин в положении 94 замещен на лизин. В предыдущем примере 94K указывает замену в положении 94 на лизин. Для целей настоящего документа множественные замены обычно отделяются друг от друга косой чертой. Например, R94K/L78V означает двойной вариант, включающий в себя замены R94K и L78V. Под «аминокислотной вставкой» или «вставкой», применяемыми в настоящем документе, подразумевают добавление аминокислоты в определенном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, вставка -94 обозначает вставку в положении 94. Под «аминокислотной делецией» или «делецией», применяемыми в настоящем документе, подразумевают удаление аминокислоты в определенном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, R94- обозначает делецию аргинина в положении 94.

Для всех положений константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, обсуждаемых в настоящем изобретении, нумерацию осуществляют согласно EU-индексу, как описано в работе Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, включенной ссылкой в полном объеме). Нумерацию положений константной области тяжелой цепи иммуноглобулина в настоящем документе называют «системой нумерации, изложенной в работе Kabat» или «EU-индексом, как описано в работе Kabat», которые применяют в настоящем документе эквивалентно, и она обозначает нумерацию согласно EU-индексу, как описано в работе Kabat. «EU-индекс, как описано в работе Kabat» означает нумерацию остатков антитела человека IgGl EU, как описано в работе Edelman et al., 1969, PNAS 63:78-85.

Антитела группируют в классы, также называемые изотипами, которые определяют генетически по константной области. Константные легкие цепи человека классифицируют как каппа (CK) и лямбда (C[лямбда]) легкие цепи. Тяжелые цепи классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. Класс IgG наиболее широко применяют для терапевтических целей. У людей этот класс включает подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. У мышей этот класс включает подклассы IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. IgM имеет подклассы, включающие, но без ограничений, IgM1 и IgM2. IgA имеет несколько подклассов, включающих, но без ограничений, IgA1 и IgA2. Таким образом, «изотип», применяемый в настоящем документе, обозначает любой из классов или подклассов иммуноглобулинов, определяемый химическими и антигенными характеристиками своих константных областей. Известными изотипами иммуноглобулинов человека являются IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD и IgE.

Выражение «Fc» или «Fc-область», применяемое в настоящем документе, включает полипептид, содержащий константную область антитела за исключением первого иммуноглобулинового домена константной области. Таким образом, Fc обозначает два последних иммуноглобулиновых домена константной области IgA, IgD и IgG, и последние три иммуноглобулиновые домены константной области IgE и IgM, а также N-конец гибкого шарнирного участка к этим доменам. У IgA и IgM Fc может включать цепь J. У IgG Fc включает иммуноглобулиновые домены Cгамма2 и Cгамма3 (C[гамма]2 и C[гамма]3) и шарнирный участок между Cгамма1 (C[гамма]1) и Cгамма2 (C[гамма]2). Хотя границы Fc-области могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как включающую остатки C226 или P230 на ее карбоксильном конце, где нумерация представляет собой согласно EU-индексу, как описано в работе Kabat. Fc может относиться к данной области в отдельности или к данной области в контексте Fc-полипептида, например антитела.

Под «вариантной константной областью тяжелой цепи IgG1 человека», применяемой в настоящем документе, подразумевают константную область тяжелой цепи IgG1 человека, которая отличается от исходной константной области тяжелой цепи IgG1 человека посредством по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Под «Fc-вариантом» или «вариантной Fc» или «вариантной Fc-областью IgG1 человека», применяемыми в настоящем документе, подразумевают Fc-последовательность, которая отличается от таковой исходной Fc-последовательности посредством по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Вариантная константная область тяжелой цепи IgG1 человека или Fc-вариант включает одну или несколько аминокислотных модификаций относительно исходного Fc-полипептида, где указанная аминокислотная модификация (модификации) обеспечивает (обеспечивают) одно или несколько оптимизированных свойств. Вариантная константная область тяжелой цепи IgG1 человека или Fc-вариант настоящего изобретения отличается по аминокислотной последовательности от своего исходного IgG1 посредством по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Поэтому вариантная константная область тяжелой цепи IgG1 человека или Fc-варианты настоящего изобретения имеют по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно исходной. В качестве альтернативы, вариантная константная область тяжелой цепи IgG1 человека настоящего изобретения может иметь более одной аминокислотной модификации по сравнению с исходной, например, может включать в себя преобразование всего иммуноглобулинового домена константной области или, предпочтительно, Fc-области одного изотипа в другой изотип, например, преобразование Fc-области константной области тяжелой цепи IgG1 человека в Fc-область из IgG3 человека, приводящую к изотипическому варианту, который содержит CH1 из IgG1 человека, шарнирный участок из IgG1 человека и Fc-область из IgG3 человека. Модификации можно осуществлять генетически с помощью молекулярной биологии или можно осуществлять ферментативно или химически.

Fc-варианты настоящего изобретения, по существу, могут кодироваться любым аллотипом или изоаллотипом любого иммуноглобулинового гена. В предпочтительном варианте осуществления Fc-варианты настоящего изобретения находят применение в антителах или Fc-слияниях, которые включают последовательности IgG1, классифицируемые как G1m(1), G1m(2), G1m(3), G1m(17), nG1m(1), nG1m(2) и/или nG1m(17). Поэтому, в контексте изотипа IgG1, Fc-варианты настоящего изобретения могут содержать Lys (G1m(17)) или Arg (G1m(3)) в положении 214, Asp356/Leu358 (G1m(1)) или Glu356/Met358 (nG1m(1)) и/или Glu (G1m(2)) или Ala (nG1m(2)) в положении 431.

Выражение «изотипический вариант», применяемое в настоящем документе, включает аминокислотную модификацию, которая замещает по меньшей мере одну аминокислоту одного изотипа, преимущественно по меньшей мере одну аминокислоту константной области тяжелой цепи одного изотипа, на соответствующую аминокислоту в другом выровненном изотипе. Аминокислотная модификация может включать в себя преобразование всего иммуноглобулинового домена константной области или, предпочтительно, Fc-области одного изотипа в другой изотип, например, преобразование Fc-области константной области тяжелой цепи IgG1 человека в Fc-область IgG3 человека, дающее в результате изотипический вариант, который содержит CH1 из IgG1 человека, шарнирный участок из IgG1 человека и Fc-область из IgG3 человека.

Под «шарнирным участком», или «шарнирной областью», или «шарнирной областью антитела» в настоящем документе подразумевают гибкий полипептид, включающий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно CH1-домен IgG оканчивается в EU-положении 220, и CH2-домен IgG начинается с остатка в EU-положении 237. Таким образом, для IgG шарнирный участок антитела в настоящем документе определяют как включающий положения с 221 (D221 в IgG1) по 231 (A231 в IgG1) с нумерацией согласно EU-индексу, как описано в работе Kabat.

Выражение «эффекторная функция», применяемое в настоящем документе, включает биохимическое событие, которое происходит в результате взаимодействия Fc-области антитела с Fc-рецептором или Fc-лигандом. Выражение «эффекторная функция», применяемое в настоящем документе, включает фагоцитоз, опсонизацию, клеточное связывание, возврат в исходное состояние, комплементзависимую цитотоксичность (CDC), связывание с C1q, связывающую аффинность антитела к Fc[гамма]-рецептору или антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). Предпочтительно эффекторная функция представляет собой комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). Эффекторную функцию измеряют при помощи стандартных анализов in vitro, которые известны в уровне техники и коммерчески доступны. Обычно ADCC измеряют при помощи анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH), как описано в примере 2 настоящей заявки, а CDC измеряют при помощи клеточного анализа, описанного в примере 1 настоящей заявки.

Выражение «изменять эффекторную функцию» или «проявление измененной эффекторной функции», применяемое в настоящем документе, включает проявление усиленной эффекторной функции антитела, например гуманизированного антитела к интегрину α2, содержащего вариантную константную область тяжелой цепи IgG1 человека, по сравнению с исходным антителом, т.е. эффекторная функция антитела, содержащего вариантную константную область тяжелой цепи IgG1 человека, более чем на 10%, предпочтительно более чем на 20%, более предпочтительно более чем на 30%, наиболее предпочтительно более чем на 50%, в частности более чем на 60%, наиболее конкретно более чем на 70% выше эффекторной функции исходного антитела.

Выражение «ADCC» или «антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность», применяемое в настоящем документе, включает клеточно-опосредованную реакцию, где неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc[гамма]Rs, распознают антитела, связавшиеся на клетке-мишени, и, как следствие, вызывают лизис клетки-мишени. В различных аспектах усиленная эффекторная функция ADCC может означать усиленную активность или усиленную эффективность. Под «активностью», применяемой в экспериментальном контексте, подразумевают концентрацию антитела, при которой наблюдается определенный терапевтический эффект, EC50 (половинная максимальная эффективная концентрация). Под «эффективностью», применяемой в экспериментальном контексте, подразумевают максимальную возможную эффекторную функцию при насыщающих уровнях антитела.

Выражение «CDC» или «комплементзависимая цитотоксичность», применяемое в данном документе, включает реакцию, где один или несколько белковых компонентов комплемента распознают антитело, связавшееся на клетке-мишени, и, как следствие, вызывают лизис клетки-мишени.

Применяемое в настоящем документе выражение «субъект» включает любое животное, как человека, так и не относящееся к человеку животное. Выражение «не относящееся к человеку животное» включает всех позвоночных, например млекопитающих и не относящихся к млекопитающим, таких как приматы, кроме человека, овец, собак, кошек, лошадей, коров, кур, земноводных, рептилий и т.д. Предпочтительным субъектом является человек.

Цитотоксическое средство включает вещество, которое ингибирует или препятствует функционированию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Они могут включать радиоактивные изотопы (например, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re), химиотерапевтические средства и токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, или их фрагменты. Нецитотоксическое средство обозначает вещество, которое не ингибирует или не препятствует функционированию клеток, и/или не вызывает разрушение клеток. Нецитотоксическое средство может включать средство, которое может быть активировано, чтобы стать цитотоксическим. Нецитотоксическое средство может включать гранулу, липосому, матрицу или частицу (см., например, публикации патентов США 2003/0028071 и 2003/0032995, которые включены в настоящий документ ссылкой). Такие средства могут быть конъюгированы, связаны, соединены или ассоциированы с антителом к интегрину α2β1, описанном в настоящем документе.

Химиотерапевтическое средство относится к химическому соединению, пригодному при лечении рака. Примеры химиотерапевтических веществ включают, но без ограничений, адриамицин, доксорубицин, 5-фторурацил, цитозина арабинозид («Ara-C»), циклофосфамид, тиотепу, таксотер (доцетаксель), бусульфан, цитоксин, таксол, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин C, митоксантрон, винкристин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, эсперамицины (см. патент США № 4 675 187), мелфалан и другие родственные азотистые иприты.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и от