Вектор парапоксвируса, содержащий антиген вируса бешенства

Вектор парапоксвируса, содержащий антиген вируса бешенства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается рекомбинантных парапоксвирусов, содержащих гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства (RV), и их применения в иммуногенных композициях и вакцинах. Оно также касается способов вакцинации, лечения или профилактики заболеваний, вызванных вирусом бешенства. Оно также касается применения рекомбинантных парапоксвирусов для диагностики.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вирусы семейства Poxviridae представляют собой овальные, довольно крупные вирусы из двухцепочечных ДНК. Род Parapoxvirus (PPV) относится к этим вирусам. Они имеют длину около 220-300 нм и ширину 140-170 нм. Они имеют уникальную спиральную оболочку, отличающую их от других поксвирусов.

PPV разделяются на три разных вида. Однако до сих пор остается невыясненным, являются ли эти вирусы самостоятельными видами в пределах рода парапоксвирусов или же они принадлежат к одному виду. Первый вид, Parapoxvirus ovis, считается прототипом рода. Он также называется вирусом контагиозной эктимы или вирусом контагиозного пустулезного дерматита. Второй, Parapoxvirus bovis 1, также называется вирусом папулезного стоматита крупного рогатого скота. Третий, Parapoxvirus bovis 2, также называется udderpoxvirus, вирусом паравакцины, вирусом ложной коровьей оспы или вирусом узелков доильщиц.

Виды парапоксвируса являются эндемическими для жвачных. PPV были обнаружены у оленя благородного, северного оленя, красной белки и обыкновенного тюленя. Инфицирование PPV может вызывать местные заболевания как у животных, так и у человека. Природно-очаговыми хозяевами видов PPV являются овцы, козы и крупный рогатый скот. Они могут инфицировать человека через прямой контакт с инфицированными животными, реакцию с локализованными эпидермальными поражениями, которые заживают без рубцевания. Для борьбы с заболеваниями могут применяться профилактические меры, такие как вакцинация.

Векторы для экспрессии инородной генетической информации на основе вирусов птичьей оспы, оспы енотовых, оспы овец и коз, оспы свиней или коровьей оспы описывались ранее (см. документы US 5,942,235 и US 7,094,412). Парапоксвирусы представляют собой другие варианты, которые могут применяться в векторных вакцинах. Однако с учетом морфологических, структурных и генетических отличий между отдельными родами поксвирусов способы, применяемые для этих поксвирусов, не могут применяться для парапоксвируса. Примером таких отличий может быть то, что в ORFV отсутствует ген тимидинкиназы (ТК), применяемый для селекции рекомбинантов в различных ортопоксвирусах. Также некоторые поксвирусы способны агглютинировать эритроциты посредством поверхностного белка, гемагглютинина, а парапоксвирусы такой способностью не обладают.

PPV могут иметь иммуномоделирующее действие, поскольку они стимулируют генерализованные (неспецифические) иммунные реакции у позвоночных. Они успешно применяются в ветеринарной медицине для повышения общей устойчивости у животных. Они могут комбинироваться с гомологичным и/или гетерологичным антигеном для обеспечения вакцин, обладающих патоген-специфическим эффектом, который длится от нескольких месяцев до нескольких лет, а также быстрым не специфическим к патогену эффектом.

Parapoxvirus ovis ранее применялся в качестве вектора, как описывается в Патенте США 6,365,393 и публикации Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145. Он обеспечивает значительные преимущества при применении в качестве вектора, включая очень узкий тропизм, отсутствие системной инфекции, краткосрочный специфический к вектору иммунитет (допускающий повторную иммунизацию), раннюю вакцинацию (индукция иммунитета может начаться в присутствии материнских антител) и благоприятные иммуномодулирующие свойства. Настоящее изобретение касается применения парапоксвируса в качестве вектора для гетерологичной ДНК, взятой из вируса бешенства.

Штамм Parapoxvirus ovis D1701 является сильно аттенуированным штаммом, который может распространяться в культуре клеток с титрами, сравнимыми с титрами вируса дикого типа. Он обладает отличными иммуностимулирующими свойствами как в хозяевах, поддерживающих репликацию инфекционного векторного вируса (например, овцах и козах), так и в хозяевах, не поддерживающих такую репликацию (например, собаках, свиньях, лошадях, мышах и крысах). Zylexis^®, ранее известный как Baypamune^®, который представляет собой препарат химически инактивированного Parapoxvirus ovis, производного от штамма D1701, применяют для профилактики, метафилактики и терапевтического лечения инфекционных заболеваний и для предотвращения вызванных стрессом заболеваний животных.

Вирус бешенства (RV), Нейротрофический лиссавирус, относится к семейству Rhabdoviridae. Он представляет собой нейротрофический вирус, вызывающий летальные заболевания у людей и других млекопитающих. Бешенство чаще всего передается через укусы бешеных животных с заражением через слюну животных. Подавляющее большинство случаев бешенства, о которых ежегодно сообщается в Центр по профилактике и контролю заболеваемости США (CDC), отмечается у диких животных, таких как еноты, скунсы, летучие мыши и лисы. Бешенство до сих пор остается очень распространенным заболеванием, в особенности в развивающихся странах. От бешенства ежегодно умирает приблизительно 50000 человек. Наиболее высокий риск инфекции для человека представляют бешеные собаки.

Вирус бешенства представляет собой содержащий одноцепочечную отрицательно-полярную нить РНК вирус, кодирующий 5 белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (Р), матриксный белок (М), гликопротеин (G) и полимераза (L). Зрелый пулевидный вирус со средней длиной приблизительно 180 нм и средней шириной приблизительно 75 нм имеет рибонуклеопротеиновое ядро, белковую оболочку и липидный конверт. Гликопротеиновые выступы, имеющие приблизительно 5-10 нм в длину и приблизительно 3 нм в диаметре, покрывают внешнюю поверхность вируса. Они образуют приблизительно 400 гримерных плотно расположенных отростков.

RV обладает высокой аффинностью к нервной ткани. Причина этого неизвестна. Однако она может состоять в том, что G-белок вируса бешенства может связываться в ацетилхолиновый рецептор (рецептор нейротрансмиттера). После присоединения RV к клетке-хозяину через вирусный G-белок вирус поглощается клеткой путем заглатывания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом касается рекомбинантных парапоксвирусов, в частности Parapoxvirus ovis (PPVO). Рекомбинантный парапоксвирус применяется для опосредования быстрого природного иммунного ответа, а также длительного специфического к инородному гену иммунитета против вируса бешенства. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V.

В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства или его фрагменты. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В еще одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

Настоящее изобретение охватывает способы получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего вставку гетерологичной ДНК в геном парапоксвируса. В одном варианте осуществления способ включает применение Parapoxvirus ovis. В одном варианте осуществления способ включает применение штамма Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления способ включает применение штамма Parapoxvirus ovis D1701-V. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК, применяемая согласно способу, включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК, применяемая согласно способу, включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления способа гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления способ включает получение Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

Настоящее изобретение охватывает иммуногенную композицию, включающую рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способы получения иммуногенной композиции, включающие комбинирование рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение также охватывает вакцину, включающую рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способ получения вакцины, включающий комбинирование рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает Parapoxvirus ovis, в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701, а в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты, а в других вариантах осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701. В других из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

Настоящее изобретение охватывает способ стимулирования у животного иммунного ответа против вируса бешенства, включающий введение вышеупомянутому животному иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способ вакцинации животного от вируса бешенства, включающий введение вышеупомянутому животному терапевтически эффективного количества композиции вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, при изготовлении медикамента для стимулирования иммунного ответа против вирус бешенства у животного. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, при изготовлении медикамента для вакцинации животного против вируса бешенства. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает Parapoxvirus ovis, в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701, а в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты, а в других вариантах осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В других из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG. В некоторых из этих вариантов осуществления стимулируется специфический защитный иммунный ответ против G-белка. В других подобных вариантах осуществления иммунный ответ состоит в вырабатывании сывороточных антител против G-белка. В других подобных вариантах осуществления такое вырабатывание в результате обеспечивает титры антител свыше 0,5 международных единиц на мл.

Настоящее изобретение обеспечивает способ определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного. Описанные авторами парапоксвирусы могут отличаться от штаммов дикого типа как по геномному составу, так и по экспрессируемым белкам. Такое отличие позволяет проводить различия между вакцинированными и инфицированными животными. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, как указывается авторами в анализе дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). В одном варианте осуществления в DIVA-анализе применяют рекомбинантный Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

Эти и другие варианты осуществления описываются и охватываются представленным ниже подробным описанием.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Для лучшего понимания настоящего изобретения представлены прилагаемые фигуры, среди которых:

Фигура 1: Построение плазмиды pdV-RabG. G-ген вируса бешенства вставляют как фрагмент ВатHI-EcoRI в сайт множественного клонирования (обведенные основания) pdV-Recl, в результате чего получают плазмиду pdV-RabG (размером 7,7 т.п.н.). Показываются позиции праймеров ORF32N (SEQ ID NO:1) и ORF31N (SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:3 показывается на Фигуре.

Сокращения: Sm=SmaI, H3=HindIII, EcoV=EcoRV, P=PstI, В=BamHI, К=KpnI, E=EcoRI, S=SalI. F9L и ORF3 указывают на присутствие генов PPVO F9L (ORF 131) и ORF3 (ORF 133). Pvegf указывает на присутствие промотора vegF-E, применяемого для контроля экспрессии вставленного G-гена. (P) и (H3) показывают разрушенные сайты рестрикции PstI и HindIII основной цепи вектора плазмиды pSPT-18, соответственно, показаны промоторы Т7 и SP6 pSPT-18. Фигура показана не в масштабе.

Фигура 2: Нейтрализующий вирус ответ на сывороточное антитело (SNT) после иммунизации различными дозами D1701-V-RabG. Группы мышей C57/BL6 (для каждого дня n=6 или 7) иммунизировали единичной дозой D1701-V-RabG с применением 10⁷ FU (колониеобразующих единиц) (А), 10⁶ PFU (В), 10⁵ PFU (С) и 10⁴ PFU (D). Отдельные образцы сыворотки брали ежедневно в течение 14 дней после иммунизации (с d1 no d14).

Фигура 3: Эксперимент с провокацией иммунизированных мышей. Мышам C57/BL6 вводили единичную дозу D1701-V-RabG, как указано (от 10⁷ до 10⁴ PFU), и внутричерепным путем вводили провоцирующую инфекцию через 2 недели с применением как минимум 3400 LD₅₀ (4,8×10⁵ PFU) RV вирулентного штамма С VS. (А) показывает кривые выживаемости отдельных животных в каждой группе, а (В) показывает те же результаты в процентах выживших особей.

Фигура 4. SEQ ID NO:4 - Последовательность кодирующей области полной длины G-гена вируса бешенства (1575 нуклеотидов) плюс 7 нуклеотидов на 5'-конце и 6 нуклеотидов на 3'-конце в качестве линкерных последовательностей для рестрикционного анализа (BamHI и EcoRI).

Фигура 5. Роль Т-клеток для защитного иммунитета. CD4-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD4 клеткам. CD8-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD8-T-клеткам. CD4/8-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD4/CD8-T-клеткам. Imm С является контрольной группой, вакцинированной D1701-V-RabG, которая не получала антисыворотки. Non-Imm С является контрольной группой, которая не была вакцинирована D1701-V-RabG и не получала антисыворотки. "Дни п. провок." означает количество дней после провокации штаммом бешенства CVS.

Фигура 6. Защита, наблюдаемая при последующей вакцинации. Non-Imm является контрольной группой, которая не была вакцинирована D1701-V-RabG. D1701-V-RabG является группой, которая была вакцинирована D1701-V-RabG. CVS является вирулентным штаммом вируса бешенства. "Дни п. провок." означает количество дней после провокации штаммом RV CVS.

Фигура 7. Защита, наблюдаемая в различных режимах последующей вакцинации. Серые квадраты означают дни, в которые мышей вакцинировали D1701-V-RabG.

Фигура 8. Ответ на сывороточное антитело (определяемый как нейтрализующие антитела сыворотки, SNT) через 6 дней и 13 дней после иммунизации. Мышей иммунизировали D1701-V-RabG интравагинально (i.vag.), путем скарификации, внутрибрюшинно (i.p.), внутрикожно (i.d.), интраназально (i.n.), подкожно (s.c.), внутримышечно (i.m.) или внутривенно (i.v.).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если нет иного определения, научные и технические термины, применяемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области. Кроме того, если контекстом не предусматривается иного, термины в единственном числе в равной мере предполагают множественное число и наоборот.

Представленные ниже определения могут применяться к терминам, употребляемым в описании вариантов осуществления изобретения. Они заменяют любые противоречивые определения, содержащиеся в каждом отдельном источнике, включенном авторами путем ссылки.

"Около" или "приблизительно", применяемый в связи с измеримой числовой переменной, относится к указанному значению переменной и всем значениям переменной, которые пребывают в пределах экспериментальной погрешности указанного значения (например, в пределах 95%-ного доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанного значения в зависимости от большей величины, если "около" не употребляется применительно к интервалам времени в неделях, когда "около 3 недель" означает от 17 до 25 дней, а "от приблизительно 2 до приблизительно 4 недель" означает от 10 до 40 дней.

"Адъювант" в контексте данного описания означает любое вещество, которое служит в качестве неспецифического стимулятора иммунного ответа. Дальнейшее описание адъювантов представлено ниже.

Термин "животное" в контексте данного описания означает любое животное, восприимчивое к инфицированию бешенством, включая млекопитающих, как домашних, так и диких.

"Антитело" в контексте данного описания представляет собой любой полипептид, включающий антиген-связывающий сайт, независимо от источника, способа получения или других характеристик. Оно означает молекулу иммуноглобулина или ее фрагмент, которые специфично связываются с антигеном в результате иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины являются сывороточными белками, состоящими из "легких" и "тяжелых" полипептидных цепей, имеющих "постоянные" и "вариабельные" области, и разделяются на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) в зависимости от состава постоянных областей. Антитело, являющееся "специфическим" к данному антигену, означает, что вариабельные области антитела распознают и связываются исключительно со специфическим антигеном. Антитела могут быть поликлональной смесью или моноклональными. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, взятыми из природных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. "Антитело" может быть преобразовано в антиген-связывающий белок, включающий, помимо прочих, фрагменты антител.

Термин "антиген" или "иммуноген" в контексте данного описания означает молекулу, содержащую один или несколько эпитопов (линейных, конформационных или и тех, и других), которые после воздействия на субъект вызывают иммунный ответ, который является специфическим к антигену. Термин "антиген" может означать ослабленные, инактивированные или модифицированные живые бактерии, вирусы, грибки, паразиты или другие микробы. Термин "антиген" в контексте данного описания также может означать субъединичный антиген, отделенный и обособленный от целого организма, с которым антиген связан в природе. Термин "антиген" также означает антитела, такие как антиидиотипичные антитела или их фрагменты, и синтетические пептиды-мимотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин "антиген" также может означать олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, например, при ДНК-иммунизации.

"Буфер" означает химическую систему, препятствующую изменениям концентрации другого химического вещества, например, системы доноров и акцепторов протонов служат в качестве буферов, препятствующих заметным изменениям концентрации ионов водорода (рН). Другим примером буфера может быть раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (сопряженное основание) или слабого основания и его соли (сопряженная кислота).

Термин "линия клеток" или "клетка-хозяин" в контексте данного описания означает прокариотическую или эукариотическую клетку, в которой может реплицироваться или поддерживаться вирус.

"Клеточный иммунный ответ" или "клеточно-опосредованный иммунный ответ" представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами или другими лейкоцитами, или и теми, и другими, и включает выработку цитокинов, хемокинов и подобных молекул, вырабатываемых активированными Т-клетками, лейкоцитами или и теми, и другими.

"Консервативное замещение" имеет определение в данной области, известно специалистам в данной области и распознается для классификации остатков согласно их соответствующим физическим свойствам.

Термин "культура" в контексте данного описания означает популяцию клеток или микроорганизмов, выращиваемых в отсутствие других видов или типов.

Термин "DIVA" в контексте данного описания означает дифференциацию инфицированных и вакцинированных животных.

"Доза" означает вакцину или иммуногенную композицию, которая вводится субъекту. "Первая доза" или "первичная вакцина" означает дозу такой композиции, которую вводят в начале отсчета времени (День 0). "Вторая доза", или "третья доза", или "годовая доза" означает количество такой композиции, которое вводят после первой дозы, и эта композиция может быть той же вакциной или иммуногенной композицией, что и в первой дозе, или отличной от нее.

"Эпитоп" является специфическим сайтом антигена, который связывается с Т-клеточным рецептором или специфическим антителом и, как правило, включает от приблизительно 3 аминокислотных остатков до приблизительно 20 аминокислотных остатков.

"Формообразующее" означает любой компонент вакцины или иммуногенной композиции, который не является антигеном.

"Фрагмент" означает укороченную часть белка или гена. "Функциональный фрагмент" и "биологически активный фрагмент" означает фрагмент, сохраняющий биологические свойства белка или гена полной длины. "Иммуногенно активный фрагмент" означает фрагмент, вызывающий иммунный ответ.

Термин "G-белок" в контексте данного описания означает часть гликопротеиновых выступов, покрывающих внешнюю поверхность вируса бешенства.

Термин "гетерологичный" в контексте данного описания означает взятый из другого вида или штамма.

Термин "гомологичный" в контексте данного описания означает взятый из того же вида или штамма.

"Гомология" или "процент гомологии" означает процент нуклеотидных или аминокислотных остатков в приемлемой последовательности, которые идентичны остаткам в сравнительных последовательностях после выравнивания последовательностей и вставки пробелов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, а также с учетом любых консервативных замещений в рамках идентичности последовательностей.

"Гуморальный иммунный ответ" означает иммунный ответ, который как минимум частично опосредован антителами.

"Идентичность" или "процент идентичности" означает процент нуклеотидов или аминокислот в приемлемой последовательности, которые идентичны остаткам в сравнительной последовательности после выравнивания обеих последовательностей и вставки пробелов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких бы то ни было консервативных замещений в рамках идентичности последовательностей.

"Иммунный ответ" у субъекта означает выработку гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Иммуногенный ответ может быть достаточным для диагностических целей или других испытаний или может быть достаточным для предотвращения признаков или симптомов болезни, включая ее опасное для здоровья воздействие или осложнения, вызываемые инфекцией болезнетворного агента. Иммунные ответы обычно определяют с применением стандартных иммуноанализов и анализов с подавлением активности, которые известны специалистам в данной области.

"Иммуногенный" или "иммуногенность" в контексте данного описания означает способность вызывать иммунный ответ, специфически направленный против антигена.

Термины "иммуногенная композиция", или "иммунологически эффективное количество", или "количество, эффективное для выработки иммунного ответа", в контексте данного описания означают композицию или антиген, которые могут быть распознаны иммунной системой, в результате чего вырабатывается специфический иммунный ответ (то есть обладающее иммуногенной активностью), при введении животному отдельно или с фармацевтически приемлемым носителем.

"Выделенный" в контексте данного описания означает удаление из природной среды, отдельно или в гетерологичной клетке-хозяине, хромосомы или вектора (например, плазмиды, фага и т.п.). "Выделенные бактерии", "выделенные анаэробные бактерии", "выделенный бактериальный штамм", "выделенный вирус", "выделенный вирусный штамм" и т.п. означают композицию, в которой бактерии или вирус являются по сути свободными от других микроорганизмов, например, в культуре, отдельно от природной среды. Термин "выделенный", применяемый для описания любого конкретно определенного вещества, такого как полинуклеотид или полипептид, касается вещества, отделенного от природной клеточной среды, в которой обычно пребывает вещество, такое как полипептид или нуклеиновая кислота. Таким образом, в контексте данного описания, лишь в качестве примера, в рекомбинантной линии клеток, построенной с применением полинуклеотида согласно изобретению, используется "выделенная" нуклеиновая кислота. В альтернативном варианте, если конкретный белок или специфический иммуногенный фрагмент заявляется или применяется в качестве вакцины или другой композиции, он считается выделенным, поскольку он был распознан, отделен и в определенной мере очищен по сравнению с состоянием, в котором он может существовать в природе. Если белок или его специфический иммуногенный фрагмент производится в рекомбинантной бактерии или эукариотическом векторе экспрессии, который вырабатывает антиген, он считается существующим как выделенный белок или нуклеиновая кислота. Например, в рекомбинантной линии клеток, построенной с применением полинуклеотида, используется "выделенная" нуклеиновая кислота.

"Лекарственное средство" означает любой агент, который может применяться для профилактики, лечения или ослабления болезни, или для профилактики какого-либо физиологического состояния или явления.

Термин "множественность заражения" (MOI) означает пропорцию количества организмов на клетку, которая точно указывает, сколько инокулята должно использоваться при данной инфекции.

Термины "парапоксвирус", "парапоксвирусные штаммы" в контексте данного описания означают вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae и роду Parapoxvirus.

Термины "'Parapoxvirus ovis" и "Parapoxvirus ORFV" в контексте данного описания означают вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae, роду Parapoxvirus и виду Parapoxvirus ovis. Эти вирусы также называются вирусом контагиозной эктимы или вирусом контагиозного пустулезного дерматита. Они имеют уникальную спиральную оболочку, отличающую их от других поксвирусов.

Термин "штамм D1701 Parapoxvirus ovis" означает вирус, описанный в Патенте США 6,365,393, включенном в данное описание путем ссылки. "Штамм D1701 Parapoxvirus ovis-V" означает штамм Parapoxvirus ovis D1701, адаптированный к линии клеток обезьян Vero.

"Парентеральное введение" означает введение вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через путь или маршрут, не затрагивающий пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, чрескожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутриглазное и внутривенное введение.

Термин "патоген" или "патогенный микроорганизм" в контексте данного описания означает микроорганизм, например вирус бешенства, который способен вызывать болезнь, заболевание или аномальное состояние животного-хозяина.

"Фармацевтически приемлемый" означает вещества, которые по результатам тщательной медицинской клинической оценки считаются приемлемыми для применения в контакте с тканями субъектов без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствующими разумному соотношению между выгодой и риском и эффективными при предполагаемом применении.

Термин "поксвирус" в контексте данного описания означает вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae. Эти вирусы представляют собой овальные, довольно крупные вирусы из двухцепочечных ДНК.

Термин "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" в контексте данного описания означает молекулу органического полимера, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепочку. ДНК (дезоксирибоонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) являются примерами полинуклеотидов с четкой биологической функцией.

Термины "предотвращать", "предотвращение" или "профилактика" и т.п. в контексте данного описания означают ингибирование репликации микроорганизма, ингибирование передачи микроорганизма или ингибирование внедрения микроорганизма в организм-хозяин. Эти и другие подобные термины в контексте данного описания также могут означать ингибирование или блокирование одного или нескольких признаков или симптомов инфекции. Лечение считается терапевтическим, если обеспечивается снижение нагрузки со стороны микроорганизма.

"Защита" и подобные термины в контексте данного описания в отношении вакцины или другой композиции означают, что вакцина или композиция предотвращает или уменьшает симптомы болезни, вызываемые организмом, из которого взят антиген, применяемый в вакцине или композиции. Термин "защита" и подобные термины также означают, что вакцина или композиция могут применяться для терапевтического лечения болезни или одного или нескольких симптомов болезни, уже существующей у субъекта.

Термин "вирус бешенства" означает нейротрофический лиссавирус, относящийся к семейству Rhabdoviridae. Он представляет собой вирус, состоящий из одноцепочечной отрицательно-полярной нити РНК, имеющий гликопротеиновые выступы на его внешней поверхности.

"Рекомбинантный PPV" означает PPV, имеющий инсерции и/или делеции в геноме. Инсерции и делеции осуществляют, применяя способы молекулярной биологии.

К "видовым гомологам" относятся гены, присутствующие в двух или более видах, имеющих существенную гомологию полинуклеотидной последовательности, и обладают одинаковыми или подобными биологическими функциями и/или свойствами. Предпочтительно полинуклеотидные последовательности, представляющие видовые гомологи, гибридизируются в умеренно жестких условиях, как описывается авторами на примере, и обладают одинаковыми или подобными биологической активностью и/или свойствами. В другом аспекте полинуклеотиды, представляющие видовые гомологи, имеют более чем приблизительно 60% гомологии последовательности, более чем приблизительно 70% гомологии последовательности, более чем приблизительно 80% гомологии последовательности, более чем приблизительно 90% гомологии последовательности, более чем приблизительно 95% гомологии последовательности, более чем приблизительно 96% гомологии последовательности, более чем приблизительно 97% гомологии последовательности, более чем приблизительно 98% гомологии последовательности или более чем приблизительно 99% гомологии последовательности.

Термины "специфическое связывание", "специфически связывается" и т.п. определяются как две или более молекул, образующих комплекс, измеримый в физиологических или аналитических условиях и являющийся селективным. Антитело или другой ингибитор считается "специфически связывающимся" с белком, если в надлежащим образом выбранных условиях такое связывание существенно не ингибируется, в то время как неспецифическое связывание ингибируется. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и является селективным для соединения или белка. Неспецифическое связывание обычно обладает низкой аффинностью. Например, связывание в IgG антителах в целом характеризуется аффинностью как минимум приблизительно 10^-7 М или выше, например как минимум приблизительно 10^-8 М или выше, или как минимум приблизительно 10^-9 М или выше, или как минимум приблизительно 10^-10 или выше, или как минимум приблизительно 10^-11 М или выше, или как минимум приблизительно 10^-12 М или выше. Термин также применим, например, в случаях, когда антигенсвязывающий домен является специфическим для конкретного эпитопа, который не содержится многими антигенами, и в этом случае антитело, содержащее антигенсвязывающий домен, как правило, не связывается с другими антигенами.

"Специфический иммуногенный фрагмент" в контексте данного описания означает часть последовательности, которая распознается антителом или Т-клеткой, которые являются специфическими для этой последовательности.

"Субъект" означает любое животное, восприимчивое к инфицированию бешенством, включая млекопитающих, таких как домашние, так и дикие.

"По сути идентичный" в контексте данного описания означает степень идентичности последовательностей как минимум приблизительно 90%, как минимум приблизительно 95%, как минимум приблизительно 96%, как минимум приблизительно 97%, как минимум приблизительно 98% или как минимум приблизительно 99%.

"Терапевтически эффективное количество" в контексте данного описания означает количество антигена или вакцины или композиции, которая вызывает иммунный ответ у субъекта (например, собаки), получившего антиген или вакцину или композицию, достаточную для профилактики или ослабления признаков или симптомов болезни, включая ее опасное для здоровья воздействие или осложнения, вызванные инфекцией патогена, такого как вирус, бактерия, паразит или грибок. Может быть вызван гуморальный иммунитет или клеточно-опосредованный иммунитет или как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунитет. Иммуногенный ответ животного на антиген, вакцину или композицию может определяться косвенным образом, через измерение титров антител, анализы пролиферации лимфоцитов или непосредственно путем наблюдения за признаками и симптомами после провокации штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной или композицией, может определяться путем измерения снижения количества провоцирующего организма и/или снижения клинических признаков, таких как смертность, болезненность, температура и общее физическое состояние, состояние здоровья и работоспособность субъекта. Терапевтически эффективное количество вакцины или композиции может быть разным в зависимости от конкретного применяемого иммуногена или состояния субъекта и может определяться специалистом в данной области.

Термины "лечить" или "лечение" и т.п. в контексте данного описания означают уменьшение или устранение инфицирования микроорганизмом. Эти и подобные термины также могут означать снижение репликации микроорганизма, снижение переноса микроорганизма или снижение способности микроорганизма к внедрению в организм-хозяин. Эти и подобные термины в контексте данного описания также могут означать сниже