Способ приготовления геля для лечения ран и ожогов

Способ приготовления геля для лечения ран и ожогов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам получения средства в виде геля для лечения гнойных ран и ожогов, которое может применяться в медицине и ветеринарии.

Известны способы получения гелей для лечения гнойных ран и ожогов с использованием хитозана, полиэтиленгликоля, альгиновой кислоты и ее солей, лекарственных препаратов и биологически активных веществ.

Известен способ получения геля (патент РФ на изобретение №2170590, МПК A61L 15/28). Гель изготавливают на основе альгината натрия, водной суспензии глюканата или лактата кальция, полиэтиленоксида и различных добавок таких как антибиотики, антисептики, анестетики, витамины, вещества, воздействующие на регенерацию клеток.

Известен способ получения геля (патент РФ на изобретение №2194535, МПК A61L 15/28, A61L 5/30). Гель изготавливают из водорастворимого производного целлюлозы, альгиновой кислоты или ее солей, каррагинана или пектина, фукоидана, зоостерина, гуммиарабика, тракаганта. В его состав также входят антибиотики, антисептики, анестетики, витамины, вещества, воздействующие на регенерацию клеток, протеолитические ферменты.

Известен патент РФ на изобретение №2028158, МПК A61L 15/28, в котором гель для лечения гнойных ран и ожогов изготавливают из водного раствора альгината натрия и фермента - террилитина, а также глюконата кальция при следующем соотношении компонентов, мас.%: альгинат натрия 0,2-0,7; террилитин 0,015-0,035; глюконат кальция 0,10-0,40; вода - остальное.

К недостаткам вышеуказанных способов можно отнести то, что они являются достаточно сложными в изготовлении геля, так как предусматривают лиофильную сушку продукта.

Известен патент РФ на изобретение №2432954 МПК A61L 15/28 «Способ получения гидрогеля лечебного назначения (Варианты)», включающий получение водного раствора альгината натрия, сшивающего агента и лекарственного средства, добавление в него отдельно готовят раствор хитозана с концентрацией 4% в 1%-ной уксусной кислоте, выдерживают полученные растворы в течение 10-12 часов, смешивают в соотношении 1:1.

Недостатком способа является достаточно сложное изготовление геля, использование уксуснокислого раствора хитозана оказывающего раздражающее действие на кожные покровы, а также высокие концентрации хитозана, которые приводят к образованию сильно вязких гелей, не способствующих удалению экссудата с раневой (ожеговой) раны. Кроме того, введение коллоидов в хитозановые системы приводит к формированию неоднородной структуры геля и его дальнейшему синерезису (расслоению).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является гель (патент РФ №2288730, МПК A61L 5/44) следующего состава: тинростим, хитозан, аскорбиновая кислота, вода дистиллированная, со следующим соотношением компонентов, г/л: тинростим - 0,05-1,0, хитозан - 30,0-35,0, аскорбиновая кислота - 19,0-21,0, вода дистиллированная остальное.

Недостатком данного способа является то, что полученный гель жидкий и не держит форму при его применении. Кроме того, высокое содержание воды приводит к окислению аскорбиновой кислоты и, как следствие, потере ее свойств.

В прототипе в качестве действующего начала используется биологически активное вещество, получаемое из нервной ткани головоногих моллюсков. Товарное название Тинростим. Тинростим это низкомолекулярный пептид с молекулярной массой до 15 кДа, что способствует снижению проникновению вещества через трансдермальный барьер.

Задачей настоящего изобретения является создание нового эффективного ранозаживляющего средства для наружного применения, обладающего широким спектром действия, с сохранение гелем свойств вязкоупругого пластичного тела.

Она решается в способе получения геля для лечения гнойных ран и ожогов, включающем растворение хитозана в органической кислоте, соединение его с биологически активным веществом и водой, при этом согласно изобретению хитозан в количестве 1,3-2,0 г/л растворяют в 1-3% лимонной или молочной кислоте, в качестве биологически активного вещества используют гидролизат из двустворчатых моллюсков в количестве 0,5-0,7 г/л, причем гидролизат вводят в раствор хитозана перед добавлением в него ПЭГ 600 в количестве 7,0-9,0 г/л и альгилозы кальция в количестве 4,4-5,4 г/л.

Использование растворов органических кислот невысокой концентрации лимонной или молочной обусловлено их низким раздражающим эффектом на покровные ткани. Сочетание свойств компонентов, входящих в состав заявляемого геля, обеспечивает его регенерирующее действие, усиление фагоцитарных процессов в ране, иммунокорригирующий, антимикозный и антибактериальный эффекты, а также полученный гель остается достаточно пластичным в течение длительного времени, что способствует пролонгированному выделению биологически активного вещества - гидролизата из двустворчатых моллюсков - в пораженное место.

Заявляемое ранозаживляющее средство представляет собой устойчивую консистенцию и может храниться при комнатной температуре в течение года без потери своей биологической активности и физико-химических свойств.

Полисахарид - хитозан, получаемый из панциря краба, обладает высокой сорбционной способностью, ранозаживляющим действием, антикоагулянтной, антитромбогенной, бактерицидной активностью. Являясь природным продуктом, он абсолютно безопасен и совместим с тканями организма. Однако средство на основе хитозана неэластично и не впитывает раневой экссудат. Структуру заявляемому средству обеспечивает введение в состав альгината кальция. Сочетанное применение двух биополимеров обеспечивает пористую структуру, способную связывать воду (раневой экссудат). Добавление альгилозы кальция, за счет ее невысокой растворимости в кислых растворах, повышает вязкость раствора разрабатываемого средства.

В качестве биологически активного вещества используют гидролизат из двустворчатых моллюсков, сильнейший биологически активный комплекс, в состав которого входят заменимые и незаменимые аминокислоты, низкомолекулярные белки, олигопептиды, меланоиды, насыщенные, мононенасыщенные, полиненасыщенные жирные кислоты, микроэлементы (К, Na, Ρ, Са, Fe, Si, Mg, Mn, Co, Ba, Ni, Al, Ti, J, Cu).

Одним из перспективных направлений в области фармакологии является изучение различных сторон биологической активности пептидов коллагена, выделенных из морских гидробионтов. Основными структурными белками двустворчатых моллюсков, как источника получения гидролизата, являются коллагены. Коллагеновые белки являются компонентами, обеспечивающими все характерные свойства и функции экстраклеточного матрикса. Они входят в состав стромы и межклеточного вещества всех органов и тканей организма (составляют до 25% массы всех экстраклеточных белков).

Биоактивные пептиды коллагена морских гидробионтов в виде специфических белковых фрагментов имеют положительное влияние на функции организма и могут быть полезны для здоровья человека. Их активность базируется на специфическом аминокислотном составе и последовательности. Размер активных последовательностей может варьировать от трех до двадцати аминокислотных остатков, и многие пептиды проявляют такие многофункциональные свойства, как антигипертензивное, иммуномодулирующее, противотромбическое, антиоксидантное, противоопухолевое и антимикробное действие. Деградация матрикса двустворчатых моллюсков путем использования коллагенолитических или протеолитических ферментов создает биоактивные фрагменты, которые могут стимулировать клеточные реакции, направленные на репарацию и ангиогенез. Указанные фрагменты благоприятствуют быстрому заживлению эндотелия и ускоряют замену микрососудов. Пептиды, использованные в дозах от 10 до 100 нмоль, увеличивают скорость клеточной пролиферации микроваскулярного эндотелия на 47%, а ангиогенез in vitro до 200% по сравнению с контролем. Эти исследования помогают разобраться в молекулярных механизмах заживления ран, регулируемых и индуцируемых пептидами. Главное преимущество регуляторных пептидов перед химическими препаратами состоит в том, что, являясь аналогами эндогенных соединений, они реже вызывают побочные реакции, и в большинстве случаев проявляют выраженный терапевтический эффект, в сравнительно небольших дозах. Благодаря эндогенному происхождению, низкой видоспецифичности, малому размеру и наличию высокоспецифичных рецепторов на клеточных мембранах пептиды коллагена проявляют многофункциональные свойства и являются перспективными веществами для использования в терапии.

Добавление ПЭГ связано с его описанной в литературе способностью усиливать проникновение через трансдермальный барьер биологически активных веществ, вносимых в рецептуру.

Обоснованием к использованию кальциевой соли альгиновой кислоты является присутствие в составе раневого покрытия хитозана. Введение в раствор хитозана солей кальция способствует повышению вязкости растворов, а в случае альгиновой кислоты - ее агрегацию и выпадению в осадок. Известно, что связывание кальция с указанными биополимерами происходит через образование координационных связей. По-видимому, совместное использование двух биологических полимеров, приводит к образованию такой структуры геля, при которой кальций выступает «связующим звеном», придавая структуре геля иные упрого-эластические свойства, не характерные для исходных полимеров.

При использовании гелевых наружных форм допускается ее пастеризация, стерилизация под действием облучения. Срок хранения предлагаемого геля составляет 12 месяцев при температуре 4-10°C.

Заявляемое ранозаживляющее средство обладает пролонгированным свойством, это позволяет снизить дозировку активного начала в заявляемом геле при местном его применении. При этом хитозан адсорбирует некротические продукты, а гидролизат стимулирует фагоцитоз в полиморфноядерных лейкоцитах и моноцитах/макрофагах и оказывает регенерирующее действие на раневую поверхность, результатом чего является быстрое заживление раны.

Альгилоза кальция, как водорастоворимый полисахарид, адсорбирует раневой экссудат, предотвращая раневую поверхность от замокания.

Указанная величина ингредиентов, используемых при получении заявляемого раневого покрытия, определена экспериментально и основана на исследованиях воздействия гидролизата из двустворчатых моллюсков на процесс заживления ран. Количественное изменение их приводило к снижению клинического эффекта или удорожанию курса лечения.

При соотношении гидролизат из двустворчатых моллюсков - хитозановой смеси, ПЭГ, альгилозы кальция и воды в соотношении 1:<(3-3,5) - консистенция геля жидкая (текучая, а при 1:>(3-3,5) - слишком густая. Оптимальное соотношение составляет 1:(3-3,5).

Примеры конкретного выполнения

Для приготовления заявляемой композиции используют коммерческий препарат хитозана с 80%-ной степенью дезацетилирования и молекулярной массой 500 кДа и альгилозу кальция, полученную из ламинарии японской, гидролизат из двустворчатых моллюсков, таких как морской гребешок, спизула, устрица и аналогичных моллюсков.

Пример №1

Для приготовления 1 литра заявляемого геля берут 216 мл 1% раствора лимонной кислоты, которую готовят путем растворения в 1 л воды 10 г кристаллической лимонной кислоты. В 1% раствор кислоты добавляют 1,3 г порошка хитозана, смесь перемешивают в течение 3-4 часов до полного растворения хитозана и образования геля. В гель при постоянном помешивании добавляют 0,5 г гидролизата двустворчатых моллюсков.

Раствор альгилозы кальция готовят следующим образом: к 775 мл дистиллированной воды добавляют 5,4 г альгилозы кальция и перемешивают до полного растворения.

Конечный продукт готовят смешиванием 216 мл раствора хитозана, содержащего 0,5 г гидролизата двустворчатых моллюсков и 775 мл раствора альгилозы кальция. К полученной смеси добавляют 9,0 мл раствора ПЭГ 600.

Перемешивание проводят до образования однородной гелеобразной массы. Готовый гель имеет слабокислую среду (pH 6,0-6,5), такое значение pH вполне приемлемо для наружного лечебного средства.

Срок хранения 12 мес.

Гель полужидкий, но не растекающийся при температуре тела, в течение длительного времени, хорошо заполняющий раны, адгезирующий к влажной ране и образующий при взаимодействии с экссудатом раны и воздухом эластичное покрытие.

Гидролизат из двустворчатых моллюсков был взят в количестве 0,5 г на 1 литр заявляемого геля из следующих соображений - на одну аппликацию необходимо от 2 до 3 мл геля, т.е. 1 литр заявляемого геля содержит от 500 до 333 доз. Значит в одной дозе, заявляемого геля для аппликации будет содержаться от 1,0 до 1,5 мг гидролизата.

Пример №2

Гель готовят аналогично примеру №1, однако, количество исходных компонентов следующее:

состав геля, г/ л:

хитозан - 2,0

гидролизат из двустворчатых моллюсков - 0,7;

молочная кислота - 2,0;

альгилоза кальция - 4,4;

ПЭГ 600 - 7,0.

Готовый гель имеет слабокислую среду (pH 6,5), такое значение pH вполне приемлемо для наружного лечебного средства.

Заявляемый способ изготовления раневого покрытия соответствует критериям:

«новизна» - в заявляемом способе получения раневого покрытия в качестве биологически активного вещества используют гидролизат из двустворчатых моллюсков, который вносят в кислый раствор хитозана прежде, чем добавляют полиэтиленгликоль и водный раствор альгилозы кальция. При смешивании двух растворов полисахарида происходит перераспределение кальция между молекулами хитозана и альгилозы, что приводит к повышению растворимости альгилозы. Кальций за счет образования координационных связей стабилизирует вновь образованную структуру увеличивая ее пористость и упруго-эластические свойства;

«изобретательский уровень» - из определенного заявителем уровня техники не выявлено одновременного применения всех используемых компонентов в заявляемой последовательности;

«промышленная применимость» - данное средство просто в изготовление и может применяться в лечебных учреждениях.

Произведена оценка ранозаживляющей активности геля с гидролизатом из двустворчатых моллюсков на экспериментальной модели ожоговой раны у неинбредных мышей-самцов.

Ожоговую рану формировали у каждой особи по единой методике с применением медного стержня с плоским торцом диаметром 6 мм, который нагревали на кипящей водяной бане и на 10 сек прижимали торцом к выбритому участку кожи животного. Животных рандомизировали на 4 группы по 6 особей в каждой: в качестве контроля использовали группу животных без лечения (1), животных, которых лечили гелем на основе хитозана, альгилозы кальция, ПЭГ (качественный и количественный состав аналогичен заявляемому гелю), однако в него не вносили гидролизат из двустворчатых моллюсков (2), а также животных, которых лечили стандартным препаратом левомеколь (3), опытную группу лечили гелем с гидролизатом из двустворчатых моллюсков (4).

Концентрация гидролизата двустворчатых моллюсков - 0,5-0,7 г/л.

Нанесение гелей и мазей начиналось на 2 день после предварительного измерения размера раны. Для измерения размеров к ране прикладывали покровное стекло и переносили на него контуры раны. Стекла с нанесенными контурами оцифровывали с помощью сканера в графический файл формата «ВМР». Площади ран определяли с помощью программы Adobe Photoshop CS (version 8.0): устанавливают экранную решетку со стороной квадрата 0,25 мм², а затем подсчитывали количество квадратов, охватываемых контуром раны.

Гели и мази наносили на раны ежедневно с помощью металлического шпателя в достаточном для полного покрытия раны, но не в избыточном количестве. При исследовании применяли визуальное наблюдение за состоянием раневого процесса. Измерение площади поверхности раны и оценку состояния ран проводили индивидуально для каждого животного. Рассчитывали показатель процента заживления раны на 3, 7 и 10 сут. В эти же сроки изучали патоморфологические изменения в ожоговой ране.

До начала лечения площадь сформировавшейся раны у мышей различных групп значимо не различалась. Динамика заживления термических ожогов представлена в таблице 1.

Гель как основа раневого покрытия несколько сокращал время заживления ран (2 группа), однако за весь период лечения статистически значимых различий по сравнению с группой контроля (1 группа) не выявлено (р>0,05). При лечении левомеколем ранозаживляющий эффект проявился на 7 сутки (различия с 1 группой статистически значимы, р=0,028).

При лечении термических ожогов гелем, содержащим гидролизат из двустворчатых моллюсков (4 группа), уже на 3 сутки от начала лечения выявлен ранозаживляющий эффект: процент заживления составил 40,0±14,4% по сравнению с 1 группой (р=0,043); со 2 группой (р=0,043) и с 3 группой (р=0,029). В последующие сроки наблюдения выявленный эффект сохранялся: на 7 сутки заживление достигало 73,1±6,1%, значимо отличаясь от всех 3-х контрольных групп и к окончанию лечения (10 сутки) ранозаживляющий эффект геля с гидролизатом составил 84,3±3,01% и значимо отличался от показателей в 1 группе (р=0,021).

Таким образом, наибольший ранозаживляющий эффект выявлен при лечении термических ожогов гелем, содержащим гидролизат из двустворчатых моллюсков.

3. Контроль (левомеколь)	20,7±7,5	57,4±15,3	78,9±6,2
p 3-1=0.641	p 3-1=0,028	p 3-1=0,971
p 3-2=0.967	p 3-2=0,235	p 3-2=0,765
4. Опыт (заявляемый гель)	40,0±14,4	73,1±6,1	84,3±3,01
p 4-1=0,043	p 4-1=0,000	p 4-1=0,021
p 4-2=0,043	p 4-2=0,003	p 4-2=0,411
p 4-3=0,029	p 4-3=0,004	p 4-3=0,114
Примечание: показатели m±σ; n=6; использовали t-критерий для независимых выборок

При визуальном наблюдении за формированием ожога на 1-2 сутки установлено, что поверхность ожога у всех животных была желтоватого цвета и имела плотную структуру.

На 3 сутки у животных 1 группы на поверхности струпа наблюдались точечные кровоизлияния, а затем некротический детрит, на 9-10 сутки наблюдалось образ струпа, а на 12-14 сутки - процесс отторжения струпа и закрытие раневого дефекта.

В опытной 4 группе процесс образования струпа наблюдался на 7-8 сутки, т.е. на 1-2 суток раньше, чем в 1 контрольной группе. На 7 сутки в этой группе отмечались процессы подсушивания струпа и уменьшение диаметра раны за счет отслоения детрита по ее краям. На 10 сутки в 4 группе начинался процесс отторжения струпа и закрытие раневого дефекта. Таким образом, у животных 4 группы отмечалась менее выраженная воспалительная реакция и более быстрое закрытие (эпителизация) раны под струпом.

Динамика патоморфологических изменений в ожоговой ране

При патоморфологическом исследовании ожоговой раны у животных 1 группы (без лечения) на 7 сутки после нанесения ожога в коже обнаружены экссудативные явления в виде значительного отека с образованием многочисленных пузырей различных размеров с отслоением эпидермиса от дермы; микроциркуляторные изменения (полнокровие сосудов, диапедезные кровоизлияния; некроз в эпидермисе с дезорганизацией его слоев, а также в дерме с наличием цитолиза мышечных волокон (миолиз); волосяные луковицы не просматривались (рис.1а). На 10 сутки выявлено уменьшение выраженности отека кожи, эпидермис местами истонченный с участками некробиоза и дефектами слоя шиповатых клеток. В дерме полиморфная клеточная инфильтрация с преобладанием лейкоцитов (рис.2а).

У животных 2 группы на 7 сутки явления отека кожи с образованием пузырей под эпидермисом были менее выражены по сравнению с первой группой. Выявлена распространенная клеточная реакция с участием лейкоцитов и соединительнотканных элементов, среди которых видны многочисленные новообразованные капилляры (рис.1б). На 10 сутки выявлена отчетливая фибробластная реакция, характеризующая репаративные явления (рис.2б).

У животных 3 группы, леченных левомиколем, на 7 сутки эксперимента наблюдался выраженный отек кожи, повреждение эпидермиса, сопоставимые с контролем (1 группа), хотя сосудистая реакция была менее выражена. Отмечалась лейкоцитарная инфильтрация в дерме (рис.1в). На 10 сутки наблюдалась картина, аналогичная таковой во 1 группе (рис.2в).

У животных 4 группы, леченных гелем с гидролизатом из двустворчатых моллюсков, на 7 сутки обнаружены участки некроза в эпидермисе и дерме, умеренный отек кожи, полиморфноклеточная инфильтрация дермы (рис.1г). На 10 сутки имелись обильная клеточная пролиферация преимущественно соединительнотканными элементами, признаки образования молодого эпителиального пласта (рис.2г).

Таким образом, выявленные морфологические изменения свидетельствуют о положительном эффекте геля с гидролизатом из двустворчатых моллюсков при лечении ожоговой раны, который проявляется в уменьшении отека кожи и ускорении развития регенераторных процессов.

Способ приготовления геля для лечения ран и ожогов, включающий растворение хитозана в органической кислоте, соединение его с биологически активным веществом и водой, отличающийся тем, что хитозан в количестве 1,3-2,0 г/л растворяют в 1-3% лимонной или молочной кислоте, в качестве биологически активного вещества используют гидролизат из двустворчатых моллюсков в количестве 0,5-0,7 г/л, причем гидролизат вводят в раствор хитозана перед добавлением в него ПЭГ 600 в количестве 7,0-9,0 г/л и альгилозы кальция в количестве 4,4-5,4 г/л.