Способ затравки лабораторных животных пылью промышленного происхождения для моделирования силикоза

Способ затравки лабораторных животных пылью промышленного происхождения для моделирования силикоза

Реферат

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине. Дает возможность экспериментального изучения патогенеза силикоза, профилактика и лечение которого является одной из важнейших проблем медицины труда, промышленной гигиены и профпатологии.

В биологических и экспериментально-медицинских исследованиях моделирование различных видов воздействий на животных определяется основной целью - возможностью экстраполировать полученные результаты на организм человека. В этой связи, для экспериментальной биологии важным является адекватное приближение изучаемой модели к условиям воздействия ксенобиотика на организм человека.

Хроническое действие промышленной пыли может наблюдаться при различных способах воздействия. На промышленных предприятиях рабочие подвергаются преимущественно не монотонному влиянию вредных веществ, когда концентрация пыли практически постоянна, а интермиттирующему, при котором концентрация пыли в воздухе колеблется в зависимости от характера и режима технологического процесса, используемого оборудования и ряда других факторов. При гигиенических исследованиях воздушной среды рабочих помещений многие авторы отмечали значительные колебания концентраций вредных веществ даже при постоянном технологическом режиме (Казьмина Н.П., 1978; Карпухина Н.А., 1981; Грехова Т.Д., 1983; Мартынова П.А., 1988; Курляндский Б.А., 2002). Действующий в настоящее время ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» содержит следующее определение ПДК: «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны - концентрации, которые при ежедневной (кроме выходных дней) работе в течение 8 ч или при другой продолжительности, но не более 41 ч в неделю, в течение всего рабочего стажа не могут вызвать заболеваний или отклонений в состоянии здоровья, обнаруживаемых современными методами исследований в процессе работы или в отдаленные сроки жизни настоящего и последующего поколений». Согласно указанному определению величины ПДК веществ в большинстве своем являются концентрациями максимальными, превышение которых недопустимо даже для короткого периода времени. Лишь для некоторых соединений утверждены среднесменные концентрации, что связано с трудностью биологического обоснования их установления. Нормы интермиттирующего влияния на организм большинства ксенобиотиков не установлены, хотя именно они имеют более важное значение для профилактики хронических интоксикаций работающих.

Основными показателями, характеризующими поступление пылевых частиц в организм и их задержку в органах дыхания, являются: концентрация в ингалируемом воздухе и время воздействия, размеры частиц, их плотность, растворимость, а также индивидуальная чувствительность организма (Кудинов В.П. Суммарная пылевая нагрузка за год в очистном забое / В.П. Кудинов // Вопросы гигиены труда и профпатологии.- Киев: Здоровье, 1996. - С.30-33; Ибраев С.А. Структурно-функциональное состояние легких и миокарда у экспериментальных животных при хроническом воздействии угольно-породной пыли / С.А. Ибраев, В.И. Медведев, Ш.С. Койгельдинова // Гигиена труда и медицинская экология. - 2006. №3. - С.34-39).

Частота возникающих профессиональных заболеваний обнаруживает отчетливо выраженную зависимость от уровня среднесменных концентраций, в то время как зависимость от максимально разовых концентраций либо намного слабее, либо вообще отсутствует (Ластков Д.О. Фактор внезапных выбросов / Д.О. Ластков // Медицина труда в угольной промышленности; под ред. В.В. Мухина. - Донецк: ДонДМУ, 2000. - С.49-51). Такой подход к оценке пылевого фактора принят в США и ряде других стран и признан достаточно обоснованным рабочей группой ВОЗ, занимавшейся подготовкой рекомендаций по безопасным уровням воздействия минеральных пылей (Предельно допустимые концентрации пыли фиброгенного действия в СССР и за рубежом: Обзорная информ. ВЦНИИОТ ВЦСПС / B.C. Никитин, В.А. Рябец. - М.: Вып. №5. - 1979).

Другие авторы указывают на то, что характер воздействия пылевого фактора при одинаковой пылевой нагрузке на органы дыхания зависит от режима воздействия: либо постоянного, либо интермиттирующего. При интермиттирующем действии и пиковых концентрациях, превышающих средние значения в 5 и более раз, скорость выведения пыли из легких уменьшается, что приводит к более выраженному фиброгенному действию. В связи с этим величина пиков концентрации пыли и продолжительность их действия должны быть ограничены (Ткачев В.В. Оценка риска профессиональных заболеваний пылевой этиологии / В.В.Ткачев // Проф. риск для здоровья работников (руководство) под ред. Измерова Н.Ф. и Денисова Э.И., М. - 2003. - С.188-197).

В России измеряется и нормируется гравиметрическая концентрация всей пыли, ингалируемой из воздуха рабочей зоны. В других странах измеряется и нормируется прежде всего гравиметрическая концентрация респирабельной (гонкой) фракции пыли. Продолжительность измерения нормируемой в России гравиметрической максимально разовой концентрации (МРК) пыли определена отрезком времени ровно 30 мин при развитии пылеобразующей операции. При этом возможен как непрерывный, так и дискретный отбор разовых проб. Для сравнения полученных результатов с ПДК следует рассчитывать среднюю концентрацию из всех разовых проб, взятых в течение 30 минут с учетом времени отбора каждой разовой пробы. В других странах, в основном, нормируется гравиметрическая среднесменная концентрация по принципу «от входа до выхода». В последние годы в некоторых странах вступают в силу и иные регламенты, более близкие к действующим в России.

Изучение воздействия вредных веществ в колеблющихся концентрациях имеет принципиальное значение для определения уровня вариабельности концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны, или допущения этих колебаний в определенных пределах; кроме того, такие исследования являются медико-биологическим обоснованием для установления двух величин ПДК - максимально-разовой и среднесменной. Условия, связанные с длительным разобщением с загрязненной средой и повторным контактом с ней в последующем, в экспериментальной гигиене практически не моделируются.

Известен опыт работы Н.А. Толоконцева по интермиттирующей затравки в сравнении с постоянной парами хлороформа [Толоконцев Н.А. Сравнительное изучение непрерывного и интермиттирующего действия летучих ядов-неэлектролитов // Гигиена и санитария. - 1960. - №3. - С.29-35]. В работе затравка проводилась с использованием высоколетучего и высокотоксичного (2 класс опасности) вещества, находящегося в жидкой форме, при концентрациях, приближенных к ПДК.

Известны также исследования Н.А. Мартыновой по изучению воздействия веществ в монотонном и интермиттирующем режиме. Было изучено воздействие паров 2-бромпентана в монотонном режиме (ежедневные 4-часовые ингаляции при концентрациях, равных 149,3±3,5 мг/м³), и интермиттирующем, состоящим из пяти 15-минутных экспозиций при концентрациях 472,5±7,5 мг/³ и четырех 4-минутных интервалов между ними с подачей в камеру чистого воздуха. Средневзвешенные концентрации при обоих режимах были примерно одинаковы. Результаты исследования показали адекватность выбранных способов затравки гигиеническим условиям промышленного производства этаминала натрия на Усолье-Сибирском химико-фармацевтическом комбинате.

Вышеуказанные работы, посвящены исключительно веществам, находящимся в атмосферном воздухе и в воздухе рабочей зоны в жидком парообразном виде, что является существенным недостатком. Описанные в литературе модели интермиттирующих режимов затравок по условиям экспериментов столь различны по срокам, режимам, уровням, что делает результаты практически несопоставимыми. Более того, имеющиеся сведения касаются, главным образом, высоких уровней воздействия, и не затрагивают методических вопросов создания интермиттирующего режима при концентрациях веществ, не превышающих ПДК.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ моделирования силикоза путем ингаляционного запыления животных углем различных марок (Тогузбаева Карлыгаш Кабдешевна. Медико-биологические особенности развития и профилактики пневмокониоза, вызванного пылью углей различных марок [Текст]: (На примере Караганд. угольного бассейна) Автореферат диссертации … д-ра мед наук: 14.00.7 / Карлыгаш Кабдешевна Тогузбаева; Ин-т питания. - Алматы, 1996. - 34 с.). Способ заключается в затравке лабораторных животных в камере, в которую подается воздушно-пылевая смесь угля определенной концентрации следующих марок: газовый, жирный, коксовый, отощенно-спекающийся, тощий, антрацит. Запыление животных проводится 5 раз в неделю по 4 часа в 2-х режимах:

1. Кратковременного, с концентрацией пыли 1000 мг/м³ в течение 1 месяца с дальнейшим наблюдением до 12 месяцев;

2. Длительного, с концентрацией пыли 300 мг/м³ в течение 12 месяцев. Данный метод имеет ряд недостатков, заключающихся в монотонном режиме, длительных сроках затравки угольно-породной пылью, а также в ее высокой концентрации.

Задача изобретения состоит в том, чтобы разработать способ затравки угольно-породной пылью (УПП) - ведущим фактором в развитии силикоза, который позволит повысить уровень соответствия экспериментальных методов ингаляционного воздействия на организм условиям реального шахтового производства.

Поставленная задача достигается способом затравки лабораторных животных пылью промышленного происхождения для моделирования силикоза, включающим ингаляционное запыление углем лабораторных животных в течение 4 часов в сутки. При этом используют уголь марки газовожирный в концентрации 50 мг/м³ с размером частиц до 5 микрон, запыление проводят в прерывистом режиме, состоящем из чередования шести 20-минутных периодов подачи воздушно-пылевой среды и шести 20-минутных перерывов с подачей чистого воздуха 5 раз в неделю с общей продолжительностью эксперимента от 3 до 12 недель.

Новизна изобретения:

- Используют угль марки газовожирный в концентрации 50 мг/м³ с размером частиц до 5 микрон. Выбор угля марки газовожирный для моделирования силикоза обусловлен тем, что данная марка является основной добываемой на шахтах г. Новокузнецка, обладает высокой биотоксичностью, имеет самый высокий показатель выхода смолистых веществ - 14% и один из наиболее высоких выходов летучих веществ - 38%, по сравнению с другими марками (Фоменко Д.В. Медико-биологическое исследование влияния угольной пыли как фактора интоксикации // Д.В. Фоменко, Е.В. Уланова, К.Г. Громов и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - №1(65). - С.278-283). Размер частиц УПП обусловлен тем, что в витающей пыли в шахтах, обрабатывающих газовые и жирные угли, содержание частиц размером до 5 микрон составляет 80% от общей массы. Частицы такого размера способны проникать в глубокие разветвления бронхиального дерева и, как следствие, по своему воздействию оказываются более токсичными и агрессивными (Норейко С.Б. Пневмокониозы / С.Б. Норейко, Е.В. Чинякина, И.В. Пеленова // Фельдшер и акушерка. - 1990. - №1. - С.19-23). Результаты исследования воздуха рабочей зоны на основных рабочих местах в шахтах г. Новокузнецка показали, что концентрация УПП в воздухе не соответствует ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны», наблюдается превышение ПДК - от 10 до 86 раз, при ПДК=4,0 мг/м³ (Золоева П.В. Гигиенические аспекты профессионального антракосиликоза и особенности его формирования в эксперименте: автореферат дисс. … канд. биол. наук: 14.02.01 - гигиена. - Иркутск, 2009. - 24 с.). Это определило выбор концентрации пыли для проведения экспериментальных исследований, равный ~ 50 мг/м³.

- Проведение запыления производится в прерывистом режиме, состоящем из чередования шести 20-минутных периодов подачи воздушно-пылевой среды и шести 20-минутных перерывов с подачей чистого воздуха 5 раз в неделю с общей продолжительностью эксперимента от 3 до 12 недель. Такое чередование позволяет максимально приблизить условия эксперимента к реальным условиям шахтно-угольного производства, для которого характерна прерывистость процесса и возможность попадания в воздух рабочей зоны УПП в концентрациях, значительно превышающих ПДК. Выбор сроков затравки обусловлен развитием на этих этапах общепатологических изменений, характерных для силикоза.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в возможности способа затравки экспериментальных животных пылью промышленных веществ, соответствующего условиям производства, что подтверждается результатами исследования. Способ позволяет создать модель патологических изменений при различной стадии развития силикоза, адекватной промышленным условиям, что позволяет наиболее полно изучить патофизиологические и морфологические механизмы развития указанной патологии.

Предлагаемый способ выполняется следующим образом: затравка проводится на белых лабораторных крысах-самцах со средней массой тела 180-250 г в камерах объемом ≈ 130 л с динамической подачей аэрозоля, представляющих собой цилиндр, стенки которого снабжены пеналами для крыс. Отверстия пеналов расположены головной частью внутрь цилиндра. В качестве воздуходувок используются стационарно закрепленные компрессоры. Мелкоизмельченное вещество помещается в стеклянный распылитель на ¾ объема. Воздух подается в распылитель со скоростью 0,8-25 л/мин. Отсос воздуха из камеры проводится со скоростью 50 л/мин. Для измерения скорости подаваемого и отсасываемого воздуха используется стеклянный ротаметр и ротаметр с поворотными диафрагмами.

Каждые 30 минут проводится отбор проб воздуха для контроля над концентрацией вещества на фильтры АФА-ВП-10 (ТУ 95-743-80) с помощью аспирационного устройства АЭРА. При отборе пробы воздуха аспирационным методом объем отобранного воздуха приводят к нормальным условиям, т.е. к объему при 0°С и барометрическом давлении 760 мм рт. ст. Для этих целей пользуются формулой:

V₀=V_t×В/(1+at)×760, где

V₀ - искомый объем при нормальных условиях, в литрах,

V_t - объем воздуха, взятый для анализа,

B - атмосферное давление, мм рт. ст.,

a - коэффициент расширения воздуха при нагревании на 1°C (0,003667),

t - температура воздуха в момент взятия пробы.

Концентрации пыли в воздухе затравочных камер определяли гравиметрическим методом. Определяли среднюю концентрацию, полученную при прерывистом отборе проб воздуха не менее чем за 75% времени затравки. Расчет средневзвешенной по времени воздействия концентрации осуществляется по формуле:

Ссв=(Ct₁·t₁+Ct₂·t₂+…+Ct_n·t_n)/(t₁+t₂+t_n), где

Ссв - средневзвешенная концентрация,

Ct₁, Ct₂, C_n - концентрации вещества в воздухе в периоды времени t₁, t₂, t_n.

Поступившая в организм за эксперимент суммарная концентрация вещества при интермиттирующем воздействии должна быть не ниже, чем при постоянном режиме. Необходимым условием затравки является равенство средневзвешенных концентраций.

В интервалы между подачей воздушно-пылевой среды в камеру подается чистый воздух.

Контрольные животные находятся в равной по объему камере, где поддерживается тот же режим температуры и воздухообмена, но без подачи вещества.

Эксперимент проводили на белых беспородных крысах-самцах со средней массой тела массой 180-250 г. В каждом отдельном эксперименте брали одновременно 20 животных одного пола и возраста. Крысы были поделены на 2 группы - опытную и контрольную. Группы формировали методом случайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака. Исследования проводились в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986), и требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ №755 от 12.08.1977 г.).

На опытную группу крыс воздействовали ингаляционно УПП угля марки газовожирный в концентрации 50 мг/м³ с размером частиц до 5 микрон. Запыление проводили в прерывистом режиме, состоящем из чередования шести 20-минутных периодов подачи воздушно-пылевой среды и шести 20-минутных перерывов с подачей чистого воздуха всего в течение 4 часов в сутки 5 раз в неделю с общей продолжительностью эксперимента от 3 до 12 недель.

Средние концентрации УПП в воздухе затравочных камер представлены в таблице 1.

Таблица 1
Концентрации угольно-породной пыли в воздухе затравочных камер
Средняя концентрация за сутки, мг/м3 (M±m)	Динамика изменения концентрации УПП в пробах воздуха затравочных камер (мг/м3)
Подача пыли	Подача чистого воздуха	Подача пыли	Подача чистого воздуха	Подача пыли	Подача чистого воздуха	Подача пыли	Подача чистого воздуха
64,4	50	40	145	70	115	35	40	20
55,6	60	25	55	30	105	35	ПО	25
46,9	95	25	50	35	75	15	50	30
50	75	40	55	30	50	20	90	40
44,3	55	20	60	35	55	35	65	30
53,1	60	45	55	45	90	35	75	20
52,5	50	30	85	35	125	20	50	25

Животные контрольной группы содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. По окончании 1, 3, 6 и 12 недель животные из эксперимента выводились под эфирным наркозом декапитацией с последующим забором кусочков легочной ткани.

Структурные изменения, развивающиеся под воздействием УПП, оценивали по результатам морфологического исследования легочной ткани, что и являлось критерием развития силикоза.

В качестве фиксатора использовали 12% раствор формалина. После фиксации кусочки гистологического материала тщательно промывали, подвергали химической обработке тканей при помощи аппарата для гистологической проводки ЛТ 600 М. Из полученного материала, на санном микротоме делали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилинэозином и пикрофуксином по методу Ван Гизона. Полученные гистологические препараты изучали при помощи микроскопа Levenhuk C800 с цифровой видеокамерой Microscope Digital Camera (USA).

Пример 1. Наблюдали группы животных: контрольную (без подачи УПП) и группу, подвергавшуюся воздействию угольно-породной пыли из угля марки газовожирный с концентрацией 50 мг/м³, с размером частиц до 5 микрон. Ингаляционное запыление углем лабораторных животных проводили в течение 4 часов в сутки, запыление проводили в прерывистом режиме, состоящем из чередования шести 20-минутных периодов подачи воздушно-пылевой среды и шести 20-минутных перерывов с подачей чистого воздуха 5 раз в неделю в течение 1 недели. По окончании затравки животные из эксперимента выводились под эфирным наркозом декапитацией с последующим забором кусочков легочной ткани. У животных контрольной группы не наблюдалось изменений в структуре легочной ткани. В ткани животных после воздействия УПП обнаружено наличие угольного пигмента и макрофагов в просвете альвеол и в межальвеолярных перегородках. В периваскулярных зонах мелких сосудов легких - лимфоплазмоцитарные элементы. Плевра несколько утолщена, на отдельных участках субплеврально расположены единичные скопления угольной пыли.

Пример 2. Наблюдали группы животных: контрольную (без подачи УПП) и группу, подвергавшуюся воздействию угольно-породной пыли с концентрацией 50 мг/м³ с размером частиц до 5 микрон в течение 3 недель. Ингаляционное запыление углем лабораторных животных проводили в течение 4 часов в сутки, запыление проводили в прерывистом режиме, состоящем из чередования шести 20-минутных периодов подачи воздушно-пылевой среды и шести 20-минутных перерывов с подачей чистого воздуха 5 раз в неделю. По окончании затравки животные из эксперимента выводились под эфирным наркозом декапитацией с последующим забором кусочков легочной ткани. В легочной ткани животных, подвергшихся запылению УПП, выявлены очаги дистелектазов и эмфизематозно-расширенных альвеол. В просвете альвеол, а также в межальвеолярных перегородках - скопления макрофагов и частиц угольной пыли с фагоцитозом последних. В сосудах легких отмечается незначительное утолщение стенки за счет слабовыраженной гипертрофии гладкомышечного компонента и незначительного набухания эндотелиоцитов. В периваскулярном и перибронхиальном пространствах - лимфоплазмоцитарные инфильтраты со скоплениями частиц угольной пыли.

Результаты 3-, 6- и 12-недельного эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2
Динамика структурных изменений легочной ткани экспериментальных животных на различных сроках воздействия угольно-породной пыли
Продолжительность воздействия	Морфологические изменения легочной ткани белых лабораторных крыс
1 неделя	Ателектазов и дистелектазов в ткани легких на данном сроке не встречается. В просвете альвеол, а также в межальвеолярных перегородках наличие угольного пигмента и макрофагов. В просвете бронхов и сосудов - угольные частицы. Бронхиальный эпителий респираторного типа, лимфоцитарная инфильтрация стенки бронха слабо выражена, гипертрофия и гиперплазия мышечного слоя бронхов отсутствуют. Стенка сосудов не утолщена, эндотелиоциты несколько увеличены, медиальный слой представлен гладкомышечными клетками без признаков гипертрофии. В периваскулярных зонах мелких сосудов легких - лимфоплазмоцитарные элементы. Плевра несколько утолщена, на отдельных участках субплеврально расположены единичные скопления угольной пыли.
3 недели	В легочной ткани - очаги дистелектазов и эмфизематозно-расширенных альвеол. В просвете альвеол, а также в межальвеолярных перегородках скопления макрофагов и частиц угольной пыли с фагоцитозом последних. В паренхиме наблюдаются очаговые скопления макрофагальных и гистиоцитарных элементов, начальные стадии формирования клеточных гранулем. В просвете бронхов и сосудов - угольные частицы. Бронхиальный эпителий респираторного типа, незначительно уплощен в отдельных полях зрения за счет слабовыраженной лимфоцитарной инфильтрации стенки бронха. Мышечный слой представлен извитыми мышечными волокнами с незначительным утолщением. В сосудах легких отмечается незначительное утолщение стенки за счет слабовыраженной гипертрофии гладкомышечного компонента и незначительного набухания эндотелиоцитов. В периваскулярном и перибронхиальном пространствах - лимфоплазмоцитарные инфильтраты со скоплениями частиц угольной пыли. Плевра немного утолщена, разволокнена с небольшим количеством лимфоидных элементов и угольных частиц.
6 недель	В ткани легких альвеолы различных размеров, встречается умеренное количество зон ателектазов и дистелектазов. В просветах большинства альвеол и межальвеолярных перегородках - макрофаги, скопления угольной пыли в виде крупных и средних конгломератов с признаками формирования клеточных гранулем. Утолщение межальвеолярных перегородок.
	Слизистая бронхов уплощена. Базальная мембрана утолщена, извилиста. В подэпителиальных зонах - лимфоцитарная инфильтрация. Мышечные волокна несколько утолщены, фрагментированы. В перибронхиальных зонах скопления лимфоплазмоцитарных элементов и единичных коллагеновых волокон.
	Стенки сосудов утолщены за счет гипертрофии гладкомышечного компонента и клеток эндотелия.
	В периваскулярных зонах скопления лимфоплазмоцитарных элементов и единичных коллагеновых волокон. Плевра утолщена, инфильтрирована небольшим количеством лимфоидных элементов и частицами угольной пыли.

12 недель	В легочной ткани - уменьшение респираторной поверхности, очаги ателектазов и дистелектазов, межальвеолярные перегородки утолщены за счет пролиферативной активности лимфогистиоцитарных элементов, а также скопления угольных частиц. В просвете альвеол также наблюдаются скопления кониофагов. Формирование мелких и средних гранулем.
Слизистая бронхов субатрофического и атрофического типа, банальная мембрана и собственная пластинка утолщена, местами не прослеживается, мышечные волокна гипертрофированы, фрагментированы, с явлениями фиброза. Кроме того, в перибронхиальных зонах выраженные фибропластические изменения. Толщина фиброза сопоставима с толщиной стенки бронха.
Сосуды резко утолщены за счет гипертрофии гладкомышечного компонента и эндотелиоза, выраженный периваскулярный склероз.
Плевра утолщена, частично разволокнена, субплеврально отмечаются лимфоцитарная инфильтрация и отложения значительного количества частиц угольной пыли.

Полученные в ходе эксперимента данные показали корректность выбранной модели, позволяющей проследить на экспериментальных животных динамику развития силикоза с экстраполяцией ее основных патогенетических звеньев на организм человека.

Разработанный способ затравки соответствует условиям работы на промышленных предприятиях, позволяет прослеживать воздействие промышленной пыли на организм экспериментальных животных и в определенных пределах экстраполировать полученные результаты на организм человека.

Способ затравки лабораторных животных пылью промышленного происхождения для моделирования силикоза, включающий ингаляционное запыление углем лабораторных животных в течение 4 часов в сутки, отличающийся тем, что используют уголь марки газовожирный в концентрации 50 мг/м³ с размером частиц до 5 микрон, запыление проводят в прерывистом режиме, состоящем из чередования шести 20-минутных периодов подачи воздушно-пылевой среды и шести 20-минутных перерывов с подачей чистого воздуха 5 раз в неделю с общей продолжительностью эксперимента от 3 до 12 недель.