Штамм вируса гриппа в/60/массачусетс/2012/10 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса В/Массачусетс/2/2012 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации. Штамм В/60/Массачусетс/2012/10 депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, под №2740, активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°C, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Представленное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 4 табл.

Реферат

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Массачусетс/2012/10.

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, принадлежащего к антигенной линии Ямагата - В/Массачусетс/2/2012, известный вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 антигенной линии Виктория - прототип [Ларионова Н.В., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа В/60/Брисбен/08/83 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2422517 от 27.06.2011, опубл. БИ 2011, №18] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной В/Массачусетс/2/2012-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Массачусетс/2/2012. Вакцина должна быть пригодна для взрослых и для детей, то есть соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Для его подготовки были использованы два родительских штамма вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа линии Ямагата - В/Массачусетс/2/2012 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации (рекомбинации) эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1977. №4. С.387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (ca) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С.66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS), - от безвредного для человека донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Массачусетс/2/2012 с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведении в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°C) и оптимальной (32°C) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts-, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали:

а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) - одному из родительских вирусов, то есть установить специфичность вакцинного штамма [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03].

б) Частичное секвенирование с использованием набора BigDye Terminator v3.1 и секвенатора 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа данных секвенирования использовался программный пакет Lasergene 7.1.

в) Микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С.29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.

Для каждого фрагмента генома эпидемического штамма вируса гриппа В/Массачусетс/2/2012 и донора аттенуации В/СССР/60/69 были подобраны пары праймеров, специфичных соответственно только для донора аттенуации или только для вируса «дикого» типа (табл.1).

Таким образом, «да-нет» результаты, регистрируемые в электрофорезе ПЦР-продуктов, позволяют четко установить принадлежность исследуемого гена и оценить степень чистоты вакцинного препарата.

Амплифицированные фрагменты ДНК визуализировали электрофорезом в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемого реассортантного штамма к эпидемическому вирусу гриппа В В/Массачусетс/2/2012 или донору аттенуации В/СССР/60/69.

Антигенная характеристика вакцинного штамма. Гемагглютинин (НА) полученного авторами вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу В/Массачусетс/2/2012, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Микс-ПЦР методом установлено и подтверждено секвенированием, что вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 унаследовал нейраминидазу (NA) от эпидемического вируса В/Массачусетс/2/2012.

Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10 подтверждена методом микс-ПЦР с помощью специфических праймеров [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С.29-36] и секвенированием, то есть вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации В/СССР/60/69, а гены, кодирующие поверхностные белки (НА, NA), - от эпидемического вируса В/Массачусетс/2/2012. Доказательством получения вакцинного штамма с заданной формулой генома служат результаты микс-ПЦР и секвенирования, приведенные в табл.2.

Секвенирование позволило четко установить принадлежность гена, кодирующего нейраминидазу исследуемого реассортантного вакцинного штамма, к эпидемическому вирусу гриппа B В/Массачусетс/2/2012.

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10 представлены в табл.2.

Таблица 2
Состав генома реассортантного вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10, полученного на основе эпидемического вируса В/Массачусетс/2/2012 и донора аттенуации В/СССР/60/69
Ген Принадлежность гена одному из родительских вирусов
Донор аттенуации Эпидемический вирус Вакцинный штамм
PB2 B601 Масс2 B60
PB1 B60 Масс B60
РА B60 Масс B60
НА B60 Масс Масс
NP B60 Масс B60
NA B60 Масс Масс
M B60 Масс B60
NS B60 Масс B60
1B60 - ген принадлежит донору аттенуации В/СССР/60/69;
2Масс - ген принадлежит эпидемическому вирусу В/Массачусетс/2/2012.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69. Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 38°C составила 3.2 log10 ЭИД50/мл, и холодоадаптированным (ca фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре инкубации составила 7.3 log10 ЭИД50/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69.

Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10 не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл.3).

Таблица 3
Стабильность фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 до и после его пятикратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах
Вирус Титр, log10 ЭИД50/мл Фенотип
32°C 26°C 38°C
В/Массачусетс/2/2012 (эпидемический вирус) 8.9 3.7 <1.7 ts, non-ca
В/СССР/60/69 (донор аттенуации) 8.9 6.4 <1.7 ts, ca
В/60/Массачусетс/2012/10, до пассирования 10.2 7.3 3.2 ts, ca
В/60/Массачусетс/2012/10, 5-й пассаж в РКЭ 9.9 7.0 3.0 ts, ca

Оценку токсичности (безвредность для лабораторных животных) вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10 проводили в соответствии с Руководством по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. (под общей редакцией Р.У. Хабриева). - М., 2005. - 832 с.], с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». - М., - 2010. - 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.2010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html].

Изучение острой токсичности препарата при однократном введении вирусного материала с использованием плацебо контроля (физиологический раствор). Морским свинкам подкожно вводили вирус в объеме 5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 10.2 log10 ЭИД50/мл на животное и оценивали выживаемость лабораторных животных. Контрольным животным вводили эквивалентное количество препарата плацебо - физиологический раствор. Каждая экспериментальная группа состояла из 20 морских свинок.

В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных. При введении препарата осмотр проводился через 2 часа после инъекции. Пальпации подлежали места инъекций (для оценки местного раздражающего действия препарата), а также зрительно выявляемые патологические образования.

В результате исследования показано, что однократное введение вакцинного штамма в объеме, максимально возможном для введения животным данного вида, не вызывало гибели экспериментальных животных, изменения внешнего вида, подвижности, поведенческих реакций, потребления пищи и воды (табл.4).

Изучение подострой токсичности вакцинного штамма при двукратном введении вирусного материала с использованием плацебо контроля (физиологический раствор).

Вакцинный препарат вводили интраназально, ежедневно в течение 2 дней, в объеме 0,4 мл на свинку, по 0,2 мл в каждый носовой ход. Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Каждая экспериментальная группа состояла из 20 морских свинок.

Ежедневно в течение всего исследования проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования также показали, что двукратное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению внешнего вида, поведения морских свинок, не отражалось на потреблении ими пищи и воды (табл.4).

Таблица 4
Результаты изучения безвредности вакцинного штамма В/60/Массачусетс/2012/10
Животные Токсичность Пол Препарат Путь введения Выживаемость
Морские свинки Острая токсичность Самцы Вакцинный штамм Подкожно 10/10
Самки 10/10
Самцы Плацебо 10/10
Самки 10/10
Острая токсичность Самцы Вакцинный штамм Интраназально 10/10
Самки 10/10
Самцы Плацебо 10/10
Самки 10/10

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Массачусетс/2012/10 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Массачусетс/2/2012, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Образец паспорта на вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 по своим биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 депонирован 04.07.2013 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2740 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма В/60/Массачусетс/2012/10 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 72 часов - 10.2 log10 ЭИД50/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:128.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Массачусетс/2012/10 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Массачусетс/2012/10 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Штамм вируса гриппа В/60/Массачусетс/2012/10, депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под №2740, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.