Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза.

Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза.

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Лайм-боррелиоз (LB) представляет собой неконтагиозное инфекционное заболевание, вызываемое спирохетой, называемой Borrelia burgdorferi, и передаваемое человеку при укусе клеща семейства иксодовых клещей. LB при отсутствии лечения вызывает различные патологические нарушения (дерматологического, артритического, сердечного, неврологического и иногда офтальмологического характера). Он представляет собой трансмиссионное инфекционное заболевание, наиболее часто встречающееся в США и в некоторых странах северного полушария с умеренным климатом.

В эту инфекцию вовлечены несколько видов боррелий, в настоящее время обозначаемых как группа burgdorferi или Borrelia burgdorferi sensu lato (включающая Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii и B. afzelii). Эти виды являются патогенными для человека.

В США вовлеченный инфекционный вид представляет собой Borrelia burgdorferi sensu stricto. В Европе к этому виду добавляются B. garinii и B. afzelii. В Азии вовлеченные виды представляют собой B. garinii и B. afzelii.

В США заявляют приблизительно о 10000 случаев. В Европе частота появления составляет менее 5 случаев на 100000.

Лайм-боррелиоз эволюционирует, проходя три различные стадии от ранней стадии инфицирования до поздней. Ранняя стадия (стадия I) может быть бессимптомной или выражаться псевдогриппозной картиной. В 50-80% случаев через несколько дней после укуса клеща на коже отмечается появление воспаленной сыпи очень специфического внешнего вида, называемой мигрирующей эритемой (EM). При отсутствии лечения гематогенная диссеминация боррелий проявляется спустя несколько недель во внезапном возникновении воспалительных артритов, неврологических (нейроборрелиоз) и менингеальных поражений, проявлений на коже и в деятельности сердца (стадия II). Через несколько месяцев или лет болезнь переходит в атрофическую хроническую форму, энцефалопатию, энцефаломиелит и хронический артрит (стадия III).

Для каждого вида Borrelia burgdorferi существует особый органический тропизм. Если первая стадия мигрирующей эритемы неясно связана с тремя видами, то переход в неврологическую форму предпочтительно связан с видом B. garinii, артриты чаще связаны с B. burgdorferi sensu stricto, атрофический хронический акродерматит специфичен для B. afzelii.

Сходство клинических симптомов между лайм-боррелиозом и другими не связанными с ним болезнями, а также вариабельность проявлений затрудняет клиническую диагностику. Если доказательства анамнеза отсутствуют (укус клеща или EM), то диагностика боррелиоза на основании клинических наблюдений может быть особенно затрудненной. Ранняя стадия болезни может быть бессимптомной до момента, когда она достигнет очень далеко зашедших клинических стадий.

Именно поэтому диагностика LB основана как на клинических признаках, так и на обнаружении в сыворотке антител, специфических для патогенных Borrelia burgdorferi, чаще всего способом ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ферментный иммуносорбентный тест)) или EIA, IFA.

В Европе оценка серологического ответа осложнена в силу существования трех патогенных видов и межвидовой вариабельности в отношении главных иммунодоминантных антигенов. Антигены, используемые в настоящее время в стандартной программе обнаружения IgG и IgM LB, представляют собой обработанные ультразвуком клеточные образцы Borrelia burgdorferi sensu lato. Результаты серологических исследований с данными антигенами в высокой степени вариативны в отношении специфичности и чувствительности. Таким образом, по причине недостаточной специфичности, вовлекающей перекрестную реактивность с антителами, связанными с патогенными бактериями, в частности, с Treponema pallidum (этиологический агент сифилиса), спирохетами, риккетсиями, эрлихиями или Helicobacter pylori, диагностика образцов с положительным результатом в испытаниях ELISA должна быть подтверждена иммуноблоттингом. Чувствительность также представляет собой основной фактор. На практике, Borrelia burgdorferi sensu lato экспрессирует различные поверхностные белки вследствие адаптации к различным микросредам, так что генетическое различие и дифференциальная экспрессия генов Borrelia burgdorferi у больных имеют существенное значение для разработки серологических тестов LB.

Таким образом, было необходимо разработать набор, который смягчает указанные ранее недостатки и в большей степени соответствует требуемым критериям специфичности и чувствительности.

Белок VlsE (surface expressed lipoprotein with Extensive antigenic Variation (экспрессируемый поверхностью липопротеин с расширенной антигенной вариативностью)), главным образом, экспрессируется in vivo транзиторным образом и вскоре после инфицирования хозяина. Он является очень иммуногенным у инфицированного хозяина и вызывает продуцирование IgG и IgM. Локус Vls находится в линейной плазмиде длиной 28 т.п.о. (Ip28-1), имеющейся у трех геновидов боррелий, ответственных за лайм-боррелиоз, и состоит из молчащих кассет и экспрессирующего сайта (VlsE). In vivo нерегулярные рекомбинации между экспрессирующими и молчащими кассетами внезапно возникают в ходе инфицирования и лежат в основе антигенной вариабельности VlsE. Белок VlsE состоит из шести вариабельных областей VR1-VR6, расположенных на поверхности белка VlsE и отделенных промежутками от константных областей IR1-IR6.

Известно, что белки VlsE обладают значительной межвидовой и внутривидовой гетерогенностью. В 2004 году Göttner и соавт. [1] описали степень идентичности приблизительно от 47 до 58% на уровне белка VlsE, происходящего от четырех штаммов.

Для смягчения указанных ранее проблем чувствительности и специфичности заявителями получен химерный белок боррелии, включающий по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, соответствующего определенному штамму, и по меньшей мере одну последовательность области IR6 белка VlsE боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, причем указанный химерный белок включает (или в основном состоит из, или также состоит из):

- последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, состоящую из пяти вариабельных областей VR1, VR2, VR3, VR4 и VR5 и шести константных областей IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 и IR6, причем по меньшей мере одна указанная последовательность внеклеточного домена выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5 или вариант одной из указанных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 50% (предпочтительно по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% и преимущественно по меньшей мере 80% или по меньшей мере 85%) относительно последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями;

- по меньшей мере одна последовательность области IR6 боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO: 6, 7 и 8 или вариант одной из указанных последовательностей SEQ ID NO: 6, 7 и 8, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно последовательностей SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, при условии, что вариант этой последовательности способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями.

Описанный ранее химерный белок может включать, кроме того, вариабельную последовательность VR6 вида боррелии, причем эта последовательность идентифицирована в SEQ ID NO: 9 в перечне последовательностей.

Предпочтительный химерный белок включает (или в основном состоит из, или состоит из):

- последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант последовательности SEQ ID NO: 1, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 50% (предпочтительно по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% и преимущественно по меньшей мере 80% или по меньшей мере 85%) относительно SEQ ID NO: 1;

- последовательность SEQ ID NO: 6 или вариант последовательности SEQ ID NO: 6, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно SEQ ID NO: 6;

- последовательность SEQ ID NO: 7 или вариант последовательности SEQ ID NO: 7, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно SEQ ID NO: 7;

- последовательность SEQ ID NO: 8 или вариант последовательности SEQ ID NO: 8, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно SEQ ID NO: 8;

- и при необходимости вариабельную последовательность VR6, идентифицированную в SEQ ID NO: 9.

Таким образом, один из химерных белков по настоящему изобретению включает (или в основном состоит из, или состоит из) последовательность SEQ ID NO: 1, последовательность SEQ ID NO: 6, последовательность SEQ ID NO: 7 и последовательность SEQ ID NO: 8, кроме того, при необходимости последовательность SEQ ID NO: 9.

Предпочтительные химерные белки по настоящему изобретению идентифицируются, в частности, как белки, включающие (или содержащие в основном, или содержащие) последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 23; причем наиболее предпочтительный белок представляет собой белок, включающий или содержащий последовательность, идентифицированную в SEQ ID NO: 20 в перечне последовательностей.

SEQ ID NO: 1 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pBi), укороченного в его сигнальной последовательности (aa 1-19) и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. garinii (штамм pBi).

SEQ ID NO: 2 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pBr), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. garinii (штамм pBr).

SEQ ID NO: 3 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pLi), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. garinii (штамм pLi).

SEQ ID NO: 4 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. afzelii (штамм pKo), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. afzelii (штамм pKo).

SEQ ID NO: 5 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31).

SEQ ID NO: 6 соответствует последовательности домена IR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31).

SEQ ID NO: 7 соответствует последовательности домена IR6 B. afzelii (штамм ACA-1).

SEQ ID NO: 8 соответствует последовательности домена IR6 B. garinii (штамм Ip90).

SEQ ID NO: 9 соответствует последовательности вариабельной области VR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31). Эта последовательность может быть введена в конструкцию в качестве плеча спейсера между доменами IR6.

Последовательность по меньшей мере из 6 гистидиновых остатков (полигистидиновая цепочка, идентифицированная в SEQ ID NO: 10, кодируемая любой из нуклеиновых последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 11, 12 и 13, может быть присоединена на уровне N-концевого или C-концевого участка белка с целью обеспечения его очистки на металлохелатной смоле, а также могут быть присоединены добавочные аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 14 и кодируемые последовательностью SEQ ID NO: 15 в начале полигистидиновой цепочки. В этой конфигурации белок включает или состоит из последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 21. Альтернативным образом, последовательность из 8 гистидиновых остатков, представленная в SEQ ID NO: 16 и кодируемая последовательностью SEQ ID NO: 17, может быть введена в N-концевом участке белка вместо последовательности из 6 гистидиновых остатков, что позволяет стабилизировать адгезию рекомбинантного белка на металлохелатной смоле и улучшить условия очистки, а также могут быть введены добавочные аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 18 и кодируемые последовательностью SEQ ID NO: 19. В этой конфигурации белок включает или состоит из последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 23.

Предпочтительные белки по настоящему изобретению представляют собой белки, идентифицированные как SEQ ID NO: 21 и 23 и соответственно кодируемые последовательностями SEQ ID NO: 22 и 24.

Настоящее изобретение относится также к последовательностям ДНК, кодирующим ранее определенные белки, в частности, к последовательностям, идентифицированным как SEQ ID NO: 22 и 24.

Настоящее изобретение относится также к экспрессирующей кассете, являющейся функциональной в клетке, производной от прокариотического (пример: Escherichia coli) или эукариотического организма, такого, как дрожжи (пример: Pichia, Schizosaccharomyces), и обеспечивающей экспрессию ранее описанной нуклеиновой кислоты (ДНК), когда она находится под контролем элементов, разрешающей ее экспрессию, а также к вектору, включающему такую кассету.

Белок по настоящему изобретению является предпочтительно приемлемым для диагностики инфицирования боррелиями. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro лайм-боррелиоза в биологическом образце (например, в образце сыворотки, крови, плазмы и т.д.), согласно которому биологический образец приводят в контакт по меньшей мере с одним ранее определенным белком и выявляют возможное образование иммунологического комплекса между указанным белком и антителами биологического образца (IgG и/или IgM), например, посредством прибавления по меньшей мере одного антииммуноглобулина человека, меченого любым приемлемым маркером. Под маркером понимают индикатор, способный генерировать сигнал. В неограничительный перечень таких индикаторов входят ферменты, производящие сигнал, детектируемый, например, колориметрией, по флуоресценции или люминесценции, такие, как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; хромофоры, такие, как флуоресцентные, люминесцирующие или окрашивающие соединения; группировки, обладающие электронной плотностью, детектируемой электронной микроскопией или по их электрическим свойствам, таким, как проводимость, способами амперометрии или вольтамперометрии или по измерению сопротивления; группировки, детектируемые оптическими способами, такими, как дифракция, резонанс поверхностного плазмона, изменение краевого угла, или физическими способами, такими как спектроскопия атомных взаимодействий, туннельный эффект, и т.д.; радиоактивные молекулы, содержащие ³²P, ³⁵S или ¹²⁵I. Белок предпочтительно иммобилизуют на твердой подложке, которая может представлять собой конус прибора Vidas^®, лунки планшета для микротитрования, отдельные частицы, гель и т.д.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец, кроме того, приводят в контакт по меньшей мере с одним слитым химерным белком, выбранным из описанных далее белков, таких как:

(a) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 25 и последовательность SEQ ID NO: 26 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 25, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 26;

(b) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 27 и последовательность SEQ ID NO: 28 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 27, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 28;

(c) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, выбранную из таких последовательностей, как:

(i) последовательность SEQ ID NO: 29 и последовательность SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 29, и последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 31;

(ii) последовательность SEQ ID NO: 30 и последовательность SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 30, и последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 31;

(iii) последовательность SEQ ID NO: 29, последовательность SEQ ID NO: 30 и последовательность SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 29, последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 30, и последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 31;

(d) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 32, 34, 36, или последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 33, 35, 37 и 38, описанных более подробно далее.

Каждый из белков, идентифицированных ранее, включает по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка DbpA вида боррелии, выбранного из B. afzelii (SEQ ID NO: 25), B. burgdorferi sensu stricto (SEQ ID NO: 27) и B. garinii (группа III: SEQ ID NO: 29) (группа IV: SEQ ID NO: 30) или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно указанных последовательностей, и по меньшей мере одну последовательность белка OspC B. afzelii (SEQ ID NO: 26), B. burgdorferi sensu stricto (SEQ ID NO: 28) и B. garinii (SEQ ID NO: 31) или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно указанных последовательностей. Предпочтительно одна или несколько последовательностей DbpA находятся на N-концевом участке рекомбинантного белка, а последовательность OspC находится на C-концевом участке рекомбинантного белка.

Соответственно описанному ранее последовательность по меньшей мере из 6 гистидиновых остатков может быть присоединена на уровне N-концевого или C-концевого участка белка с целью обеспечения его очистки на металлохелатной смоле. Последовательность из 6 гистидиновых остатков, идентифицированная в SEQ ID NO: 10, находится предпочтительно на N-концевом участке конструкции. Добавочные аминокислоты могут находиться в начале цепочки поли-His в результате инсерции в последовательность ДНК, кодирующей малую последовательность, которая позволяет облегчать клонирование требуемой последовательности в экспрессирующей плазмиде, например, звено "MRGS" (SEQ ID NO: 14), кодируемое последовательностью ATGAGGGGATCC (SEQ ID NO: 15).

Область связывания может быть введена между каждой из последовательностей DbpA и OspC, образующих химерный рекомбинантный белок. Область такого типа соответствует области гибкого спейсера, обеспечивающей лучшую доступность потенциальных антител к каждому из доменов. Она, в общем случае, содержит много аминокислотных остатков Gly и Ser, представляющих собой аминокислоты, охарактеризованные как аминокислоты, придающие гибкость в третичной структуре белка. Также возможно вводить в требуемую кодирующую последовательность плечо ДНК (или линкер) для облегчения связи между последовательностями, кодирующими два требуемых белка. Например, это может быть звено "GSGG" (SEQ ID NO: 46), кодируемое последовательностью GGTTCCGGGGGT (SEQ ID NO: 47) и действующее в качестве плеча связывания между белками DbpA группы IV и OspC B. garinii.

Примеры таких белков представлены последовательностями SEQ ID NO: 33, 35, 37 и 38 в перечне последовательностей.

Белки, описанные ранее и идентифицированные как SEQ ID NO: 32-38 в перечне последовательностей, соответственно кодируются соответствующими последовательностями ДНК, идентифицированными в SEQ ID NO: 39-45.

Настоящее изобретение относится также к набору для диагностики in vitro лайм-боррелиоза, содержащему по меньшей мере один химерный белок VlsE, описанный ранее, и при необходимости по меньшей мере один слитый химерный белок DbpA/OspC, определенный ранее, и предпочтительно содержащему по меньшей мере один вид антииммуноглобулина человека, меченного любым приемлемым маркером, соответствующим приведенным ранее определениям.

Примеры

Пример 1. Получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные рекомбинантные белки VlsE

Последовательности ДНК, кодирующие различные последовательности белка, идентифицированы в таблице 1.

Таблица 1 Происхождение последовательностей
	Виды B. Burgdorferi *Изолят; **аминокислоты (aa); ***№ позиции в GenBank
Белок	B. sensu stricto	B. afzelii	B. garinii
VlsE	-	-	*PBi; **aa 20-293; ***AJ630106 (GenScript Corp)
IR6	*B31; **aa 274-305; ***U76405 (GeneArt GmbH)	*ACA-1; **aa 172-188; ***U76405 (GeneArt GmbH)	*Ip90; **aa 167-191; ***AAN87834 (GeneArt GmbH)

Последовательности были оптимизированы в отношении их экспрессии в E. Coli с использованием набора GeneOptimizer™ и синтезированы соответственно методике GenScript corporation (Скотч-Плейнс, NJ, США) или GeneArt GmbH (Регенсбург, Германия).

Дополнительные изменения ДНК, делеции или ассоциации различных последовательностей реализовывали способом ПЦР (PCR), применяемым в генной инженерии, с использованием методик ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области техники и описанных, например, в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Последовательности ДНК были связаны в экспрессионный вектор pMR [2] или pET-3d (Novagen^®). Соответствующие плазмидные конструкции и белки, указанные в примере (bLYM110, bLYM125), описаны в таблице 2.

Таблица 2 Соответствующие плазмидные конструкции и белки
Характеристики рекомбинантных белков	Характеристики плазмидных конструкций
Название	N-концевая метка	Последовательность B. burgdorferi	Родительский вектор	Сайт инсерции в векторе последовательности вставки
bLYM110 SEQ ID NO: 21	6 × His	VlsE garinii pBi aa 20-293 + 3 IR6 [sensu stricto B21 aa 274-305 + afzelii ACA-1 aa 172-188 + garinii Ip90 aa 167-191]	pMR78	5'BamHI/3'HindIII
bLYM125 SEQ ID NO: 23	8 × His	pET-3d	5'NcoI/3'BamHI

Пример 2. Экспрессия рекомбинантных белков примера 1 и очистка

Для трансформации бактерии E. coli (штамм BL21) согласно традиционной методике, известной специалистам в данной области техники, использовали плазмидную конструкцию, описанную в примере 1. Трансформированные бактерии селекционировали по их резистентности к ампициллину, приданной вектором pMR или pET.

Затем осуществляли селекцию клона рекомбинантной бактерии для посева прекультуры в 40 мл среды 2xYT (триптон, 16 г/л; экстракт дрожжей, 10 г/л; NaCl, 5 г/л, pH=7,0), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 15-18 часов при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин данную прекультуру использовали для осуществления посева в 1 л среды 2xYT, содержавшей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру инкубировали при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности DO при 600 нм значения 1,0/1,2. Культуру выдерживали в течение 3 часов 30 мин или 4 часов при 30°C после прибавления 0,4 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и собирали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Осадок клеток хранили при -60°C. Для очистки влажную биомассу ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, содержавшем ингибиторы протеаз без ЭДТА (Roche) и бензоназонуклеазу (Novagen^®), и осуществляли разрушение клеток при 1,6 кбар в деструкторе клеток (Constant System Ltd, Давентри, Великобритания). Затем лизат центрофугировали при 10000 об/мин в течение 45 минут при 2-8°C. После фильтрования через фильтр пористостью 0,22 мкм надосадочную жидкость вводили в колонку Ni-NTA (Quiagen^®), кондиционированную лизирующим буферным раствором. Затем смолу промывали тем же самым буферным раствором до достижения A_{280 нм} значения базовой линии. Элюирование осуществляли элюирующим буферным раствором, а очищенный белок подвергали диализу на кассете Pierce для диализа Slide-A-Lyser^® с отсечкой 10000 или 20000 а.е.м. против диализного буферного раствора. Условия очистки на геле Ni-NTA описаны в таблице 3.

Таблица 3 Очистка рекомбинантных белков
Белок	bLYM110SEQ ID NO: 21	bLYM125SEQ ID NO: 23
Буферный раствор для лизиса и промывки	Буферный раствор A1	Буферный раствор A1 + мочевина, 2 M
Элюирующий буферный раствор	Буферный раствор B2	Буферный раствор B2, модифицированный 600 мМ имидазола
Элюирование, стадия 1	86% буферного раствора A + 14% буферного раствора B (4CV)	92% буферного раствора A + 8% буферного раствора B (4CV)
Элюирование, стадия 2	100% буферного раствора B	100% буферного раствора B
Выход очистки, мг белка/г влажной биомассы	0,5	0,8
Выход очистки, мг белка/л культуры	8,7	17
1 Фосфат натрия, 50 мкМ, имидазол, 30 мкМ, NaCl, 500 мМ, Tween 20, 0,1%, глицерин, 5%, pH=7,8
2 Фосфат натрия, 50 мкМ, имидазол, 325 мМ, NaCl, 500 мМ, глицерин, 5%, pH=7,5

Образцы анализировали на геле NuPAGE^® Novex^®, 4-12%, в циркуляционном буферном растворе NuPAGE^® MES-SDS согласно руководства изготовителя (Invitrogen™). Белки окрашивали бриллиантовым синим Кумасси или электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5%-м (масс./об.) раствором сухого молока в PBS и инкубировали с анти-пентагистидиновым антителом (Qiagen^®) в PBS, содержавшим 0,05% Tween 20. Конъюгат антимышиного IgG козы, меченный пероксидазой хрена, (Jackson Immunoresearch laboratories) в PBS/Tween использовали в качестве вторичного антитела.

Определение концентрации белков осуществляли, используя набор Bradford Assay Kit (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) с BSA в качестве стандартного белка.

Пример 3. Обнаружение IgG и IgM человека с химерным рекомбинантным белком bLYM110 примера 2 способом линейного иммуноблоттинга

Рекомбинантный белок наносили на поливинилидендифторидную мембрану (PVDF, Immobilon, Millipore^®, Бедфорд, Массачусетс, США) по приведенной далее методике.

Концентрацию белка в PBS с pH=7,2 устанавливали равной 1 мг/мл и разбавляли PBS с pH=7,2, дополненным 0,03% Tween 20 (разведение 1/200). Мембрану из PVDF смачивали метанолом, промывали в деминерализованной воде и накладывали на бумагу с влажным пятном. Пластмассовую линейку погружали в разбавленный раствор белков и фиксировали на мембране из PVDF. После нанесения белков и высушивания мембрану разрезали в вертикальном направлении на полоски. Перед применением полоски инкубировали с 5%-м раствором желатина в TBS с pH=7,5 в течение 1 часа при 37°C. Процедуры иммуноблоттинга осуществляли при комнатной температуре соответственно описанному Bretz A.G. и соавт. [3]. Полоски инкубировали в течение 2 часов с пробами сыворотки человека, разбавленными в соотношении 1/200 в TBS с 1% желатина, промывали и инкубировали с отличающимися от человеческого IgG или IgM, меченными щелочной фосфатазой (Sigma™, Сент-Луис, США) и разбавленными в соотношении 1/1000 в TBS с 1% желатина. После промывки полоски инкубировали с субстратом BCIP-NBT (KPL, Гейтерсбург, MD, США) в течение 30 минут, промывали в дистиллированной воде и сушили.

Группа проб испытуемых сывороток

Пробы сыворотки человека отбирали у типичных, клинически хорошо охарактеризованных больных LB, соответствующих различным стадиям LB (22 с мигрирующей эритемой [EM], 5 с кардитом, 20 с нейроборрелиозом [NB], 20 с артритом Лайма [LA], 20 с атрофическим хроническим акродерматитом [ACA] и 10 с доброкачественной лимфоцитомой кожи [LCB]). Антиборрелиозные IgG были найдены описанным ранее иммуноблоттингом при использовании лизатов целых клеток [4] в сыворотке больных LA, ACA и кардитом. EM, NB и LCB были идентифицированы клинически, но все соответствующие пробы сыворотки не были определены как положительные ни посредством иммуноблоттинга [4], ни посредством коммерческих наборов (VIDAS^® Lyme (biomérieux^®), Borrelia IgG (Diasorin^®) и Borrelia IgM (r-biopharm^®)). Напротив, во всех случаях NB, включенных в исследование, имелись антитела, обнаруживаемые в спинномозговой жидкости [LCR] (индекс находился в интервале от 2 до 27,1).

Группа отрицательного контроля включала 31 пробу сыворотки, при этом пробы ранее были определены в традиционных испытаниях как отрицательные в отношении присутствия антиборрелиозных антител. Кроме того, с рекомбинантным белком были испытаны 64 пробы сыворотки здоровых доноров крови, проживающих в регионе, эндемичном в отношении болезни Лайма (Монтей, Вале, Швейцария). Интенсивность реакции оценивали следующим образом: [+], [++], [+++], [-] или неоднозначные результаты. Неоднозначные результаты принимали за отрицательные.

Результаты представлены в приведенной далее таблице 4.

Таблица 4
IgG
Стадия I	Стадия II	Стадия III	Доноры
EM (n=22)	NB (n=20)	Кардит (n=5)	LA (n=19)	ACA (n=20)	Лимфоцитома (n=10)	(n=64)
17	20	5	19	20	9	6
77,3%	100%	100%	100%	100%	90%	9,4%
12[+++]	11[+++]	4[+++]	13[+++]	20[+++]	3[+++]	6[+]
4[++]	7[++]	1[++]	4[++]		2[++]
1[+]	2[+]		2[+]		4[+]
Итого положительных реакций на IgG: 93,7%
IgM
EM (n=22)	NB (n=20)	Кардит (n=5)		(n=64)
5	4	2		1
22%	20%	40%		1,5%

1[++]	2[++]	1[++]		1[+]
4[+]	1[+]	1[+]
Итого положительных реакций на IgM: 23,4%

Обнаружение IgG

Результаты показывают, что рекомбинантный белок bLYM110 представляет собой диагностический антиген, высоко чувствительный в отношении IgG на всех стадиях инфицирования. На стадии I инфицирования IgG были обнаружены в 17 случаях больных с EM из 22 (или 77,3% чувствительности). У пяти больных с EM, для которых найдены отрицательные результаты с рекомбинантным белком, такие же результаты определены штатным иммуноблоттингом и с коммерческими наборами. Семь проб сыворотки с EM, найденные положительными с рекомбинантным белком, не были обнаружены иммуноблоттингом, что представляет собой улучшение чувствительности с рекомбинантным белком на 31,8%. На первой стадии инфицирования в отсутствие характерного покраснения диагностика может быть затруднена, так как другие клинические проявления болезни Лайма не являются специфическими. Кроме того, традиционными испытаниями были обнаружены только несколько больных, имевших EM. Таким образом, белок по настоящему изобретению улучшил обнаружение IgG на стадии I инфицирования, обеспечив обнаружение их более чем у 77% больных, имевших EM.

Обнаружение IgM

Химерные антибелки IgM найдены в 23,4% проб сыворотки с LB. В сыворотке больных LB стадий I и II белок позволяет обнаруживать IgG чаще, чем IgM.

Пример 4. Получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные рекомбинантные белки DpbA-OspC

Последовательности ДНК, кодирующие различные описанные последовательности DpbA и OspC, идентифицированы в таблице 5. Последовательности ДНК были оптимизированы в отношении облегчения экспрессии в E. Coli с использованием набора GeneOptimizer™ и синтезированы соответственно методике GenScript corporation (Скотч-Плейнс, NJ, США) или GeneArt GmbH (Регенсбург, Германия).

Таблица 5 Происхождение последовательностей
	Виды B. Burgdorferi *Изолят; **аминокислоты (aa); ***№ позиции в GenBank
Белок	B. sensu stricto	B. afzelii	B. garinii
DbpA	*B31; **aa 2-192; ***AF069269	*PKo; **aa 2-150; ***AJ131967	*40; **aa 2-187; ***AF441832; *PBi; **aa 2-176; ***AJ841673
OspC	*B31; **aa 26-210; ***X73622	*PKo; **aa 2-212; ***X62162	*PEi ; **aa 32-208; ***AJ749866

Каждый химерный рекомбинантный белок содержит по меньшей мере одну эпитопную область, соответствующую внеклеточному домену последовательности DbpA Borrelia burgdorferi sensu stricto или B. afzelii или B. garinii, и по меньшей мере одну эпитопную область, соответствующую внеклеточному домену последовательности OspC Borrelia burgdorferi sensu stricto или B. afzelii или B. garinii.

Ассоциации различных нуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательности DbpA и/или OspC, а также изменения нуклеотидных последовательностей, такие, как делеции, добавление последовательности связывания или добавление последовательности-линкера, осуществляли путем генной инженерии с использованием методик ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области техники и описанных, например, в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Последовательности ДНК, кодирующие требуемые химерные белки, были введены в экспрессионный вектор pMR [2] между сайтом рестрикции BamHI в положении 5' и сайтом EcoRI или HindIII в положении 3'. Соответствующие плазмидные конструкции и белки, указанные в примере (bLYM114, bLYM120 и bLYM121), описаны в таблице 6. MRGS в N-концевом участке рекомбинантных белков и соответствующая нуклеотидная последовательность ATG AGG GGA TCC были введены по методике клонирования, использованной для экспрессионного вектора pMR. В данной последовательности действительно необходим только кодон инициации ATG и, следовательно, аминокислота Met.

Последовательность поли-His (6 гистидиновых остатков) была введена на N-концевом участке каждого рекомбинантного белка. Данная последовательность обеспечивает очистку рекомбинантных белков на колонке для металлохелатной аффинной хроматографии. Она представляет собой область фиксации на геле Ni-NTA, которая в дальнейшем позволяет облегчать стадию очистки химерного рекомбинантного белка. Данный пептид HHHHHH (SEQ ID NO: 10) кодируется нуклеотидными последовательностями CATCATCATCATCATCAT (SEQ ID NO: 11) или CATCATCATCATCATCAC (SEQ ID NO: 12), или CATCATCACCACCATCAT (SEQ ID NO: 13), или любой другой последовательностью, кодирующей последовательность SEQ ID NO: 10.

Следует указать, что данная область особой фиксации, включающая гистидиновую последовательность, обеспечивает, в частности, ориентированную фиксацию рекомбинантного белка на подложке, образованной диоксидом кремния или оксидами металлов.

Таблица 6 Соответствующие плазмидные конструкции и белки
Характеристики рекомбинантных белков	Характеристики плазмидных конструкций
Название	N-концевая метка	Последовательность B. burgdorferi	Название	Родительский вектор	Сайт инсерции в векторе последовательности вставки
bLYM114 SEQ ID NO: 33	6 × His	B. afzelii штамм PKoDbpA aa 2-150 + OspC aa 2-212	pOL114	pMR78*	5'BamHI/3'EcoRI
bLYM120 SEQ ID NO: 35	6 × His	B. sensu stricto штамм B31DbpA aa 28-192 + OspC aa 26-210	pOL120	pMR78*	5'BamHI/3'HindIII
bLYM121 SEQ ID NO: 38	6 × His	B. garinii DbpA III aa 25-187 штамм 40 + DbpA IV aa 24-176 штамм PBi + OspC aa 32-208 штамм PEi	pOL121	pMR78*	5'BamHI/3'HindIII
● [2]

Пример 5. Экспрессия рекомбинантных белков bLYM114, bLYM120 и bLYM121 примера 4 и очистка

Для трансформации бактерии E. coli (штамм BL21) согласно традиционной методике, известной специалистам в данной области техники, была использована плазмидная конструкция, в которой в экспрессионный вектор (pMR) была вставлена последовательность SEQ ID NO: 40, 42 или 45. Трансформированные бактерии селекционировали по их резистентности к ампициллину, приданной вектором pMR.

Затем осуществляли селекцию клона рекомбинантной бактерии для посева прекультуры в 40 мл среды 2xYT (триптон, 16 г/л; экстракт дрожжей, 10 г/л; NaCl, 5 г/л, pH=7,0), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 15-18 часов при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин данную прекультуру использовали для осуществления посева в 1 л среды 2xYT, содержавшей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру инкубировали при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности DO при 600 нм значения 1,0/1,2. Культуру выдерживали в течение 3 часов 30 мин или 4 часов при 30°C после прибавл