Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания и конденсированный раствор

Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания и конденсированный раствор

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к раствору для предварительной обработки и его концентрату для иммуногистохимического окрашивания, причем раствор обеспечивает возможность проведения иммуногистохимического окрашивания за короткий промежуток времени и с меньшими затратами труда, причем иммуногистохимическое окрашивание включает: элюирование содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани в качестве антигена, залитого в среду; извлечение антигена; промывание; взаимодействие с антителом; и окрашивание. В частности, настоящее изобретение относится к раствору для предварительной обработки и его концентрату для иммуногистохимического окрашивания, причем раствор функционирует как для элюирования с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, содержащей парафин заливочной среды для иммуногистохимического окрашивания, так и для извлечения антигенности, что обеспечивает возможность достаточной интенсивности окрашивания при последующем иммуногистохимическом окрашивании, и что поддерживает элюированную заливочную среду, диспергированную в ней, даже после ее первого использования, и может использоваться три или более раз.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

При патоморфологическом исследовании предварительная обработка для депарафинизации и извлечения антигена для иммуногистохимического окрашивания предметного стекла с образцом ткани, обычно включает, как описано в непатентной публикации 1: первую стадию депарафинизации путем пропускания фиксированного формалином, залитого в парафин среза ткани через слой органического растворителя, такого как ксилол, бензол или толуол, 3 раза в течение 3 минут каждый; вторую стадию регидратации покровного стекла и образца ткани путем их пропускания через амфифильный раствор, такой как этанол, 4 раза по 3 минуты каждый; и третью стадию извлечения антигена из регидратированного образца ткани термической обработкой регидратированного образца ткани, погруженного в раствор для извлечения антигена, такой как цитратный буфер или раствор Трис-ЭДТА.

Органические растворители, используемые на первой стадии предварительной обработки, такие как ксилол, бензол или толуол, являются высокотоксичными и летучими, что требует использования оборудования для вытяжной вентиляции, такого как вытяжной шкаф, и оказывает неблагоприятное воздействие на окружающую среду, в которой работает задействованный технический персонал.

В качестве замены неблагоприятных органических растворителей, в продаже имеются высокобезопасные агенты для депарафинизации, такие как Hemo-De (торговое название, производимый компанией FALMA), органический растворитель, экстрагированный и очищенный из цитрусовых корок, Clear-Plus и Hemo-Clear (оба торговые названия, производятся компанией FALMA) с использованием алифатических углеводородов (алканов) и Tissue Clear (торговое название, производится компанией SACURA FINETEK JAPAN CO., LTD).

Вместо использования высокобезопасных депарафинизирующих агентов, желательны более удобные способы, где три стадии предварительной обработки выполняются одновременно в одном растворе, и для этого были сделаны некоторые предложения.

Например, в патентном документе 1, предложен способ предварительной обработки, где депарафинизация и извлечение антигена выполняются одновременно нагреванием до температуры, превышающей точку плавления парафина, залитого в парафин образца ткани в растворе, содержащем растворяющий парафин органический растворитель, выбранный из ароматического углеводорода, терпена или изопарафинового углеводорода, полярного органического растворителя, извлекающего антиген компонента и поверхностно-активного вещества. В патентной публикации 1 также указано, что для удаления остаточного поверхностно-активного вещества на стадии промывания, следующей за способом предварительной обработки, в промывающем растворе может содержаться циклодекстрин, который связывается с поверхностно-активным веществом.

С другой стороны, в патентной публикации 1 в примере 7 указано, что когда указанный выше раствор, используемый при предварительной обработке, используется последовательно, то остаточный парафин, элюированный в растворе после предварительной обработки, сцепляется со следующим предметным стеклом, так что этот раствор не подходит для последующего использования.

Кроме того, когда раствор композиции, описанной в патентной публикации 1, приготовлен для получения щелочного рН, при иммуногистохимическом окрашивании после предварительной обработки, предметное стекло со сцепленным с ним образцом ткани имеет склонность к отталкиванию окрашивающего реагента в частях, свободных от образца ткани, что приводит к неравномерному окрашиванию.

В патентных публикациях 2 и 3 указано, что депарафинизация и извлечение антигена могут осуществляться одновременно с использованием раствора, содержащего различные буферы, поверхностно-активные вещества, этиленгликоль и тому подобные, также как в способе предварительной обработки, описанном в патентной публикации 1.

Однако в этих публикациях последовательное использование раствора для предварительной обработки также не предусмотрено, аналогично раствору патентной публикации 1, и в ней нет описания такой технологии, которая используется для диспергирования элюированного парафина в растворе или тому подобной. Таким образом, вероятно, что растворы для предварительной обработки, описанные в этих публикациях, при последовательном применении также имеют такие же проблемы, как те, которые указаны в патентной публикации 1.

Между прочим, некоторые растворы для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, которые одновременно осуществляют депарафинизацию и извлечение антигенов, уже имеются в продаже, такие как растворы, раскрытые в указанных выше патентных публикациях, включая раствор Trilogy для однократного применения (торговое название, производится компанией Cell Marque Corporation), или раствор Target Retrieval Solution pH9 (3-в-1) (торговое название, производится компанией DAKO) для последовательного трехразового применении в пределах одной недели.

Композиции этих имеющихся в продаже продуктов неизвестны, но они не содержат циклодекстрин. Кроме того, во всех таких продуктах, гидрофобный парафин, элюированный в раствор для предварительной обработки во время применения, часто плавает на поверхности раствора.

Такой нерастворимый парафин на поверхности раствора сцепляется с предметным стеклом с образцом ткани, когда оно извлекается из раствора, так что требуется больше стадий промывания перед последующим окрашиванием, что осложняет операцию. В противном случае, нерастворимый парафин оказывает неблагоприятные воздействия на последующее иммуногистохимическое окрашивание. Кроме того, когда окрашивание выполняется в автоматическом устройстве для иммуногистохимического окрашивания, нерастворимый парафин может оказывать неблагоприятное воздействие на устройство для окрашивания.

Публикации уровня техники

Патентные публикации

Патентная публикация 1: JP-2001-505297-А.

Патентная публикация 2: JP-2003-526086-А.

Патентная публикация 3: патент США № 6649368-B1.

Непатентные публикации

Непатентный документ 1: “Koso Koutai Hou” (Imminoenzymatic technique), Revised 4^th Edition, Watanabe and Nakane, Kakusai Kikaku (2002).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблемы, подлежащие решению изобретением

Целью настоящего изобретения является получение раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который функционирует при иммуногистохимическом окрашивании как для элюирования содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани в форме среза ткани, сцепленного с предметным стеклом, и залитым в среду, так и для извлечения антигенов из образца ткани, который обеспечивает возможность достаточной интенсивности окрашивания при последующем иммуногистохимическом окрашивании, который поддерживает элюированную заливочную среду диспергированной в нем после его первого применения, который может использоваться три или более раз последовательно и который характеризуется высокой безопасностью.

Другой целью настоящего изобретения является получение раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который разрешает указанные выше проблемы и который, после окрашивания вслед за обработкой раствором содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани в форме среза ткани, сцепленным с предметным стеклом и залитым в среду, и извлечения антигенов из образца ткани, ингибирует отталкивание окрашивающего реагента на части предметного стекла без образца ткани для предотвращения посредством этого неравномерного окрашивания.

Другой целью настоящего изобретения является получение концентрата раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, из которого можно легко получить раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, достигая указанные выше цели.

Средства для решения проблем

Заявители провели интенсивные исследования для достижения указанных выше целей. Во-первых, исследователи были нацелены на получение растворов для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, которые из соображений безопасности не содержат обычные органические растворители, такие как ксилол, бензол или толуол, и которые главным образом составлены из воды с учетом среды и других факторов. В этом отношении исследователи изучали различные поверхностно-активные вещества в качестве компонента раствора для предварительной обработки, который оказывает и эффекты достаточного элюирования содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, и ингибирования плавания элюированной заливочной среды на поверхности раствора для диспергирования среды в растворе с целью обеспечения возможности последующего использования раствора для предварительной обработки.

В результате, было выявлено, что указанные выше два эффекта невозможно получить одновременно только одним поверхностно-активным веществом, что эти два эффекта могут быть получены в некоторой степени при использовании двух определенных поверхностно-активных веществ, но если получен щелочной раствор для предварительной обработки, и он используется последовательно три раза или более, то вероятно отталкивание красящего агента на части предметного стекла без образца, что приводит к неравномерному окрашиванию на стадии окрашивания после использования последовательно использованного раствора для предварительной обработки.

Затем, был предпринят поиск компонентов, которые, как считалось, решают такие проблемы, путем комбинирования двух определенных поверхностно-активных веществ с различными полимерными соединениями.

Кроме того, для подтверждения способности одного раствора одновременно элюировать заливочную среду и извлекать антигены и оказывать небольшой эффект на интенсивность окрашивания на стадии окрашивания, для решения указанных выше проблем были исследованы различные комбинации компонентов с обычными агентами для извлечения антигенов.

Кроме того, исследователи были нацелены на применение циклодекстрина и его производных, которые не использовались в растворе для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, но, как было описано в патентной публикации 1, способны удалять остаточные поверхностно-активные вещества при их содержании в промывающем растворе, используемом после раствора для предварительной обработки.

В результате, посредством экспериментирования было выявлено, что когда циклодекстрин или его производное добавляется в количестве 2% масс. в раствор для предварительной обработки наряду с двумя указанными выше определенными поверхностно-активными веществами и агентом для извлечения антигена, то действие самих поверхностно-активных веществ ингибировалось, возможно, вследствие связывания с поверхностно-активными веществами, как описано в патентной публикации 1, диспергируемость заметно ухудшалась, и проблема нерастворимого парафина возникала снова, и ее следовало решать. Кроме того, интенсивность окрашивания на стадии окрашивания значительно снижалась, и ожидаемый эффект невозможно было достичь. Однако неожиданно было подтверждено, что циклодекстрин или его производное в определенном содержании может предотвратить ингибирование действия поверхностно-активных веществ, может ингибировать ухудшение интенсивности окрашивания и может решить различные указанные выше проблемы.

Кроме того, было обнаружено, что когда амфифильный раствор добавлялся к указанной выше композиции, то интенсивность окрашивания дополнительно усиливалась, и можно было дополнительно улучшить эффект ингибирования отталкивания окрашивающего реагента, который, в противном случае, возникает, когда раствор для предварительной обработки является щелочным.

В соответствии с настоящим изобретением получен раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания для элюирования содержащего парафин заливочного раствора с предметного стекла с образцом ткани, залитым в указанную среду, и для извлечения антигенности указанного образца ткани, причем указанный раствор для предварительной обработки может использоваться три или более раз, причем указанный раствор для предварительной обработки содержит агент для извлечения антигенов, неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-алкилфенилэфир и циклодекстрин или его производное, причем остальное количество составляет не менее чем 80% масс. воды, где содержание указанного агента для извлечения антигенов таково, что pH указанного раствора для предварительной обработки составляет от 5,0 до 10,0, и содержание указанного циклодекстрина или его производного составляет от 0,01 до 1,0% масс., и где указанный раствор для предварительной обработки необязательно содержит амфифильный раствор.

В соответствии с настоящим изобретением также получен концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, содержащий меньше воды, чем указанный выше раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, где указанный раствор для предварительной обработки предназначен для использования в качестве раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания при заданном pH путем добавления к нему заданного количества воды при использовании.

В соответствии с настоящим изобретением, кроме того, получен указанный выше концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, где указанный заданный pH составляет от 5,0 до 7,0, и где указанный концентрат раствора для предварительной обработки поставляется одной частью.

В соответствии с настоящим изобретением также получен указанный выше концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, где указанный концентрат раствора для предварительной обработки поставляется в двух частях и состоит из первого концентрата раствора, содержащего агент для извлечения антигенов, и второго концентрата раствора, содержащего неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-алкилфенилэфир, неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтиленсорбитан, циклодекстрин или его производное и, необязательно, амфифильный раствор, и где указанный концентрат раствора для предварительной обработки предназначен для применения путем смешивания указанного первого концентрата раствора, указанного второго концентрата раствора и заданного количества воды для установки указанного заданного pH от 8,0 до 10,0.

Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением содержит агент для извлечения антигенов, два определенных поверхностно-активных вещества и определенное содержание циклодекстрина или его производного и в качестве остальной части не менее чем 80% масс. воды. Таким образом, раствор функционирует и для элюирования содержащей парафин заливочной среды, используемой при иммуногистохимическом окрашивании, с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, и для извлечения антигенности образца ткани; обеспечивает возможность достаточной интенсивности окрашивания при последующем иммуногистохимическом окрашивании; поддерживает диспергированную в нем элюированную заливочную среду даже после первого использования для предотвращения появления нерастворимого парафина на поверхности раствора после использования; и может использоваться три или более раз последовательно. Кроме того, настоящий раствор для предварительной обработки, не содержащий органических растворителей, таких как ксилол, имеет высокую безопасность и экологические преимущества. Кроме того, даже при получении в виде щелочного раствора, раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением все же ингибирует отталкивание окрашивающего реагента.

Поэтому, путем использования раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, иммуногистохимическое окрашивание может проводиться в течение короткого периода времени и с меньшими затратами труда.

Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, когда он дополнительно содержит амфифильный раствор, обеспечивает возможность еще более усиленной интенсивности окрашивания и обеспечивает еще лучший эффект ингибирования отталкивания окрашивающего реагента.

Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, содержащий меньше воды, чем раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, может легко использоваться в качестве раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания при заданном pH путем добавления заданного количества воды при использовании.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Теперь настоящее изобретение будет объяснено подробно.

Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания и концентрат этого раствора в соответствии с настоящим изобретением предназначены для так называемого иммуногистохимического окрашивания, при котором специфическое вещество (антиген), присутствующий в нормальной или опухолевой тканях или клетках живых организмов, выявляется на основании специфической реакции антиген-антитело для патоморфологической диагностики.

Образцы ткани, подлежащие иммуногистохимическому окрашиванию, обычно фиксированы формалином, спиртом и тому подобными веществами, и залиты в заливочную среду, содержащую парафин, для длительного хранения. Получают срезы такого фиксированного формалином, залитого в парафин блока и сцепляют их с предметным стеклом для иммуногистохимического окрашивания, депарафинизации и извлечения антигенов, которые должны проводиться в зависимости от вида первичного антигена, который предстоит использовать.

Общие процедуры для депарафинизации и извлечения антигенов включают три стадии, т.е. депарафинизацию, например, фиксированного формалином залитого в парафин образца ткани, как указано выше, органическим раствором, таким как ксилол, бензол или толуол; регидратацию депарафинизированного образца ткани амфифильным раствором, таким как этанол, и извлечение антигенов, присутствующих в регидрированном депарафинизированном образце ткани. После этих стадий проводят иммуногистохимическое окрашивание, включая промывание и окрашивание.

Настоящее изобретение обеспечивает возможность одновременного проведения трехэтапной предварительной обработки в одном растворе, т.е. растворе для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания. Растворы для предварительной обработки, используемые таким образом, ранее были предложены и имелись в продаже, но большинство из них предназначалось для однократного применения, и немногие из них могут использоваться три или более раз последовательно, например, последовательно примерно от трех до четырех раз. Настоящее изобретение относится к получению такого раствора для предварительной обработки и его концентрату, которые могут использоваться три раза или более, предпочтительно, от трех до пяти раз.

Раствор для предварительной обработки в соответствии с настоящим изобретением содержит не менее чем 80% масс., предпочтительно, не менее чем 85% масс., более предпочтительно, не менее чем 90% масс. воды, не содержит обычно применяемые органические растворители, такие как ксилол, из-за опасений относительно безопасности, и содержит извлекающий антигены агент, два определенных неионных поверхностно-активных вещества, и циклодекстрин или его производное. Вода предпочтительно представляет собой деионизированную воду. В данном случае это содержание воды включает любое содержание влаги других компонентов.

Агент, извлекающий антигены, конкретно не ограничивается, пока он является обычным и обеспечивает возможность извлечения антигенности термической обработкой, и могут быть соответственно выбраны агенты, способные регулировать pH в зависимости от ткани, подлежащей обработке. Примеры агента, извлекающего антигены, могут включать различные буферные растворы, такие как цитратные буферы, Трис-буферы, SSC (солевые, натриево-цитратные) буферы и указанные соединения, смешанные с хелатирующим агентом, таким как ЭДТА.

Содержание извлекающего антигены агента может быть соответственно выбрано в зависимости от подлежащей обработке ткани с тем, чтобы pH раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению укладывался в пределы диапазона от 5,0 до 10,0, предпочтительно от 6,0 до 9,0.

Два конкретных поверхностно-активных вещества представляют собой неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен (далее обозначаемый аббревиатурой POE)-алкилфенилэфир и неионное поверхностно-активное вещество POE-сорбитан.

В растворе для предварительной обработки по настоящему изобретению, неионное поверхностно-активное вещество POE-алкилфенилэфир, главным образом, участвует в депарафинизации и может предпочтительно представлять собой, например, по меньшей мере, одно из NP-40, Тритона X-100, Тритона X-104 или IGEPAL CA-630.

Содержание неионного поверхностно-активного вещества POE-алкилфенилэфира может быть соответственно выбрано с учетом указанной выше функции и обычно составляет от 0,01 до 1,0% масс., предпочтительно, от 0,01 до 0,5% масс., более предпочтительно, от 0,05 до 0,3% масс. При слишком низком содержании неионного поверхностно-активного вещества POE-алкилфенилэфира, эффект депарафинизации может быть небольшим, тогда как при слишком высоком содержании может быть трудно поддерживать заданную температуру при нагревании для извлечения антигенов, что будет обсуждено ниже.

В растворе для предварительной обработки по настоящему изобретению неионное поверхностно-активное вещество POE-сорбитан главным образом выполняет функцию поддержания дисперсии в нем элюированного парафина в течение трех или более раз использования, посредством взаимодействия с циклодекстрином или его производным, что будет обсуждено ниже. Неионное поверхностно-активное вещество POE-сорбитан может представлять собой, по меньшей мере, одно из Твина 20, Твина 40 или Твина 80.

Содержание неионного поверхностно-активного вещества POE-сорбитана может быть соответственно выбрано с учетом указанной выше основной функции и обычно составляет от 0,3 до 3,0% масс., предпочтительно, от 0,5 до 1,5% масс., более предпочтительно, от 0,5 до 1,0% масс. При слишком низком содержании неионного поверхностно-активного вещества POE-сорбитана может нарушаться диспергируемость парафина при последовательном использовании, тогда как при слишком высоком содержании может быть трудно поддерживать заданную температуру при нагревании для извлечения антигенов, что будет обсуждено ниже.

В растворе для предварительной обработки по настоящему изобретению циклодекстрин или его производное главным образом участвует в ингибировании отталкивания окрашивающего реагента предметным стеклом на стадии окрашивания после предварительной обработки, а также при поддержании элюированного парафина диспергированным в растворе для предварительной обработки. Циклодекстрин или его производное может представлять собой, по меньшей мере, одно из α-, β- и γ-циклодекстрина, которые представляют собой натуральные продукты, в частности, с улучшенной растворимостью в воде путем добавления гидроксильной группы и т.п. Предпочтительные примеры могут включать гидроксиалкилциклодекстрины, такие как гидроксиалкил-α-циклодекстрин, гидроксиалкил-β-циклодекстрин и гидроксиалкил-γ-циклодекстрин, причем особенно предпочтителен гидроксиалкил-β-циклодекстрин. Алкил может представлять собой, например, этил или пропил.

Содержание циклодекстрина или его производного составляет от 0,01 до 1,0% масс., предпочтительно, от 0,05 до 0,5% масс, более предпочтительно, от 0,05 до 0,3% масс. При содержании циклодекстрина или его производного менее чем 0,01% масс. нельзя достичь эффекта ингибирования отталкивания окрашивающего реагента предметным стеклом. С другой стороны, при содержании более 1,0% масс. происходит неблагоприятное воздействие на указанный выше эффект поддержания элюированного парафина диспергированным в растворе для предварительной обработки, и ингибируется эффект поверхностно-активного вещества. Также ингибируется извлечение антигенов и невозможно достичь достаточной интенсивности окрашивания. Таким образом, необходимо внимательно следить за верхним пределом содержания циклодекстрина или его производного, поскольку может ингибироваться желательный эффект настоящего изобретения.

Раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению может необязательно содержать другие компоненты, в дополнение к указанным выше основным компонентам, с целью улучшения желательных эффектов или проявления других эффектов без ингибирования желательных эффектов настоящего изобретения.

В качестве таких других компонентов, амфифильный раствор может предпочтительно содержаться для возможности обеспечения улучшенной интенсивности окрашивания при окрашивании после предварительной обработки и для дополнительного улучшения эффекта ингибирования отталкивания окрашивающего реагента от предметного стекла комбинацией с циклодекстрином или его производным.

Амфифильный раствор конкретно не ограничивается, пока можно ожидать улучшения указанных выше эффектов, и может предпочтительно представлять собой, например, по меньшей мере, одно из этиленгликоля, пропиленгликоля или 1,3-бутиленгликоля. Среди них этиленгликоль имеет особые преимущества для использования три или более последовательных раз, поскольку, в дополнение к улучшению указанных выше эффектов, он оказывает эффект ингибирования повторного сцепления с предметным стеклом мелких частиц элюированного парафина, диспергированных в растворе для предварительной обработки.

Содержание амфифильного раствора, если он входит в состав раствора для предварительной обработки в соответствии с настоящим изобретением, может соответственно выбираться с учетом его эффекта и может обычно составлять от 1,0 до 5,0% масс., предпочтительно, от 2,0 до 4,0% масс. При слишком низком содержании амфифильного раствора ожидаемое улучшение эффектов может не быть достигнуто, тогда как при слишком высоком содержании может неблагоприятно подавляться эффект ингибирования нерастворимого парафина, который является одним из эффектов раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению.

Другие компоненты могут дополнительно включать, кроме амфифильного раствора, по меньшей мере, один из консервантов и дезинфицирующих средств, таких как азид натрия, тимеросал, гентамицин, ProClin (торговое название, производимый SUPELCO), п-гидроксибензоаты (парабен), бензалконий хлорид и циклопиридиния хлорид. Содержание таких других компонентов может быть соответственно выбрано с учетом их функций, пока не ингибируются эффекты настоящего изобретения.

Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением предназначен для получения указанного выше раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению, содержит меньше воды, чем раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению, и предназначен для использования при заданном pH путем добавления к нему заданного количества воды при использовании.

Уровень концентрации может быть соответственно выбран и может обычно быть 5-20-кратным, предпочтительно, 5-10-кратным.

Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, когда заданный pH составляет от 5,0 до 7,0, предпочтительно поставляется в одной части для улучшенной устойчивости при хранении.

С другой стороны, когда заданный pH составляет от 8,0 до 10,0, то концентрат раствора для предварительной обработки может поставляться в двух частях и составлен из первого концентрата раствора, содержащего извлекающий антигены агент и, необязательно, консервант, и второго концентрата раствора, содержащего неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-алкилфенилэфир, неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-сорбитан, циклодекстрин или его производное и, необязательно, амфифильный раствор и буфер.

Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, поставляемый или в одной, или в двух частях, может быть превращен в раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению смешиванием с заданным количеством воды, такой как деионизированная вода, для установки на заданный уровень pH.

Раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению может использоваться или в ручном способе, или в автоматизированном устройстве. В частности, удобно и предпочтительно использование автоматизированного устройства с регулируемой температурой или автоматического устройства для иммуногистохимического окрашивания.

Предварительная обработка для иммуногистохимического окрашивания с использованием раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению может проводиться, например, введением образца, такого как предметное стекло с образцом ткани, залитом в содержащую парафин заливочную среду, в раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению, температура которого регулируется обычно от 20 до 70°C, предпочтительно, до уровня не ниже чем точка плавления заливочной среды, такой как парафин, и встряхиванием системы множество раз для содействия депарафинизации. В этот момент обычно следует подтвердить удаление парафина.

Затем, температуру раствора для предварительной обработки поднимают для стимуляции извлечения антигенов в условиях необязательного повышения давления для укорочения времени реакции. Температура обычно составляет от 80 до 130°C, предпочтительно, от 90 до 120°C, и время удерживания при такой температуре составляет обычно от 1 до 70 минут, предпочтительно, примерно от 5 до 60 минут.

После обработки при повышенной температуре температура раствора для предварительной обработки снова снижается до примерно 20-70°C, и систему встряхивают для завершения посредством этого предварительной обработки.

Раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению может использоваться три или более, обычно, от трех до пяти, предпочтительно, от трех до четырех последовательных раз, с тем, чтобы предварительная обработка следующего образца ткани могла проводиться аналогичным образом используемым раствором для предварительной обработки, и если раствор предназначен для пятиразового использования, то аналогичные результаты окрашивания могут быть получены от первой и пятой предварительной обработки.

Предварительно обработанное предметное стекло может быть подвергнуто иммуногистохимическому окрашиванию путем выполнения последующей стадии промывания и стадии иммуногистохимического окрашивания посредством обычных способов.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение будет подробнее объяснено со ссылкой на примеры, контрольные примеры и сравнительные примеры, которые не ограничивают настоящее изобретение.

В приведенных ниже примерах, оценки проводили следующим образом.

Предмет оценки (1): Возможно или невозможно одновременное проведение депарафинизации и извлечения антигенов в одном растворе для предварительной обработки.

Оценки были обозначены как «Y» для возможных оценок и «N» для невозможных оценок.

Предмет оценки (2): Визуальное наблюдение нерастворимого парафина на поверхности раствора после депарафинизации и извлечения антигена раствором для предварительной обработки.

Оценки были обозначены в виде 5 баллов для растворов с налетом на поверхности, 4 балла для растворов с небольшим налетом на поверхности, 3 балла для растворов с небольшими массами налета на поверхности, 2 балла для растворов со смешанными небольшими и большими массами налета на поверхности и 1 балл для растворов с большими массами налета на поверхности (результаты представлены в виде средней величины трех раз использования).

Предмет оценки (3): Визуальное наблюдение отталкивания реагента для иммуногистохимического окрашивания на предметном стекле.

Оценки были обозначены в виде 5 баллов для наблюдений без отталкивания, 4 балла для наблюдений с несколькими мелкими частями отталкивания, 3 балла для наблюдений с множественными мелкими частями отталкивания, 2 балла для наблюдений со смешанными мелкими и крупными частями отталкивания и 1 балл для наблюдений с крупными частями отталкивания или серьезными проблемами.

Предмет оценки (4): Интенсивность окрашивания, наблюдаемая под оптическим микроскопом

Оценки обозначались в виде двух 2 баллов для наблюдений с более высокой интенсивностью, по сравнению с контрольными примерами 1-3, 1 балл для наблюдений с несколько более высокой интенсивностью по сравнению с контрольными примерами 1-3, 0 баллов для наблюдений с интенсивностью, сравнимой с с контрольными примерами 1-3, -1 балл для наблюдений с несколько более низкой интенсивностью по сравнению с контрольными примерами 1-3 и -2 балла для наблюдений с более низкой интенсивностью по сравнению с контрольными примерами 1-3.

Предмет оценки (5): Толщина ткани после депарафинизации и извлечения антигенов раствором для предварительной обработки (чем тоньше ткань, тем больше парафина и тому подобных материалов, присутствующих внутри образца ткани было достаточно элюировано).

Оценки обозначались в виде 5 баллов для наблюдений, сравнимых с контрольными примерами 1-3, 4 баллов для наблюдений, где образцы ткани были несколько толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3, 3 баллов для наблюдений, где образцы ткани были слегка толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3, 2 баллов для наблюдений, где образцы ткани были толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3 и 1 балла для наблюдений, где образцы ткани были значительно толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3.

Предмет оценки (6): Определение того, возможны ли или нет три последовательных раза использования раствора для предварительной обработки с точки зрения предметов оценки (1)-(5).

Оценки обозначались как «Y» для случаев возможной оценки и «N» для случаев невозможной оценки.

Контрольные примеры 1-3 (депарафинизацию, регидратацию и извлечение антигенов проводили отдельно в соответствии с обычной практикой)

(A) Пред