Иммуногенный эпитоп вируса гриппа

Иммуногенный эпитоп вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к получению вирусоподобных частиц. В частности, настоящее изобретение направлено на получение вирусоподобных частиц, в состав которых входят антигены вируса гриппа, в особенности модифицированные антигены вируса гриппа, антитела к которым обладают широкой перекрестной реактивностью с другими штаммами вируса гриппа.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Грипп является основной причиной смерти людей от респираторных вирусных инфекций. К общим симптомам этого заболевания относятся лихорадка, боль в горле, одышка и слабость мышц, а также другие симптомы. Во время сезонных вспышек вирус гриппа поражает 10-20% населения мира и приводит к смерти 250-500 тыс. человек ежегодно.

Вирусы гриппа являются оболочечными вирусами, которые отпочковываются от плазматических мембран инфицированных клеток млекопитающих. В зависимости от вида антигенов матрикса и нуклеопротеинов выделяют вирусы гриппа: класса А, В и С. Вирусы гриппа типа А в зависимости от наличия различных поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) - также подразделяются на подтипы. НА обусловливают способность вируса связываться с клетками организма хозяина и проникать в них, NA отщепляет концевые остатки сиаловой кислоты от полисахаридных цепочек на клетке-хозяине и от поверхностных вирусных белков, что предотвращает агрегацию вирусных частиц и увеличивает их мобильность. В настоящее время ученым известно 16 подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9). На частицах вируса гриппа типа А присутствует один подтип гликопротеина НА и один подтип другого гликопротеина - NA. В целом, отдельные подтипы гликопротеинов характеризуются видоспецифичностью; например, все вирусы со всеми подтипами НА и NA инфицируют птиц, тогда как человека инфицируют только вирусы со следующими подтипами гликопротеинов: HI, Н2, Н3, Н5, Н7, Н9, Н10, N1, N2, N3 и N7 (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Вирусы гриппа, в состав которых входят гликопротеины Н5, Н7 и Н9, считаются наиболее патогенными формами вируса гриппа А. Эти вирусы являются наиболее вероятными причинами пандемий в будущем.

Пандемии вируса гриппа, как правило, вызывают высоко контагиозные и высоко вирулентные вирусы гриппа. Эти вирусы могут привести к повышению заболеваемости и смертности в мировом масштабе. Возникновение новых подтипов вируса гриппа А привело к 4-м масштабным пандемиям в 20-м веке. Смертность от «испанки», вызванной вирусом H1N1 в 1918-1919 гг., составила более 50 миллионов человек во всем мире в период с 1917 по 1920 гг. И в настоящее время существует риск появления нового подтипа или передачи людям подтипа вируса, эндемичного для животных. Особую обеспокоенность вызывает высоковирулентная форма птичьего гриппа, вспышки которого уже были зарегистрированы в нескольких странах мира. Во многих случаях птичий грипп характеризовался смертностью, достигающей 100%, в течение первых 48-и часов заболевания. Предполагается, что распространение вируса птичьего гриппа (H5N1), впервые выявленного в Гонконге в 1997 г., в другие азиатские страны и в Европу было связано с миграцией диких птиц.

Современным методом борьбы с гриппом человека является ежегодная вакцинация. Вакцина - это, как правило, комбинация нескольких штаммов, которые по прогнозам будут преобладать в период следующей сезонной вспышке гриппа. Прогнозирование координируется Всемирной организацией здравоохранения. Как правило, число доз вакцины, которое выпускается ежегодно, недостаточно для вакцинации населения мира. Например, в Канаде и Соединенных Штатах число доз вакцины достаточно для иммунизации примерно одной трети населения, тогда как в Европе - лишь 17%. Очевидно, что количество произведенной во всем мире вакцины против гриппа будет недостаточным перед лицом всемирной пандемии гриппа. Даже если в каком-то году удастся каким-либо образом произвести достаточное число доз вакцины, то преобладающие штаммы в следующем году изменятся. Поэтому создание запасов в межсезонье не является выходом из сложившейся ситуации. В экономическом плане крупномасштабное производство эффективной вакцины против гриппа представляет собой значительный интерес для правительств и промышленности.

В настоящее время наиболее важные запасы вирусных частиц для производства вакцин получаются из оплодотворенных яиц. Вирусные частицы собираются и разрушаются с помощью детергента. Так получается инактивированная вирусная вакцина. Живые аттенуированные вакцины состоят из частиц вируса гриппа, адаптированных к росту при низкой температуре. При этом при нормальной температуре тела вакцина становится аттенуированной. Применение такой вакцины разрешено в США у детей и взрослых в возрасте от 5 до 49 лет. Инактивированные цельновирионные вакцины получаются путем инактивации вирусных частиц химическими агентами, что приводит к утрате патогенных свойств. Такие вакцины получаются из оплодотворенных яиц или клеточных линий млекопитающих. У вакцин различных типов есть свои преимущества и недостатки. Одним из преимуществ вакцин, полученных из цельных вирусных частиц, является тип иммунитета, вызванного такими вакцинами. В целом, расщепленные вакцины вызывают сильный ответ со стороны антител, тогда как вакцины, полученные из цельных вирусных частиц, индуцируют как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Функциональный ответ со стороны антител является критерием для выдачи разрешения на применение вакцины. Этот показатель коррелирует со степенью защиты, предоставляемой вакциной. Тем не менее, получены доказательства, что ответ со стороны Т-лимфоцитов также важен для реализации иммунитета против гриппа; клеточный иммунитет может предоставлять более качественную защиту от гриппа у пожилых людей.

Для индукции клеточного иммунитета против гриппа были разработаны цельновирионные вакцины. Вследствие высокой патогенности штаммов вируса гриппа (например, подтипа H5N1), эти вакцины производятся в лабораториях класса биологической безопасности 3+ (BL3+). Для производства высокопатогенных штаммов вируса гриппа, таких как H5N1, некоторые производители модифицировали последовательность гена гемагглютинина, что позволило снизить патогенность штамма вируса гриппа, сделать его авирулентным и относительно легко воспроизводимым в оплодотворенных яйцах или клеточных культурах млекопитающих. Другие производители используют реассортантные штаммы вируса гриппа, в которых генетические последовательности белков гемагглютинина и нейраминидазы клонируются в высокопродуктивных и низкопатогенных донорских штаммах вируса гриппа (A/PR/8/34; Quan F-S с соавт., 2007 г.). Безусловно, эти методы могут использоваться для получения вакцин с полезными свойствами. Однако они не решают проблемы крупномасштабного, экономичного и быстрого производства вакцин в количестве, необходимом для удовлетворения глобальных потребностей в обычный год, и тем более во время пандемии.

Используя такую технологию обратной генетики, можно также ввести мутацию в последовательность гена НА с целью создания авирулентного вируса. Производство цельновирионных вакцин высокопатогенных штаммов вируса гриппа требует применения специальных мер изоляции; в иных случаях генетическая последовательность готовой вакцины не будет четко соответствовать последовательности циркулирующего вируса. В случае живых аттенуированных вакцин существует определенный риск того, что введенная вакцина может рекомбинировать с вирусом гриппа в организме хозяина, что приведет к образованию новой разновидности вируса гриппа.

Этот метод предполагает сохранение антигенного эпитопа и посттрансляционных модификаций, поэтому для него характерны определенные ограничения и недостатки, к которым относится риск контаминации вследствие использования цельных вирусных частиц и различная степень выхода, зависящая от штамма вируса. Генетическая гетерогенность вируса вследствие инфицирования им яиц может привести к развитию субоптимальной защиты от инфекции. К другим недостаткам относится экстенсивное планирование для получения инфицированных яиц, риск контаминации вследствие использующихся при очитке химических веществ, а также длительность процедуры. Кроме того, введение такой вакцины может быть противопоказано лицам, гиперчувствительным к белку куриных яиц.

В случае пандемии производство расщепленной вакцины будет занимать большее время, вследствие необходимости адаптации штамма к росту на яйцах и неравномерного выхода продукции. И хотя эта технология в течение многих лет использовалась для производства сезонных вакцин, она вряд ли будет соответствовать приемлемым временным рамкам при пандемии, поскольку всемирная производственная мощность ограниченна.

Недавняя вспышка вируса гриппа А подтипа H1N1 в Мексике также выявила острую необходимость в разработке методики быстрого производства вакцины вновь возникающих штаммов.

Использование куриных яиц для производства вакцин не является обязательным. Вирусы гриппа также получаются в культурах клеток млекопитающих, например, в клеточных линиях MDCK или PERC.6, а также других клеточных линиях. Можно также использовать методы обратной генетики, когда вирусные частицы образуются вследствие трансформации клетки вирусными генами. Тем не менее, эти методы также требуют использования цельных вирусных частиц, трудоемких методов и специфических культурных сред.

Было разработано несколько рекомбинантных препаратов, таких как рекомбинантные вакцины-кандидаты против гриппа. В этих случаях ученые сосредоточились на экспрессии, производстве и очистке белков НА и NA вируса гриппа типа А, в том числе на экспрессии этих белков с использованием клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (Crawford с соавт., 1999; Johansson, 1999), вирусных векторов и вакцинных конструкций на основе ДНК (Olsen с соавт., 1997).

Особенности инфекции, вызванной вирусом гриппа, хорошо известны. Вкратце перечислим их. Инфекционный цикл начинается с прикрепления поверхностного вирусного белка НА к клеточному рецептору, содержащему остатки сиаловой кислоты (гликопротеины и гликолипиды). Белок NA опосредует процессинг рецептора, содержащего остатки сиаловой кислоты, а проникновение вируса в клетку зависит от НА-зависимого рецептор-опосредованного эндоцитоза. В кислотной среде сформированный при захвате клеткой частиц вируса гриппа эндосом белок НА претерпевает конформационные изменения, которые ведут к слиянию вирусных и клеточных мембран и декапсидации вируса. При этом происходит М2-опосредованное высвобождение белков M1 из нуклеокапсид-ассоциированных рибонуклеопротеинов (РНП), которые мигрируют в ядро клетки для синтеза вирусной РНК. Антитела к белкам НА предотвращают инфицирование клетки вирусом путем нейтрализации инвазионной способности вируса. Антитела к белкам NA реализуют свое противовирусное действие на ранних этапах репликации вируса.

Crawford с соавт. (1999) описали экспрессию белков НА вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом. Экспрессируемые белки обладали способностью предотвращать смертельные случаи гриппа, вызванные птичьими подтипами вируса гриппа Н5 и Н7. Johansson с соавт. (1999) указали, что белки вируса гриппа НА и NA, экспрессируемые бакуловирусом, вызывают иммунный ответ у животных, который по интенсивности превышает иммунный ответ на традиционные вакцины. Иммуногенность и эффективность гемагглютинина лошадиного вируса гриппа, экспрессируемого бакуловирусом, была сравнимой с иммуногенностью гомологичной ДНК-вакцины-кандидата (Olsen с соавт., 1997). Все эти данные указывают на то, что рекомбинантные белки НА и NA могут создать высокоэффективную защиту против вируса гриппа. Это подтверждено с помощью различных экспериментальных подходов для различных животных моделей.

Упомянутые выше исследования показали, что поверхностные вирусные гликопротеины НА и NA являются основной мишенью для создания защитного иммунитета против вируса гриппа, а белки M1 могут служить мишенью для создания клеточного иммунитета. Поэтому новые вакцины-кандидаты могут включать все эти вирусные антигены, т.е. иметь вид макромолекулярной белковой частицы, например, вирусоподобной частицы (ВПЧ). Использование ВПЧ для создания вакцинных препаратов имеет некоторые преимущества. Так, ВПЧ более иммуногены по сравнению с субъединичными или рекомбинантными антигенами и могут стимулировать образование как гуморального, так и клеточного иммунного ответа (Grgacic и Anderson, 2006). Кроме того, частицы с антигенами вируса гриппа могут презентовать конформационные эпитопы, которые вызывают образование нейтрализующих антител к вирусам гриппа различных штаммов.

Получение неинфекционных штаммов вируса гриппа для создания вакцины является одним из способов предотвращения непреднамеренного инфицирования. С другой стороны, вирусоподобные частицы (ВПЧ) исследовались как заменители культивированных вирусов. ВПЧ имитируют структуру вирусного капсида, но не обладают геномом. Поэтому они не могут реплицироваться или приводить к развитию вторичной инфекции.

Ряд исследований показали, что рекомбинантные белки вируса гриппа самостоятельно формируют ВПЧ в клеточных культурах с плазмидами экспрессии млекопитающих или векторами бакуловируса (Gomez-Puertas с соавт., 1999; Neumann с соавт.2000; Latham и Galarza, 2001). Gomez-Puertas с соавт.(1999) показали, что эффективное формирование ВПЧ вируса гриппа зависит от уровня экспрессии некоторых вирусных белков. Neumann с соавт. (2000) создали систему с плазмидами экспрессии млекопитающих, предназначенную для получения инфекционных вирусоподобных частиц на основе клонированных кДНК (комплементарных ДНК). Latham и Galarza (2001) сообщили о формировании ВПЧ вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, коэкспрессирующим гены НА, NA, M1 и М2. Эти исследования показали, что белки вириона гриппа могут самостоятельно формировать частицы при одновременной экспрессии соответствующих генов в эукариотических клетках.

Gomez-Puertas с соавт.(2000) указали, что для построения ВПЧ в клетках насекомых большое значение имеют как гемагглютинин (НА), так и матриксный белок M1. В то же время Chen с соавт.(2007) доказали, что для формирования ВПЧ белок M1 не обязателен. Указанные авторы обнаружили, что эффективное высвобождение M1 и ВПЧ требовало наличия НА и активности сиалидазы, которая обеспечивалась NA. NA отщепляет остатки сиаловой кислоты от гликопротеинов на поверхности клеток, что приводит к образованию ВПЧ и высвобождению ВПЧ в окружающую среду.

Quan с соавт. (2007) установили, что вакцина на основе ВПЧ, сформированных с помощью системы экспрессии на основе бакуловируса (в клетках насекомых), приводит к образованию защитного иммунитета против некоторых штаммов вируса гриппа (A/PR8/34 (H1N1)). ВПЧ, изученные Quan, отпочковывались от плазматической мембраны и характеризовались адекватными размерами и морфологией, соответствующими размерам и морфологии ВПЧ, полученных с помощью систем на основе клеток млекопитающих (клеток MDCK).

Оболочечные вирусы могут приобретать липидный капсид при отпочковывании от инфицированной клетки и мембрану, построенную из элементов плазматической мембраны или внутренних органелл клетки. Частицы вируса гриппа и ВПЧ отпочковываются от плазматической мембраны клетки-хозяина. Например, в клеточных системах на основе клеток млекопитающих или на основе бакуловируса частицы вируса гриппа отпочковываются от плазматической мембраны (Quan с соавт., 2007).

Инфицирование растений свойственно лишь некоторым оболочечным вирусам (например, представителям топовирусов и рабдовирусов). Эти вирусы отпочковываются от внутренних мембран клетки-хозяина, а не от плазматической мембраны. В растительных клетках-хозяевах было получено лишь небольшое число рекомбинантных ВПЧ, однако ни одна из них не происходила из плазматической мембраны. В настоящее время технология получения ВПЧ вируса гриппа основывается на коэкспрессии различных вирусных белков, и эта зависимость является ограничением такой технологии, поскольку в случае пандемий или ранних эпидемий для эффективной вакцинации критичным становится время, необходимое для создания вакцины. Для ускорения разработки вакцины несомненными преимуществами будет обладать более простая система производства ВПЧ, основывающаяся на экспрессии только одного вирусного белка.

Производство ВПЧ на основе НА вируса гриппа в растительных системах было описано в заявке на патент WO 2009/009876. В этой заявке было показано, что белок НА вируса гриппа может самостоятельно собираться в растительных клетках-хозяевах с формированием ВПЧ, которые отпочковываться от плазматической мембраны.

Для защиты мировой популяции от гриппа и предотвращения будущих пандемий производителям вакцин необходимо разработать эффективные и быстрые методы производства большого количества доз вакцины. Применяющаяся в настоящее время технология производства вакцины на основе оплодотворенных яиц не пригодна для производства достаточного числа доз вакцины и предполагает большие временные затраты. Используемые белки НА являются специфичными для каждого штамма и не вызывают образования антител с перекрестной реактивностью к другим штаммам, что исключает создание вакцин широкого спектра. Поэтому необходимым условием становится постоянное производство вакцины или быстрое реагирование при идентификации нового штамма.

Возможно введение определенных мутаций и (или) модификаций в нативный белок НА, использующийся для создания ВПЧ. Эти модификации приведут к получению белка гемагглютинина, обладающего более широким спектром и индуцирующего образование нейтрализующих антител к нескольким штаммам вируса гриппа даже после однократного введения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является создание усовершенствованной вакцины против гриппа.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание новых вирусоподобных частиц гриппа.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание белка гемагглютинина, модифицированного для образования антител более широкого спектра.

Настоящее изобретение предполагает создание полипептида с последовательностью аминокислотных остатков, идентичной таковой для N-связанного гликопротеина нуклеокапсида вируса, но частично или полностью свободного от N-связанных углеводов (т.е. содержащего один или несколько незамещенных сайтов гликозилирования по сравнению с последовательностью оригинального нативного белка НА), а также включает методы производства и использования этого полипептида.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание белка НА, в котором один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования из домена НА1 были модифицированы (депонированы, мутированы, удалены, освобождены) от заместителя, что позволит создать ВПЧ гриппа для приготовления вакцины против гриппа широкого спектра.

В частности, домен НА1 включает аминокислоты, занимающие позиции 1-331 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. 34). В частности, домен НА1 включает глобулярную головку и домен F'2 белка, что соответствует аминокислотам, занимающим позиции 39-331 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. 34). В частности, сайт гликозилирования, лишенный заместителя, расположен в глобулярной головке белка, в частности, в районе аминокислот, занимающих позиции 39-273 последовательности SEQ ID No.34. В частности, сайт гликозилирования, лишенный заместителя, расположен в домене F′2 белка, в частности, в районе аминокислот, занимающих позиции 274-331 последовательности SEQ ID No.34.

В настоящем изобретении представлены замещения аминокислот в молекуле гемагглютинина вируса гриппа А, которые могут изменить антигенные и иммуногенные свойства НА. Эти замещения могут изменять антигенные сайты путем изменения специфичности рецептора и (или) связывания антитела с антигеном. Во всем разнообразии вариантов осуществления настоящего изобретения повышение антигенности вследствие замещений может оказаться полезным для производства вакцин против гриппа с более широкой перекрестной реактивностью. В частности, замещение аминокислот приводит к образованию молекул с иммуногенными характеристиками белка НА с аминокислотным замещением неаспарагиновых остатков, расположенных в сайте связывания с рецептором, т.е. в позициях 154 и (или) 165 и (или) 286 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. 34). В отдельных вариантах осуществления изобретения аминокислотное замещение предполагает удаление (делецию) сайта гликозилирования или отщепление от него заместителя.

Молекула НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может включать одну или несколько негликозилированных аминокислот, соответствующих позициям 154 и (или) 165 и (или) 286 в Н5 НА; при этом удаление одного из этих сайтов гликозилирования приводит к повышению реакционной способности вируса с антисыворотками, полученными от животных, подвергавшихся воздействию вируса гриппа с молекулой НА дикого типа.

Для разрушения сайта гликозилирования триадный сигнал N-X-S/T (где N - это аспарагин (Asn), X - любая аминокислота, за исключением пролина (Pro), a S/T может быть как серотонином (Ser), так и треонином (Thr)) может быть модифицирован с помощью методов белковой инженерии. Первый подход может заключаться в замещении Asn любой другой аминокислотой. Второй подход - это замещение аминокислоты S/T в позиции n+2 относительно гликозилируемого аспарагина любым другим аминокислотным остатком. Подходящей аминокислотой для замещения аспарагина, серина или треонина является аланин, однако может использоваться любая другая аминокислота. Например, Asn может замещаться Leu (лейцином). Не (изолейцином), Val (валином), Thr (треонином), Ser (серином) или Аlа (аланином). Ser или Thr могут замещаться Аlа, Val, Не или Leu.

В частности, молекула НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может включать неаспарагиновые аминокислоты в позициях 154 и (или) 165 и (или) 286 в Н5 НА.

Молекула НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может включать белок НА, в котором головка лишена N-связанных сайтов гликозилирования, т.е. от заместителей освобождены все три сайта гликозилирования.

В молекуле НА вируса гриппа с повышенной антигенностью может отсутствовать один или несколько сайтов гликозилирования, выбранных из следующей группы: N-154, N-165 и N-286 (нумерация в соответствии с последовательностью штамма А/Вьетнам/1194/04).

В настоящем изобретении представлен модифицированный гемагглютинин (ГА) от различных штаммов вируса гриппа.

В настоящем изобретении также представлен способ получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) гриппа в несиалирующих клетках организма хозяина, включающий:

а) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген НА (гемагглютинин) вируса гриппа, как указано выше, оперативно связанной с регуляторной областью, обладающей активностью в несиалирующих клетках организма хозяина или его части;

б) инкубация организма хозяина или его части в условиях, которые позволяют реализоваться экспрессии нуклеиновой кислоты, следовательно, образованию ВПЧ.

Настоящее изобретение включает указанный способ, в котором на этапе введения (этапе (а)) нуклеиновая кислота может экспрессироваться в клетке-хозяине временно или постоянно. Кроме того, ВПЧ могут очищаться с помощью, например, эксклюзионной хроматографии.

В дополнение к этому, настоящее изобретение относится к несиалирующим клеткам организма хозяина, который используется для образования вирусоподобных частиц (ВПЧ), в состав которых входит белок НА вируса гриппа. В частности, подходящим хозяином для образования ВПЧ, например, является растение или его часть, растительная клетка, насекомое или его часть, клетка насекомого, дрожжевой грибок или его часть, дрожжевая клетка.

Настоящее изобретение включает описание нуклеиновой кислоты, в состав которой входит последовательность нуклеотидов, кодирующая модифицированный белок НА вируса гриппа, как указано выше, оперативно связанная с регуляторной областью, обладающей активностью в несиалирующих клетках организма хозяина. Антигеном может являться гемагглютинин вируса гриппа (НА), лишенный одного или нескольких N-связанных сайтов гликозилирования на головке молекулы (антигенных сайтов, которые в норме присутствуют в нативной последовательности).

В настоящем изобретении также представлены вирусоподобные частицы (ВПЧ), включающие белок НА вируса гриппа, как указано в этом документе, а также один или несколько липидов хозяина. Если хозяином является насекомое, то вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут включать белок НА вируса гриппа и один или несколько липидов насекомого; если хозяином является дрожжевой грибок, то вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут включать белок НА вируса гриппа и один или несколько дрожжевых липидов; если хозяином является растение, то вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут включать белок НА вируса гриппа и один или несколько растительных липидов.

В данном изобретении также представлены ВПЧ, образующиеся в клетках растений и, следовательно, содержащие один или несколько липидов растительного происхождения (называемых общим термином «растительные липиды»).

Также в изобретении представлены ВПЧ, которые образуются в клетках насекомых и включают липиды плазматической мембраны клеток насекомых (называемых общим термином «липиды насекомых»),

Также в изобретении представлены ВПЧ, которые образуются в дрожжевых клетках и включают липиды плазматической мембраны дрожжевых клеток (называемых общим термином «дрожжевые липиды»).

Также в настоящем изобретении представлены композиции, в которые входит эффективная доза ВПЧ, включающих белок НА вируса гриппа, один или несколько липидов из несиалирующей клетки хозяина, в которой образуются ВПЧ, а также фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть предназначен для перорального, внутрикожного, интраназального, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного или подкожного введения.

Кроме того, в настоящее изобретение включена композиция вакцины, в которую входит иммунологически эффективная доза ВПЧ, как указано выше, а также фармацевтически приемлемый носитель с адъювантом или без него. Вакцина может применяться перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно. В частности, вакцина может применяться без адъюванта.

В настоящем изобретении также представлен способ индукции иммунитета против вируса гриппа у определенного субъекта - способ, предполагающий введение субъекту вирусоподобных частиц, в состав которых входит белок НА вируса гриппа, один или несколько липидов хозяина и фармацевтически приемлемый носитель. Эти вирусоподобные частицы могут вводиться субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

Настоящее изобретение относится к способу индукции иммунитета к вирусу гриппа у определенного субъекта, который предполагает введение субъекту эффективной дозы вакцины, в состав которой входит одна или несколько ВПЧ, как указано выше.

Субъектом, в отношении которого применяются способы лечения, описанные выше, может являться человек, примат, лошадь, свинья, птица, водоплавающая птица, перелетная птица, перепел, утка, гусь, домашняя птица, курица, верблюд, представитель семейства псовых, собака, кошка, тигр, леопард, циветта, куница, каменная куница, хорек, домашнее животное, крупный рогатый скот, мышь, крыса, тюлень, кит или другое животное. В частности, субъектом может являться человек (пациент) или птица (включая водоплавающих птиц, перелетных птиц, домашних птиц, например, перепелок, уток, гусей, индюков, куриц), в частности, перелетных или домашних птиц, употребляемых в пищу (перепелки, утки, гуси, индюки, курицы).

Настоящее изобретение также содержит описание контейнера, такого как шприц, а также набора, включающего такой контейнер с вакцинной композицией, указанной выше.

Данное краткое описание изобретения может не охватывать всех аспектов настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Более полное представление об этих и других особенностях изобретения можно получить из приведенного ниже подробного описания. В данном описании встречаются ссылки на прилагаемые фигуры. Ниже представлено их краткое описание.

На Фигуре 1А показано расположение сайтов гликозилирования белка НА Н5 вируса гриппа А/Индонезия/5/05. Аминокислоты, их позиция и расположение указаны по аналогии со структурой последовательности вируса гриппа А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO. (идентификационный номер последовательности) 34 (Файл PDB: 2IBX). Путем разрушения сайтов гликозилирования N154, N165 и N286, расположенных на глобулярной голове, была получена молекула с тремя мутациями. Для локализации потенциальных антигенных сайтов применялось исследование Bright с соавт.(2003). Тип гликозилирования определялся на основании литературных данных о белках НА H1, Н3 и Н7 (Abe Y. С соавт.(2004); Vigerust DJ с соавт.(2007) и Kuroda с соавт.(1990);

На Фигуре 1В представлено изображение субдоменов мономера НА: субдоменов F′1 (1-38 согласно нумерации последовательности А/Вьетнам/1194/04; SEQ ID NO.34), F′2 (274-331) и F. Сайт связывания с рецептором и субдомен эстеразы вместе формируют глобулярную головку (39-273). Пептид слияния представлен в виде белого прямоугольника. В структурах НА не представлены TmD и цитоплазматический хвост, поскольку в кристаллическом виде удалось выделить лишь растворимые продукты реакции с бромелаином, структура которых и определялась.

На Фигуре 2 представлены структуры мономеров НА различных подтипов вируса гриппа А. Также представлен двойной липидный слой с его алифатической составляющей и полярными головками. Структурные изображения взяты из статьи На с соавт. (На Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) (птичий Н5);

На Фигуре 3 представлена последовательность кассеты экспрессии на основе пласто цианина люцерны, которая использовалась для экспрессии H1 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения (идентификационный номер последовательности: 8), Подчеркнут сигнальный пептид протеин-дисульфидизомеразы. Сайты рестрикции Bglll (AGATCT) и Sad (GAGCTC), которые использовались для клонирования, выделены полужирным шрифтом.

На Фигуре 4 представлена плазмида 660, использующаяся для экспрессии НА дикого типа подтипа Н5 вируса гриппа А/Индонезия/5/05;

На Фигуре 5 представлена плазмида 680, использующаяся для негликозилированного мутированного НА подтипа Н5 вируса гриппа А/Индонезия/5/05;

На Фигуре 6 представлен титр антител против цельновирионной инактивированной вакцины после введения первой и второй дозы. Реактивность сывороток крыс, иммунизированных ВПЧ дикого типа или ВПЧ с тройной мутацией (негликозилированными ВПЧ), оценивалась нами после первой (14 дней) и второй иммунизации (35 дней). Иммунореактивность оценивалась по отношению к нескольким вирусам H5N1.

На Фигуре 7 представлены титры антител, ингибирующих гемагглютинин, после введения первой и второй дозы. Титры HI-антител у крыс, иммунизированных ВПЧ дикого типа или ВПЧ с тройной мутацией (негликозилированными ВПЧ), оценивалась нами через 14 дней после первой иммунизации (14-й день) и второй иммунизации (35-й день). Иммунореактивность оценивалась по отношению к нескольким вирусам H5N1 и одному вирусу H1N1.

На Фигуре 8 представлена последовательность НА0 вируса гриппа;

На Фигуре 9 представлена последовательность белка НА подтипа Н2 вируса гриппа;

На Фигуре 10 представлена последовательность белка НА подтипа Н3 вируса гриппа;

На Фигуре 11 представлена последовательность белка НА подтипа Н4 вируса гриппа;

На Фигуре 12 представлена последовательность белка НА подтипа Н5 вируса гриппа;

На Фигуре 13 представлена последовательность белка НА подтипа Н6 вируса гриппа;

На Фигуре 14 представлена последовательность белка НА подтипа Н7 вируса гриппа;

На Фигуре 15 представлена последовательность белка НА подтипа Н8 вируса гриппа;

На Фигуре 16 представлена последовательность белка НА подтипа Н9 вируса гриппа;

На Фигуре 17 представлена последовательность белка НА подтипа Н10 вируса гриппа;

На Фигуре 18 представлена последовательность белка НА подтипа Н11 вируса гриппа;

На Фигуре 19 представлена последовательность белка НА подтипа H12 вируса гриппа;

На Фигуре 20 представлена последовательность белка НА подтипа Н13 вируса гриппа;

На Фигуре 21 представлена последовательность белка НА подтипа H14 вируса гриппа;

На Фигуре 22 представлена последовательность белка НА подтипа H15 вируса гриппа;

На Фигуре 23 представлена последовательность белка НА подтипа H16 вируса гриппа;

На Фигуре 24 представлена последовательность вектора экспрессии 660 pCAMBIA, содержащего полную последовательность Н5 дикого типа;

На Фигурах 25 A-J представлены последовательности праймеров, использованных для ПЦР-амплификации;

На Фигуре 26 представлена последовательность полученного фрагмента, содержащего всю кодирующую область белка Н5, в том числе нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом Hind III по направлению против хода транскрипции по отношению к начальному кодону ATG, и сайтом Sacl, расположенным по ходу транскрипции по отношению к терминальному кодону ТАА;

На Фигуре 27 представлена последовательность полученного фрагмента, содержащего всю кодирующую область белка Н5, модифицированного таким образом, что в молекуле все три сайта гликозилирования будут отсутствовать, в том числе нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом Hind III по направлению против хода транскрипции по отношению к начальному кодону ATG, и сайтом Sacl, расположенным по ходу транскрипции по отношению к терминальному кодону ТАА;

На Фигурах 28 A-D представлены последовательности праймеров, использованных для ПЦР-амплификации;

На Фигуре 29 представлена аминокислотная последовательность зрелого белка Н5 вируса гриппа штамма А/Вьетнам/1194/04;

На Фигурах 30 А-В представлены последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот зрелого белка НА и соответствующего гена вируса гриппа штамма В/Флорида/4/2006.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на получению вирусоподобных частиц (ВПЧ). В частности, настоящее изобретение посвящено получению вирусоподобных частиц, содержащих антигены вируса гриппа.

Ниже представлено описание отдельных вариантов осуществления изобретения.

1 - белок НА

Использующийся в настоящем описании термин «белок» означает последовательность аминокислот, связанных между собой пептидной связью, которая может формировать вторичную, третичную или четвертичную структуру и приобретать определенную морфологию. С другой стороны, в аналогичном контексте могут использоваться термины «полипептид», «пептид» или «фрагменты пептида».

Термин «домен гемагглютинина» означает пептид, включающий полипептид-предшественник НА0 или домены НА1 и НА2. Домен гемагглютинина не включает сигнальный пептид, трансмембранный домен или цитоплазматический хвост, которые входят в состав природного пептида.

В отношении вируса гриппа термин «гемагглютинин», или «НА», используемый в этом документе, означает гликопротеин, располагающийся на поверхности вирусных частиц. НА - это гомотримерный мембранный гликопротеин I типа, как правило, включающий в свою структуру сигнальный пептид, домен НА1 и домен НА2, состоящий из мембранного якорного сайта на С-конце и небольшого цитоплазматического хвоста (Фигура 1 В). Последовательность нуклеотидов, кодирующая НА, хорошо известна и открыта для общего доступа (например, см. базу данных BioDefence (вирус гриппа; см. URL: biohealthbase.org) или базу данных Национального центра информации в сфере биотехнологии (см. URL: ncbi.nlm.nih. gov); ссылки на обе базы данных включены в данный документ.

Информация о структуре белков НА вируса гриппа

В мономере НА можно выделить 2 функциональных домена: глобулярную головку и стволовой домен. Соответствующие этим структурным доменам участки первичной последовательности показаны на Фигурах 1В и 2. Стволовой домен обусловливает инвази