Способы культивирования клеток, размножения и очистки вирусов

Способы культивирования клеток, размножения и очистки вирусов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. Заявление в отношении прав на изобретение, сделанное в соответствии с финансируемым из бюджета исследованием и разработкой

Одно или более изобретений, описанные в данной заявке, были сделаны при поддержке правительства в соответствии с Договором № HHS 0100200600010 С, выполняемым по заказу Министерства здравоохранения и социального обеспечения США. В соответствии с этим правительство может иметь некоторые права на эти изобретения.

2. Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новой среде для культивирования клеток и способам культивирования клеток, в частности неканцерогенных MDCK клеток. Настоящее изобретение также относится к способам получения вирусов (например, гриппа, RSV) в культуре клеток. Настоящее изобретение также обеспечивает способы для очистки ассоциированных с клетками вирусов из адгезивных клеток, выращиваемых в биореакторе для производства вакцин.

3. Предпосылки создания изобретения

Вакцинация представляет собой наиболее важное мероприятие системы общественного здравоохранения для предотвращения заболевания, вызванного вирусной инфекцией. Эффективное применение вакцин является зависимым от обеспечения возможности быстро получать большие количества вакцинного материала (например, вируса) из стабильного и легко культивируемого источника. Быстрая разработка вакцин и их избыточная доступность являются критическими в борьбе со многими заболеваниями человека и животных. Задержка в выпуске вакцин и их недостаточное количество может вызвать проблемы, которые приводят к вспышкам заболевания. Например, недавние исследования дают возможность предположить, что существует причина для беспокойства в отношении длительного срока, необходимого для получения вакцин против пандемического гриппа. Смотри, например, Wood, J.М., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356: 1953. В соответствие с этим современные усилия по производству вакцин были сфокусированы на выращивании вирусов для производства вакцин в культуре клеток.

3.1 Вирус гриппа

В частности, применение клеток Мадин-Дарби почек собаки (MDCK) поддерживались рядом групп. Смотри, например, US 6,455,298; US 2005/0118140; US 2005/0118698; US 6,825,306; WO 2005/113758; и Radaeva, I.F., и др. Vopr. Virusol. (2005) 50: 43-6. Однако многие из существующих MDCK клеток страдают от одного или более недостатков, включая канцерогенность, требование наличия сыворотки животных в культуре клеток и низкий выход вирусов гриппа, приемлемых для использования в вакцинах. Кроме того, многие процессы, происходящие в культурах клеток, которые были разработаны для получения вакцинного материала из этих линий клеток, часто требуют многочисленных манипуляций, включая этапы замены среды и применение больших количеств вируса для инокуляции, В дополнение, по причине постоянного возникновения (или повторного возникновения) различных штаммов гриппа, новые вакцины гриппа получают в каждое время года на основе циркулирующих штаммов вируса гриппа. К сожалению, некоторые вакцинные штаммы вируса гриппа являются весьма сложными для выращивания с высоким выходом. Выход материала из каждой партии культуры клеток не только определяет продукционную способность, но также оказывает влияние на стоимость вырабатываемого продукта, поэтому повышение выхода вируса (то есть максимального титра вируса) является желательным.

Недавно были разработаны новые, свободные от сыворотки среды и неканцерогенные линии клеток, которые позволяют выращивать вакцинный штамм с получением очень высоких титров, а также процессы для получения вирусного материала в однократно используемых биореакторах (смотри, US 2006/0188977; и USSN 11/855,769, поданная 14 сентября 2007 года). Настоящее изобретение расширяет эту работу и обеспечивает новую среду для культивирования клеток, высоковопроизводимые, эффективные, масштабируемые процессы для получения больших количеств вакцинного материала в биореакторах из MDCK клеток, в частности, неканцерогенных линий клеток, без необходимости замены среды, а также мощные процессы глубокой очистки для получения высокоочищенной живой аттенуированной вакцины. Способы, которые обеспечиваются с помощью настоящего изобретения, являются мощными, требуют минимальных манипуляций и являются эффективными по затратам.

3.2 Респираторно-синцитиальный вирус (RSV)

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) человека представляет собой основную причину тяжелой инфекции нижних дыхательных путей (LRTI) у младенцев и детей младшего возраста и является ответственным за значительную заболеваемость и смертность. В общей сложности 18 миллионов человек инфицируется ежегодно в семи главных рынках (США, Япония, Франция, Германия, Италия, Испания, Объединенное Королевство), включая три миллиона взрослых людей и почти 400000 недоношенных детей. По оценкам, ежегодно только на США приходится 70000-125000 госпитализаций, которые приписываются RSV LRTI. В человеческой популяции присутствуют две антигенно различные подгруппы RSV А и В. RSV также признается важным агентом инфекции у взрослых с нарушенным иммунитетом и у пожилых людей. Благодаря неполной устойчивости к RSV повторная инфекция индуцируется природной инфекцией, RSV может инфицировать человека многократно на протяжении детства и всей жизни. Цель иммунопрофилактики RSV заключается в том, чтобы индуцировать достаточную устойчивость и предотвратить серьезное заболевание, которое может быть ассоциировано с RSV инфекцией. Современная стратегия для разработки RSV вакцин принципиально, так или иначе, связана с введение очищенного вирусного антигена и живого аттенуированного RSV для интраназального введения. Однако на сегодняшний день не существует одобренных вакцин для RSV.

Вирусная геномная РНК не является инфекционной, как РНК, лишенная оболочки. РНК геном RSV является заключенным в плотную капсидную оболочку с основным нуклеокапсидным (N) белком и ассоциируется с фосфопротеином (Р) и большой (L) субъединицей полимеразы. Эти белки формируют нуклеопротеиновое ядро, которое признается в качестве минимальной единицы инфективности (Brown и др., 1967, J.Virol. 1:368-373).

Несмотря на десятилетия исследований не было разработано никакой коммерчески доступной, безопасной и эффективной RSV вакцины для предотвращения тяжелой заболеваемости и смертности, ассоциированной с RSV инфекцией. Вакцина на основе инактивированного в формалине вируса оказалась неудачной в обеспечении защиты против RSV инфекции и фактически приводила к ухудшенным симптомам при последующей инфекция с помощью вируса дикого типа у младенцев (Kapikian и др., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-21; Chin и др., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 449-63). Поэтому усилия были сфокусированы на разработке живых аттенуированных мутантов, полученных с помощью рекомбинантных способов, химического мутагенеза и низкотемпературного пассирования RSV дикого типа для чувствительных к температуре мутантов (Gharpure и др., 1969, J. Virol. 3: 414-21; Crowe и др., 1994, Vaccine 12: 691-9). Однако очистка живого аттенуированного вируса от его ассоциированных с клеткой белков, для получения материала, который будет соответствовать нормативным рекомендациям для эффективного профилактического лечения RSV инфекции, была показана как труднодостижимая на сегодняшний момент.

Подобно вирусу гриппа, RSV выращивают в стабильной клеточной линии, в которой вирус является тесно ассоциированным с хозяйской клеткой, что делает сложным очистку вируса от ассоциированных с клеткой белков при поддержании минимального значения инфективности. Дополнительную сложность составляет то, что RSV является нестабильным (например, чувствительным к сдвигу). Эти факторы, а именно то что вирус является в основном ассоциированным с хозяйской клеткой и нестабильным, сделали сложной очистку вируса из экстрактов хозяйских клеток (например, ДНК и белков), приводя при этом к получению клинически приемлемой иммуногенной композиции, включающей живой аттенуированный вирус. Именно эти причины, частично, определяют то, почему нет коммерчески доступных вакцин для RSV. В соответствии с этим существует потребность в процессе очистки, который может использоваться для очистки RSV и других ассоциированных с клеткой вирусов для получения и рецептирования иммуногенных композиций.

4. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает свободную от сыворотки культуральную среду и высоковоспроизводимые, эффективные и масштабируемые процессы для получения большого количества вакцинного материала в биореакторах, включая биореакторы однократного использования и стандартные реакторы многократного применения (например, биореакторы из нержавеющей стали и стеклянные сосуды).

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает обогащенную свободную от сыворотки культуральную среду, которая поддерживает пролиферацию MDCK клеток (например, неканцерогенных MDCK клеток) до получения высокой плотности клеток и устраняет необходимость в этапе замены среды для получения высоких титров вируса.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает способы для репликации вирусов гриппа (например, адаптированных к холоду и/или чувствительных к температуре, и/или аттенуированных) в MDCK клетках для получения высокого титра, например, log₁₀ ТСID₅₀/мл и/или log₁₀ FFU/мл, по крайней мере, приблизительно 7,4, по крайней мере, приблизительно 7,6, или по крайней мере, приблизительно 7,8, или по крайней мере, приблизительно 8,0, или по крайней мере, приблизительно 9,0, или по крайней мере, приблизительно 10,0 без этапа замены среды перед инфицированием.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает улучшенные способы для размножения неканцерогенньгх клеток на микроносителях, включая способы переноса с гранулы на гранулу. В другом аспекте обогащенная свободная от сыворотки культуральная среда в соответствии с изобретением поддерживает неканцерогенные характеристики неканцерогенных MDCK клеток, используемых для исходной инокуляции. В других аспектах обогащенная свободная от сыворотки культуральная среда в соответствии с изобретением используется для адаптации и поддержания неканцерогенных MDCK линий клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы для очистки живых ассоциированных с клеткой вирусов (например, вируса гриппа, RSV) из адгезивных клеток, выращенных в культуре клеток (например, культуре клеток MDCK, Vero), что обеспечивает средний выход вирусов, по крайней мере, 30%, где очищенные вирусы включают менее чем 0,1 нг HCD, и менее чем 0,3 мкг НСР, и менее чем 0,0050 нг неспецифической нуклеазы на 7,0±0,5 log₁₀ БОЕ вируса.

5. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 представляет собой кривую плотности жизнеспособных клеток (VCD) и жизнеспособности клеток (V%) в 4×2 л биореакторах от дня 0 до дня 4 культивирования. Культивирование в биореакторах осуществляли при использовании условий посевного реактора (SR), подробно приведенных в 0.2 dps данные для SR 4 недоступны.

Фигура 2 показывает фотографии (взятые при 10Х увеличении) проб, взятых при среднем времени отбора проб между 0 и 40 мин для 3×2 л посевных реакторов (SR) для экспериментов 1, 3 и 4 во время В2В трипсинизации. Трипсинизацию осуществляли в биореакторах в соответствии с прописью переноса с гранулы на гранулу.

Фигура 3 представляет собой кривую плотности жизнеспособных клеток (VCD) и жизнеспособности клеток (V%) в 12×2 л биореакторах заключительного получения (FPR). Биореакторы эксперимента 3 (FPR3.X.X) инфицировали при 5 dps (~120 hps), a такие других экспериментов инфицировали при 4 dps. VCD после инфицирования и данные для эксперимента 4 недоступны.

Фигура 4 показывает фотографии (взятые при 10Х увеличении) проб, взятых при 4 dps для 12×2 л реакторов заключительного получения для всех экспериментов.

Фигура 5 показывает фотографии (взятые при 10Х увеличении) проб, взятых при 3 dpi для 9×2 л реакторов заключительного получения (FPR) для всех экспериментов.

Фигура 6 представляет собой кривую титров вируса са А/Уругвай (A/U), са А/Южная Дакота (A/S) и са В/Флорида (B/F) в течение периода времени для клеток, которые исходно выращивали в 4×2 л посевных реакторах, а затем подвергали культивированию, после чего инфицировали 12×2 л реакторы заключительного получения (FPR) для всех экспериментов. Примечания: каждая точка данных представляет собой среднее значение повторностей анализа. Титры вируса, ниже границы определения (<6,4 log₁₀ БОЕ/мл или <2,4 log₁₀ БОЕ/мл при разведении), не регистрировали.

Фигура 7 показывает профили продукции вируса в течение периода времени для штамма, полученного при использовании процесса 67% замены среды (67% MX) против процесса при отсутствии замены среды (0% MX). Кривые для штаммов са А/Висконсин/67/05 и са А/Уругвай показаны на 8А, левая и правая панели, соответственно, кривые для са А/Южная Дакота и са В/Флорида показаны на 8В, левая и правая панели, соответственно.

Фигура 8 представляет схему технологического процесса на основе переноса с гранулы на гранулу. Процесс, который отражен на Панеле А, использует два этапа промывки, на каждом из которых применяют забуференный солевой раствор (DPBS), включающий хелатирующий агент (EDTA) и протеазу (TrypLE™) при заключительной концентрации почти 0,05Х, что вызывает отделение клеток в течение ~30 минут. Процесс, который отражен на Панеле В, использует 2-3 этапа промывания, на которых применяют забуференный солевой раствор (DPBS), после чего осуществляют инкубацию с хелатирующим агентом (ЭДТА) при заключительной концентрации ~0,5 мМ, что вызывает отделение клеток в течение ~60 минут при отсутствии какой-либо протеазы.

Фигура 9 представляет чертежи фильтра и установок для разлива, которые используются для фильтрования прямого потока (DFF1), установки для фильтрования (Панель А, верхняя часть), соединительное оборудование для разлива GE Healthcare Uniflux (Панель А, нижняя часть), соединительное оборудование для разлива GE Healthcare AKTAprocess (Панель В, верхняя часть), и фильтровальной установки для фильтрования прямого потока 2 (DIFF2) (Панель В, нижняя часть).

Фигура 10 представляет схему процесса начальной очистка 1а параллельно с улучшенным процессом очистка 1b в Панели А. Дополнительные модификации конкретизируются в схеме, представленной на Панели В. Детали каждого процесса обеспечиваются в Примерах 3 и 4.

Фигура 11 представляет кривую записи течения TFF1 прогона #8.

Фигура 12 представляет характеристики давления потока колонки BPG 100 и BPG 200 CS.

Фигура 13 представляет хроматограмму элюирования колонки CS прогона #9.

Фигура 14 представляет кривую записи потока прогона #8 TFF2 8XDF процесса.

Фигура 15 представляет кривую жизнеспособных клеток на мл (заштрихованные символы/непрерывные линии) и процент жизнеспособности (незаштрихованные символы/пунктирные линии) в течение приблизительно 432 часов культивирования для клеток, серийно разведенных и размноженных при отсутствии протеазы (ромбы и квадраты), клетки серийно разводили и размножали при использовании смеси ЭДТА/протеаза (треугольники), и клетки независимо разводили и размножали при использовании способов на основе протеазы (кружочки).

Фигура 16 представляет кривые титров штаммов са A/Висконсин/67/07 (верхняя часть), са В/Малайзия/2506/04 (нижняя часть), полученных из каждого пассажа клеток, которые серийно разводили и размножали при отсутствии протеазы (ромбы и квадраты), клетки серийно разводили и размножали при использовании смеси ЭДТА/протеаза (треугольники), клетки также независимо разводили и размножали при использовании стандартных способов на основе протеазы (незаштрихованные квадраты). Кривые показывают, что титры, по крайней мере, 8,0 log₁₀ БОЕ/мл получали при использовании клеток, разведенных и размноженных с использованием процесса с отсутствием протеазы и с применением смеси ЭДТА/протеаза.

Фигура 17 представляет кривые жизнеспособных клеток на мл (заштрихованные символы/непрерывные линии) и процент жизнеспособности (незаштрихованные символы/пунктирные линии) в течение трех продукционных экспериментальных прогонов (Панель А и Панель В, верхняя часть). В каждую кривую включен(ы) посевной реактор(ы), экспериментальные прогоны продукционного(ых) реактора(ов) при использовании ATF и продукционный(ые) прогон(ы) без применения ATF. На Панеле В представлена (нижняя часть) кривая титров штамма са В/Малайзия/2506/04, полученная при двух продукционных экспериментальных прогонах, которая показывает, что титры являются сравнимыми с такими для прогонов, осуществленных при использовании ATF и без ATF.

Фигура 18 представляет фотографии жидкостей, удаленных из биореакторов при использовании ATF процесса, демонстрирующие, что они являются свободными от микроносителей. Левая панель показывает микроноситель, удаляемый промыванием при использовании ATF во время стерилизации микроносителя, правая панель показывает удаленную среду при использовании ATF во время этапа замены 66% среды в MDCK культуре клеток.

Фигура 19 представляет элютивные хроматограммы прогонов колонки с исследуемыми смолами А-D с элюированием при использовании 1 М NaCl (панели А-D, соответственно). Эти хроматограммы показывают, что исследуемые смолы А и В оказались такими, которые демонстрируют отдельные множественные пики элюирования, имеющие меньший ранний пик (смотри стрелку на панели В), в то время как исследуемые смолы С и D продемонстрировали единственный пик с "плечами" пика и гетерогенные характеристики (смотри стрелку на панели D).

Фигура 20 представляет элютивные хроматограммы прогонов колонки с исследуемыми смолами С и D с элюированием при использовании 1 2 М NaCl (панели А и В, соответственно), которые демонстрируют, что пик элюирования заостряется при использовании элюирования при использовании 2М NaCl.

Фигура 21 представляет элютивные хроматограммы прогонов колонки с исследуемой смолой С для штаммов са А/Висконсин, са А/Соломоновы острова и са В/Малайзия, Панели А, В, и С, соответственно, показывающие, что профили пиков являются подобными и однородньми.

Фигура 22 представляет элютивные хроматограммы прогонов колонки. Панели А и В показывают элюирование для штаммов са А/Висконсин и са В/Малайзия, соответственно, для колонки с исследуемой смолой D, показывающие, что профили пиков являются подобными и однородными. Панель С показывает хроматограммы пика элюирования исследуемой смолы D при ХК-50 размере колонки.

Фигура 23 представляет рисунки культур для клеток А) необработанных клеток и клеток, обработанных в течение 60 минут с помощью В) 0,5 мМ ЭДТА, С) 1 мМ ЭДТА, D) 2 мМ ЭДТА, Е) 5 мМ ЭДТА и F) 10 мМ ЭДТА.

Фигура 24 представляет рисунки культур клеток для клеток, предварительно обработанных с помощью 2 мМ ЭДТА, после чего осуществляли обработку с помощью 0.0125Х TrypLE (ПанелиА и D), 0,025Х TrypLE (Панели В и Е) и 0.05Х TrypLE (Панели С и F). Фотографии сделаны через 0 минут после прибавления TrypLE (Панели А, В, и С) и вновь через 60 минут после прибавления TrypLE (Панели D, Е и F).

6. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение обеспечивает высоковоспроизводимые, эффективные и масштабируемые процессы для получения больших количеств вируса (например, вируса гриппа или RSV) или вирусного антигена для профилактического, диагностического, иммунотерапевтического или терапевтического применения в биореакторах с адгезивными клетками (например, MDCK клетками, в частности, неканцерогенными линиями клеток или клетками Vero). В частности, настоящее изобретение обеспечивает мощные способы для получения адаптированных к холоду и/или чувствительных к температуре, и/или аттенуированных вирусов гриппа или респираторно-синцитиального вируса, для получения высокого титра, которые не требуют какой-либо замены среды.

В дополнение, настоящее изобретение обеспечивает культуральную среду, которая поддерживает культивирование MDCK клеток (например, неканцерогенных MDCK клеток) и поддерживает репликацию вируса, включая, но без ограничения, вирус гриппа (например, адаптированный к холоду и/или чувствительный к температуре, и/или аттенуированный вирус гриппа), для получения высокого титра, что не требует какой-либо замены среды.

В дополнение, настоящее изобретение также обеспечивает способы получения вакцинного материала (например, вируса гриппа) из MDCK клеток (например, неканцерогенных MDCK клеток) и способы предотвращения гриппозной инфекции, использующие вакцинные материалы, полученные в MDCK клетках. Любой ассоциированный с клеткой вирус (например, вирус гриппа и RSV) может быть очищен с помощью процесса, описанного в данной заявке, и/или может содержаться в иммуногенной композиции, описанной в данной заявке. Как используется в данной заявке, термин "ассоциированный с клеткой вирус" относится к вирусу, для которого приблизительно 60% титра вируса или более является ассоциированными с адгезивными инфицированными вирусом клетками, как определяется с помощью любой методики, известной специалисту в данной области техники. Способы в соответствии с изобретением являются особенно полезными для получения адаптированных к холоду/чувствительных к температуре/аттенуированных (ca/ts/att) штаммов вируса гриппа (например, таких в FluMist^®) и RSV (например, rА2ср248/404/1030ΔSH).

Вирусы, которые могут выращиваться в неканцерогенных MDCK клетках и/или клетках Vero, включают, но без ограничения вирусы с негативной цепочкой РНК, включая, но без ограничения, вирусы гриппа, RSV, вирусы парагриппа 1, 2 и 3, и метапневмовирус человека, а также другие вирусы, включая ДНК-содержащие вирусы, ретровирусы, вирусы с позитивной цепочкой РНК, вирусы с негативной цепочкой РНК, вирусы с двухцепочечной РНК, включая, но без ограничения, паповавирус, вирус везикулярного стоматита, вирус осповакцины, вирус Коксаки, реовирус, парвовирус, аденовирус, вирус полиомиелита, вирус коревой краснухи, вирус бешенства и вирус герпеса.

6.1 Определения

Канцерогенность, как используется в данной заявке, имеет обычное значение, которое приписывается этому термину квалифицированным специалистом в данной области техники. Канцерогенность в одном воплощении определяется с помощью модели взрослых бестимусных мышей с мутацией nude (например, Stiles и др., 1976, Cancer Res, 36: 1353, и Пример 5, приведенный ниже). Канцерогенность может также подвергаться исследованию с помощью других анализов, например, путем инъекции в куриные эмбрионы и/или местного применения хорионаллантоиса (Leighton и др., 1970, Cancer, 26: 1024).

Термин "рекомбинантный" указывает на то, что материал (например, нуклеиновая кислота или белок) были изменены искусственным или синтетическим (неприродным) путем с помощью вмешательства человека. Изменения могут осуществляться на материале в его природном окружении или состоянии или извлеченном из него. В частности, когда упоминается вирус, например вирус гриппа, то вирус является рекомбинантным, когда его получают путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный вирус может дополнительно содержать одну или более мутаций, введенных в его геном. Рекомбинантный вирус может также представлять собой реассортантный вирус, когда он включает компоненты, имеющие происхождение более чем от одного родительского вирусного штамма.

Термин "реассортант," когда относится к вирусу, указывает на то, что вирус включает генетические и/или полипептидные компоненты, имеющие происхождение от более чем одного исходного вирусного штамма или источника. Например, 7:1 реассортант включает 7 вирусных геномных сегментов (или генных сегментов), которые имеют происхождение от первого родительского вируса, и единственный комплементарный вирусный геномный сегмент, например кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу, из второго родительского вируса. 6:2 реассортант включает 6 геномных сегментов, наиболее часто 6 внутренних генов из первого родительского вируса, и два комплементарных сегмента, например гемагглютинин и нейраминидазу, из другого родительского вируса.

Термин "приблизительно," как используется в данной заявке, если не указано иное, относится к значению, которое не более чем на 10% выше или ниже приведенного значения. Например, термин "приблизительно 5 мкг/кг" означает интервал от 4,5 мкг/кг до 5,5 мкг/кг. В качестве другого примера "приблизительно 1 час" означает интервал от 54 минут до 66 минут.

Термины "чувствительный к температуре," "адаптированный к холоду" и "аттенуированный" являются хорошо известными в уровне техники. Например, термин "чувствительный к температуре" ("ts") указывает на то, что вирус демонстрирует 100-кратное или более снижение титра при более высокой температуре, например при 39°С по отношению к более низкой температуре, например 33°С для штамма вируса гриппа А, и что вирус демонстрирует 100-кратное или более снижение титра при более высокой температуре, например при 37°С по отношению к более низкой температуре, например 33°С для штамма вируса гриппа В. Например, термин "адаптированный к холоду" ("са") указывает на то, что вирус демонстрирует более высокую скорость роста при более низкой температуре, например при 25°С в пределах 100-кратного от скорости своего роста при более высокой температуре, например, 33°С. Например, термин "аттенуированный" ("att") указывает на то, что вирус реплицируется в верхних дыхательных путях хорька, но не определяется в ткани легких и не вызывает заболевания, подобного гриппу у животного. При этом является понятным, что вирусы с промежуточными фенотипами, то есть вирусы, демонстрирующие снижение титра менее чем 100-кратное при 39°С (для штаммов вируса А) или 37°С (для штаммов вируса В), демонстрирующие рост при 25°С, который является большим чем 100-кратный от их роста при 33°С (например, в пределах 200-кратного, 500-кратного, 1000-кратного, 10,000-кратного) и/или демонстрирующие сниженный рост в легких по сравнению с ростом в верхних дыхательных путях хорька (то есть частично аттенуированный) и/или уменьшенное подобное гриппу заболевание у животного, также являются полезными вирусами, которые охватываются данным изобретением. Рост свидетельствует о качестве вируса, как определяется титром, размером бляшек или морфологией, плотностью частиц или другими характеристиками, известными квалифицированному специалисту в данной области техники.

6.2 Клетки

Ассоциированные с клеткой вирусы, описанные в данной заявке, могут размножаться в любой адгезивной клетке, что позволяет выращивать вирусы до титров, которые дают возможность использовать эти вирусы. В одном воплощении адгезивные клетки позволяют выращивать ассоциированные с клеткой вирусы до титров, сравнимых с теми, что определяются для соответствующих вирусов дикого типа. В специфическом воплощении ассоциированные с клеткой вирусы, описанные в данной заявке, размножают в клетках, которые являются чувствительными к вирусным инфекциям.

В одном воплощении ассоциированные с клеткой вирусы, описанные в данной заявке, размножают в клетках млекопитающих. Типичные клетки млекопитающих, которые являются ассоциированными с вирусами, описанными в данной заявке, могут размножаться, но без ограничения, в клетках Vero, СНО клетках, Нер-2 клетках, МВСК клетках, MDCK клетках, MRC-5 клетках, HeLa клетках и LLC-MK2 клетках. В специфическом воплощении ассоциированные с клеткой вирусы, описанные в данной заявке, включая респираторно синцитиальные вирусы, размножают в клетках Vero. В другом специфическом воплощении ассоциированные с клеткой вирусы, включая вирус гриппа, размножают MDCK клетках.

6.2.1 MDCK клетки

MDCK клетки являются известными для обеспечения изоляции и репликации и множества вирусов, включая, но без ограничения, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы и флавовирусы. В частности, MDCK клетки широко используются для получения вируса гриппа. Однако, как отмечалось выше, некоторые линии MDCK клеток являются канцерогенными. С учетом того, что канцерогенность представляет регуляторный интерес, настоящее изобретение обеспечивает способы для размножения неканцерогенных MDCK клеток и их применение для получения вирусов гриппа. В соответствии с этим в одном воплощении способы в соответствии с изобретением используют неканцерогенные MDCK клетки. В другом воплощении способ в соответствии с изобретением использует MDCK клетки вне зависимости от канцерогенности.

Неканцерогенные линии MDCK клеток, которые могут использоваться в способах в соответствии с изобретением, включают, но без ограничения, те, которые были задепонированы в Американской коллекции типовых культур (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209) 5 января 2005 года и им были присвоены номера депонирования АТСС РТА-6500 и РТА-6503 (обозначаются как MDCK-S и MDCK-SF103 соответственно); те, которые были задепонированы 5 октября 2006 года и им были присвоены номера депонирования АТСС РТА-7909 и РТА-7910 (обозначаются как субклоны 1-А и 1-В соответственно).

Другие MDCK клетки, которые могут использоваться, включают, но без ограничения, те, которые были задепонированы в Американской коллекции типовых культур и им были присвоены номера депонирования АТСС РТА-6501 и РТА-6502 (обозначаются как MDCK-SF101 и MDCK-SF102 соответственно); те, которым были присвоены номера депонирования АТСС CRL-12042 (обозначаются как MDCK, 5F1); те, которым были присвоены номера депонирования АТСС CCL34; CRL-2286; и CRL-2285.

В специфическом воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, представляют собой неканцерогенные в модели взрослых бестимусных мышей с мутацией по гену nude (смотри, Stiles и др.). В другом специфическом воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, являются неканцерогенными, когда вводятся в куриный эмбрион и/или местно применяются к хорионаллантоису (смотри, Leighton и др.. Id). Еще в одном воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, являются неканцерогенными в модели взрослых бестимусных мышей с мутацией по гену nude, но не тогда, когда вводятся в куриный эмбрион и/или местно применяются к хорионаллантоису. Еще в одном воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, являются неканцерогенными в модели взрослых бестимусных мышей с мутацией по гену nude и когда вводятся в куриный эмбрион и/или местно применяются к хорионаллантоису. Еще в одном воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, являются неканцерогенными после, по крайней мере, 20 пассажей, или после, по крайней мере, 30 пассажей, или после, по крайней мере, 40 пассажей, или после, по крайней мере, 50 пассажей, или после по крайней мере 60 пассажей, или после по крайней мере, 70 пассажей, или после, по крайней мере, 80 пассажей, или после, по крайней мере, 90 пассажей, или после, по крайней мере, 100 пассажей. Еще в других воплощениях неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, являются неканцерогенными после, по крайней мере, 20 пассажей, или после, по крайней мере, 30 пассажей, или после, по крайней мере, 40 пассажей, или после, по крайней мере, 50 пассажей, или после, по крайней мере, 60 пассажей, или после, по крайней мере, 70 пассажей, или после, по крайней мере, 80 пассажей, или после, по крайней мере, 90 пассажей, или после, по крайней мере, 100 пассажей в свободной от сыворотки среде в соответствии с изобретением (например, MediV SFM 105 + ТЕ, MediV SFM 109 и MediV SFM 110).

Канцерогенность может быть количественно оценена различными путями, известными специалисту в данной области техники. Один способ, который традиционно используется, представляет собой определение "TD₅₀" значения, которое определяют как количество клеток, которое требуется для индукции опухолей у 50% исследуемых животных (смотри, например Hill R. The TD₅₀ assay for tumor cells. в: Potten C, Hendry J. ред. Cell clones. London: Churchill Livingstone; 1985. стр.223). В одном воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, имеют значение TD₅₀ от приблизительно 10¹⁰ до приблизительно 10¹, или от приблизительно 10⁸ до приблизительно 10³, или от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10⁴. В специфическом воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, имеют значение TD₅₀ более чем приблизительно 10¹⁰, или более чем приблизительно 10⁹, или более чем приблизительно 10⁸, или более чем приблизительно 10⁷, или более чем приблизительно 10⁶, или более чем приблизительно 10⁵, или более чем приблизительно 10⁴, или более чем приблизительно 10³, или более чем приблизительно 10², или более чем приблизительно 10¹. В специфическом воплощении неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способах в соответствии с изобретением, имеют значение TD₅₀ 10⁷ или более.

Также предполагается, что неканцерогенные MDCK клетки, используемые в способе в соответствии с изобретением, являются также неонкогенными. Способы для определения, являются ли клетки онкогенными, обычно вовлекает инокуляцию лизатов клеток и/или ДНК в новорожденных грызунов и оценку любого образования опухоли в течение периода времени (смотри, например, Nowinski и Hays, 1978, J. ViroL, 27: 13-8; Peeper, и др., 2002, Nat Cell Biol., 4: 148-53; Code of Federal Regulation (CFR), "Oncogenicity", Издание 40, том 8, глава 1, раздел 798.330, стр.160-164). Например, клеточные лизаты и/или ДНК, содержащие, по крайней мере, 10⁷ клеточных эквивалентов вводят новорожденным грызунам (например, хомякам, бестимусным мышам с мутацией по гену nude, крысам) типично в возрасте менее 4 дней, которых подвергают наблюдению в течение пяти месяцев или более. Анализы на онкогенность обычно осуществляют с помощью коммерческих систем для тестирования (например, BioReliance, смотри Прописи #001031 и #001030). В одном воплощении клеточные лизаты и/или ДНК, содержащие, по крайней мере, 10⁵, или по крайней мере, 10⁶, или, по крайней мере, 10⁷ неканцерогенных MDCK клеток, используемых в способах в соответствии с изобретением, не индуцируют образования опухоли в течение 2 месяцев, или 3 месяцев, или 4 месяцев, или 5 месяцев, или 6 месяцев, или дольше, когда вводиться новорожденным грызунам. В другом воплощении 0,01 мг, или 0,02 мг, или 0,03 мг, или 0,04 мг, или 0,05 мг, или 0,06 мг, или 0,07 мг, или 0,08 мг, или 0,09 мг, или 0,10 мг, или более ДНК из неканцерогенных MDCK клеток, используемых в способах в соответствии с изобретением, не индуцируют образования опухоли в течение 2 месяцев, или 3 месяцев, или 4 месяцев, или 5 месяцев, или 6 месяцев, или дольше, когда вводятся новорожденным грызунам.

Предполагается, что MDCK клетки (например, неканцерогенные MDCK клетки) используемые в способах в соответствии с изобретением, поддерживают репликацию вирусов включая, но без ограничения, ортомиксовирусы (включая штаммы вируса гриппа А и/или В), парамиксовирусы (включая RSV А и/или В, вирус метапневмонии человека и парагриппа 1, 2 и/или 3), рабдовирусы и флавовирусы.

В специфическом воплощении MDCK клетки (например, неканцерогенные MDCK клетки), используемые в способах в соответствии с изобретением, поддерживают репликацию адаптированных к холоду, чувствительных к температуре, аттенуированных вирусов гриппа, таких как те, что обнаружены, например, в FluMist^® (Belshe и др., 1998, N Engi J Med 338: 1405; Nichol и др., 1999, JAMA 282: 137; Jackson и др., 1999, Vaccine, 17: 1905) и/или реассортантных вирусов, включающих скелет (например, остаточные генные сегменты) этих вирусов или включающих скелет (или один или более сегмент(ов)) РНК вируса гриппа, имеющие одну или более из следующих характеристик: адаптированный к холоду, аттенуированный и чувствительный к температуре.

Одно из указаний на способность клетки поддерживать вирусную репликацию представляет собой выход инфекционного вируса, полученного из инфицированной культуры клеток. Выход вируса может определяться с помощью многочисленных анализов, предназначенных для измерения вирусной инфекции и/или роста. Например, выход вируса может быть количественно оценен с помощью определения концентрации вируса, присутствующего в образце в соответствии с анализом средней инфекционной дозы для тканевой культуры (TCID₅₀), которая измеряется инфекционными вирионами, анализа на основе флуоресцентного анализа бляшкообразования (FFA), который определяет вирусные антигены в инфицированных клетках в монослое культуры клеток (смотри, например, US 7,262,045). TCID₅₀ значения часто выражают как log₁₀ ТСID₅₀/мл, а FFA значения часто выражают как log₁₀ БОЕ/мл (флуоресцентных бляшкообразующих единиц/мл). Способы, полезные для получения вирусов гриппа, включают, но без огра