Новый птичий астровирус

Новый птичий астровирус

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области ветеринарии, вирусологии и иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к новому птичьему астровирусу; к антителам и их фрагментам, направленным против нового птичьего астровируса; к антигенным препаратам, белкам и ДНК-молекулам нового птичьего астровируса; к вакцинам на основе нового птичьего астровируса или к их антигенным препаратам, белку или ДНК; к способам получения таких вакцин и к диагностическим наборам.

Астровирусы представляют собой небольшие круглые вирусы без оболочки, имеющие одноцепочечный РНК-геном с положительной смысловой цепью. Большинство астровирусов вызывают энтериты определенного типа, ассоциирующиеся с диареей, рвотой, малабсорбцией, общим недомоганием и задержкой роста. Инфицирование человека или животных этим вирусом может приводить к летальному исходу и плохо поддается лечению, например, у молодых и пожилых индивидуумов или у индивидуумов с ослабленной иммунной системой. См.: Matsui and Greenberg (in: Fields virology, 3^rd ed., 1996, ed.: B. Fields et al., ISBN: 781702534, chapter 26), и Moser and Schultz-Cherry (2005, Viral Immunology, vol. 18, p. 4-10).

Кроме того, тяжесть патологии, вызываемой астровирусом, может варьироваться в зависимости от вирулентности самих астровирусов различных типов или штаммов. Поэтому, существует мнение, что некоторые астровирусы действуют как вторичные патогены, которые сами по себе вызывают лишь субклиническое заболевание, а все клинические симптомы заболевания проявляются лишь в том случае, если другой причиной данного заболевания является какой-либо иной патоген.

Механизм, посредством которого развивается иммунитет против инфекции астровирусом, также пока еще точно не изучен, но, вероятно, существуют вирус-нейтрализующие антитела, которые, очевидно, играют определенную роль в осуществлении защиты и создании иммунологической памяти, однако, вероятно, они являются не только эффекторами иммунных ответов против астровирусной инфекции. См. M. Koci (2005, Viral Immunology, vol. 18, p. 11-16).

Астровирусы распространены по всему миру и были выделены у широкого ряда животных. В свою очередь, из видов астровирусов, инфицирующих некоторых животных-мишеней, описаны лишь несколько серотипов. Таксономически, семейство астровирусов подразделяется на два основных рода: астровирусы млекопитающих: мамастровирус, и птичьи астровирусы: авастровирусы. В настоящее время известно, что род авастровирусов включает официально известные виды: вирусы 1 и 2 птичьего нефрита (ANV1,2) (куриные), и астровирусы индейки 1 и 2 (TAstV1,2).

Некоторые другие птичьи астровирусы были выделены у уток, кур, страусов и индеек. Так, например, куриный астровирус 2 (CAstV2) был описан Baxendale и Mebatsion (2004, Avian pathology, vol. 33, p. 364-370; и в Международной патентной заявке WO 2004/027053), а Todd и др. описали вирус CAstV3 (WO 2007/077464), который является близкородственным вирусу CAstV2. Эти астровирусы пока еще не были официально классифицированы, как сообщалось в публикации Koci и Schulz-Cherry (2002, Avian Pathology vol. 31, p. 213-227).

Астровирусы обладают очень высокой стабильностью в условиях окружающей среды, например, они могут сохранять резистентность к общим липидам-растворителям и к детергентам, обладают устойчивостью к значениям рН широкого ряда и являются сравнительно термостабильными. Эти их свойства, наряду с высокой инфекционностью и способностью легко передаваться по фекально-пероральному пути передачи инфекции, позволяют объяснить, почему астровирусы или антитела против астровирусов могут присутствовать у такого большого числа людей и животных во всем мире.

В настоящее время, по мере получения новых экспериментальных данных, классификация этих небольших РНК-вирусов и названия, присваиваемые этим вирусам, часто меняются. Так, например, утиный астровирус (DAstV) раньше был классифицирован как пикорнавирус, а первоначально он назывался вирусом утиного гепатита типа II, так как такой вирус вызывает гепатит. Аналогичным образом, ANV1 раньше был описан как пикорнавирус, а в частности, энтеровирус, но затем он был переклассифицирован в авастровирус (Imada et al., 2000, J. of Virology, vol. 74, p. 8487-8493). ANV1 также называется куриным астровирусом 1 (CAstV1) и вызывает нефрит.

Переклассификация этих вирусов была произведена после получения новой информации о последовательности и организации генома этого вируса. В частности, что касается астровирусов, то было обнаружено, что информация о физических, электронно-микроскопических и биохимических свойствах данных вирусов в большинстве случаев является недостаточной для идентификации астровирусов от других так называемых «небольших круглых вирусов» или «вирусов, подобных энтеровирусам», таких как пикорнавирус, калицивирус или Hepeviridae (вирусов, подобных вирусу гепатита Е), или даже от оболочечных РНК-вирусов, таких как реовирусы, ротавирусы или коронавирусы, которые вызывают заболевания, симптомы которых очень напоминают симптомы заболеваний, вызываемых астровирусами. Это обусловлено тем, что данные о таких свойствах могут варьироваться в зависимости от применяемого метода и от используемых условий. Поэтому, в настоящее время пока еще недостаточно данных для получения точной информации.

С другой стороны, данные о молекулярно-биологических свойствах, таких как генотипирование, в комбинации с данными об иммунологических свойствах, подробно описаны в литературе и могут быть воспроизведены на уровне, достаточном для отнесения данного микроорганизма к конкретной таксономической группе (Van Regenmortel et al., 2000, in: Virus Taxonomy, 7^th report of the ICTV, Academic press, New York). Поэтому, в идеальном случае, такие данные получают путем осуществления секвенирования нуклеотидов, а также путем проведения анализов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализов по серологическому типированию.

РНК-геном вируса Astroviridae имеет размер приблизительно 7 т.п.н., а организация генома этого вируса является типичной для вирусов данного семейства, см.: Jiang et al. (1993, PNAS-USA, vol. 90, p. 10539-10543) и Koci et al. (2000, J. of Virology, vol. 74, p. 6173-6177). В соответствии с общепринятым мнением, этот геном включает три явно распознаваемых открытых рамок считывания (ОРС) в направлении 5'→3':

ОРС1а: имеет размер приблизительно 3 т.п.н. и кодирует неструктурный белок, имеющий мотив сериновой протеазы.

OPC1b: имеет размер приблизительно 1,5 т.п.н., частично перекрывается с OPC1a и кодирует неструктурную РНК-зависимую РНК-полимеразу.

ОРС2: кодирует структурные вирусные белки посредством субгеномной РНК размером приблизительно 2 т.п.н. Перед сборкой вируса, экспрессируемый полипротеин, вероятно, расщепляется на более мелкие части и содержит другие капсидные или оболочечные белки.

Из трех ОРС, OPC1b имеет наиболее консервативную нуклеотидную последовательность по сравнению с нуклеотидными последовательностями астровируса, которые являются общеизвестными, а ОРС2 представляет собой ОРС, последовательность которой является наиболее вариабельной.

Начиная с 1987 года и до сегодняшнего дня, при выращивании домашней птицы на фермах в Нидерландах, в Германии и в Объединенных Арабских Эмиратах, у этих птиц обнаруживались некоторые конкретные патологические состояния, а именно, у кур и индеек наблюдалась диарея, снижение степени метаболизма корма и снижение роста, а также патологии, ассоциированные с распуханием и болезненностью суставов и сухожилий ног. Такие патологии были обнаружены у птиц-бройлеров, племенных птиц и птиц-несушек различного возраста, и у различных сельскохозяйственных видов без какой-либо явной взаимосвязи.

В первую неделю и в последующие несколько месяцев у птиц наблюдалась хромота. У этих птиц наблюдалось распухание скакательных (заплюсневых) суставов и сухожилий сгибательной плюсны нижних конечностей, причем, на обоих участках наблюдался избыток прозрачной слегка вязкой жидкости и обнаруживались симптомы артрита. У этих птиц наблюдалось снижение уровня метаболизма корма и снижение скорости роста, что, наиболее вероятно, является результатом нарушения двигательной системы. В худших случаях, птицы были уже неспособны двигаться, а поэтому больше не могли подходить к корму или питью, что приводило к их гибели. Такие поражения конечностей наиболее часто наблюдались у птиц высокопродуктивной породы типа бройлеров, однако, экономический ущерб оставался значительным и в отношении птиц всех видов.

Еще большую проблему представляла диарея, которая наблюдалась, главным образом, у более молодых птиц, а также у птиц, несущих яйца. Симптомы варьировались от нарушения пищеварения до истинного энтерита и приводили к снижению уровня метаболизма пищи, к замедлению роста или даже к потере веса, к ухудшению яйценоскости («откладывания яиц»); к увеличению числа яиц плохого качества и к гибели птиц.

На некоторых фермах такие проблемы наблюдались в течение нескольких лет, что приводило к постоянному низкому показателю продуктивности без всяких видимых причин.

После исследований post mortem, в некоторых случаях, помимо тонкого кишечника и сустав лап были также обнаружены поражения и в других частях тела, такие как эрозия преджелудка или увеличение печени.

Для выявления причин развития этих симптомов были исследованы аспекты лечения и кормления, однако, какой-либо взаимосвязи с патологическими нарушениями, наблюдаемыми в этих случаях, не обнаруживалось. Кроме того, были исследованы патогены, которые могут быть ответственны, в частности, за реовирусную инфекцию, поскольку хорошо известно, что этот вирус вызывает малабсорбцию и поражения суставов. Однако, несмотря на проведение ряда анализов, во многих случаях, реовирус не был обнаружен.

Были также исследованы, рутинным способом или в частном порядке, некоторые другие патогены, которые, как известно, вызывают аналогичные симптомы, например, такие патогены, как Salmonella, Mycoplasma, Haemophilus и Pasteurella; и вирусы, такие как аденовирус, вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус инфекционного бурсита (IBDV), возбудитель синдрома кладки яиц (EDS) и вирус птичьего гриппа (AIV).

До настоящего времени, несмотря на тяжесть указанных поражений и на проблемы, связанные со здоровьем животных и экономическим ущербом от снижения продаж домашней птицы, какого-либо этиологического фактора, вызывающего поражения конечностей и тонкого кишечника, не было обнаружено.

Следовательно, крайне необходимо идентифицировать фактор, связанный с наблюдаемыми симптомами заболеваний, и получить вакцины и диагностические средства, что позволило бы предупреждать эти заболевания и выявить их возбудитель.

Новый вирус неожиданно был обнаружен у кур и индеек, страдающих кишечными заболеваниями и нарушением двигательной системы. Этот вирус может быть выделен из суставов и сухожилий, а также из различных внутренних органов больных птиц различного возраста, вида и происхождения. Выделенный вирус, в свою очередь, индуцировал аналогичные симптомы заболевания после инфицирования здоровых тестируемых животных, и этот вирус мог быть снова выделен у больных тестируемых животных и проанализирован в соответствии с постулатами Коха.

Этот новый вирус может быть использован для разработки диагностических анализов и вакцин в целях обнаружения и уничтожения вируса, а также для лечения патологических состояний, вызываемых этим вирусом у домашней птицы, а в частности, заболеваний суставов, сухожилий и желудочно-кишечного тракта.

Новый вирус был проанализирован различными способами и неожиданно был идентифицирован как астровирус. Поскольку, этот вирус присутствует преимущественно у кур и индеек, он был предварительно классифицирован как птичий астровирус.

Наряду со многими другими свойствами этого нового вируса было установлено, что он не имеет оболочки, на что указывают результаты двух последовательных экстракций хлороформом, после которых экстрагированный образец вируса был еще способен вызывать специфическое патогенное действие в яйцах кур SPF с развивающимся эмбрионом.

На присутствие РНК-генома в новом вирусе указывает тот факт, что нуклеиновая кислота, подходящая для последующего анализа, могла быть получена только после экстракции РНК и ОТ-ПЦР, но не после выделения ДНК и проведения стандартной ПЦР.

Неожиданно было обнаружено, что наиболее близкородственными (уже различаемыми) являются вирусы типа ANV1, а поэтому новые птичьи астровирусы, описанные в настоящей заявке, представляет собой новую группу вирусов птичьего нефрита, предварительно классифицированных как вирусы ANV3.

Однако, авторами настоящего изобретения был неожиданно обнаружен ряд признаков, по которым можно отличить новые птичьи астровирусы, описанные в настоящей заявке, от вирусов ANV1 и других (астро-)вирусов, и однозначно охарактеризовать различные изоляты нового птичьего астровируса как изоляты, принадлежащие к новой и отдельной группе таких вирусов.

Главным отличительным свойством этих вирусов является присутствие специфической нуклеотидной последовательности, которая может быть идентифицирована путем проведения анализа нуклеотидной последовательности и ПЦР-анализа.

Были также обнаружены отдельные патологические симптомы, индуцированные в результате инфицирования эмбрионов. Специфические иммунологические различия были выявлены путем серотипирования с помощью VN- или IFT-анализов. Все эти анализы описаны ниже в разделе «Экспериментальные результаты» и «Подробное описание».

Настоящее изобретение относится к выделенному новому птичьему астровирусу, имеющему геномную область с открытой рамкой считывания (OPC) 1a, и отличающемуся тем, что ОРС1а указанного птичьего астровируса, при ее сравнении с ОРС1а вируса птичьего нефрита 1, содержит вставку из 12 нуклеотидов, где указанная вставка расположена между нуклеотидами, соответствующими нуклеотидам 2485 и 2486 последовательности SEQ ID NO: 1.

Предпочтительными «птичьими» организмами является домашняя птица, а более предпочтительно, птицы, выбранные из группы, состоящей из кур, индеек, уток и гусей. Наиболее предпочтительными являются куры.

Термин «астровирус» указывает на взаимосвязь группы новых вирусов согласно изобретению с вирусами, которые в настоящее время описаны и классифицированы как вирусы, принадлежащие к таксономическому семейству Astrovirideae. Однако, для специалиста в этой области очевидно, что таксономическая классификация может со временем меняться, поскольку появляющиеся новые данные могут привести к пересмотру классификации и созданию новых или других таксономических групп. Однако, поскольку такой пересмотр не изменяет свойств вируса согласно изобретению, а изменяет только его классификацию, то такие переклассифицированные организмы входят в объем настоящего изобретения.

В частности, настоящее изобретение охватывает все вирусы, входящие в подклассы птичьих астровирусов согласно изобретению, а именно, в подвиды, штаммы, изоляты, генотипы, серотипы, варианты или подтипы и т.п.

Поэтому, в соответствии с настоящим изобретением, «асторвирус» представляет собой вирус, имеющий отличительные признаки вируса, классифицированного как астровирус. Такие отличительные признаки относятся, например, к молекулярным, биохимическим и биологическим признакам, а именно, что такие вирусы имеют одноцепочечный РНК-геном с положительной смысловой цепью, содержащий ОРС, идентифицируемые как 1a, 1b и 2; представляют собой вирион без оболочки размером примерно 28-30 нм; и вызывают энтерит.

Термин «геномная область» означает часть генетического материала нового астровируса согласно изобретению. Такая область состоит из нуклеиновой кислоты, а в случае нового птичьего астровируса согласно изобретению, такой нуклеиновой кислотой является РНК.

Геном нового птичьего астровируса согласно изобретению содержит, как и все другие астровирусы, области, распознаваемые как ОРС1а, 1b и 2, и области, соответствующие этим ОРС.

Однако неожиданно было обнаружено, что новый птичий астровирус имеет в своей геномной области ОРС1а некоторые нуклеотиды, которые отсутствуют в ОРС1а ANV1 или астровируса (птичьего) любого другого типа. Эти нуклеотиды присутствуют в форме линейных и непрерывных фрагментов из 12 нуклеотидов и, по сравнению с последовательностью ОРС1а ANV1, они представляют собой вставку в этой области. «Вставка» из 12 нуклеотидов присутствует в ОРС1а всех изолятов, тестируемух групп новых птичьих астровирусов, описанных в настоящей заявке.

Локализация вставки из 12 нуклеотидов, присутствующей в ОРС1а изолятов новых птичьих астровирусов, описанных в настоящей заявке, указана посредством ссылки на нумерацию, приведенную для геномной последовательности известного штамма ANV1, который был описан Imada et al. (2000, J. of Virology, vol. 74, p. 8487-8493). кДНК-последовательность геномной последовательности этого штамма ANV1 также имеется в Интернете в базе данных нуклеотидов Американского национального института здравоохранения, известной как GenBank, под регистрационным номером AB033998, и представлена в настоящей заявке как SEQ ID NO: 1.

Во всех изолятах новых птичьих астровирусов согласно изобретению, вставка из 12 нуклеотидов в ОРС1а была расположена между нуклеотидами, соответствующими нуклеотидам 2485 и 2486 последовательности SEQ ID NO: 1.

В настоящее время неизвестно, может ли вставка из 12 нуклеотидов в ОРС1а нового птичьего астровируса согласно изобретению, которая отсутствует в ОРС1а ANV1, влиять на поведение этого нового птичьего астровируса, а также неизвестно, каким образом такая вставка влияет на поведение данного астровируса. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения лишь предполагают, что факт существования вставки из 12 нуклеотидов, и, тем самым, из 4 триплетов, которые сохраняют трансляционную рамку ОРС1а в интактной форме, позволяет кодируемым 4 дополнительным аминокислотам включаться в неструктурные белки, экспрессируемые из ОРС1а. Существует очень большая вероятность того, что такая вставка будет влиять на патобиологическое поведение вирусов, например, на их вирулентность и способность вызывать заболевание тонкой кишки, а также ног, суставов и сухожилий.

Тем не менее тот факт, что эти 12 нуклеотидов присутствуют в геномной области OPC1a описанных здесь новых птичьих астровирусов, но не в ОРС1а ANV1 или других (птичьих) астровирусов, указывает на возможность получения позитивного генетического маркера для этой новой группы вирусов.

Как хорошо известно специалистам в данной области, генетическим маркером является особенность генетического материала организма, то есть, область, расположенная в некоторых геномных участках, которая может быть использована для выявления определенного различия или для корреляции, и может быть детектирована техническими методами. Если, как и в данном случае, такая особенность наблюдается у идентифицируемой группы, то она представляет собой «позитивный» генетический маркер для этой группы.

Указанная нуклеотидная последовательность вставки из 12 нуклеотидов, которая характеризует новый птичий астровирус согласно изобретению, может не идентифицироваться во всех изолятах нового птичьего астровируса, описанного в настоящей заявке, однако, ее размер и локализация являются идентичными. Консенсусная последовательность данной нуклеотидной последовательности вставки из 12 нуклеотидов, представляет собой:

5'-TCYGGDMARYYT-3', и обозначена здесь как SEQ ID NO: 2.

Поэтому, в своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение отличается тем, что вставка из 12 нуклеотидов имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 2.

Специалисту в данной области известно, что последовательность SEQ ID NO: 2 представляет собой так называемую «денатурированную» праймерную последовательность, где указаны положения (в данном случае, Y, D, M и R), в которых может присутствовать один из ряда нуклеотидов. Одним из кодов, часто используемых для указания денатурированных оснований, является код ИЮПАК (IUPAC) (опубликованный в Biochem. J., 1985, vol. 229, p. 281-286), где: R=G или A; Y=T или C; M=A или C; K=G или T; S=G или C; W=A или T; H=A, C, или T; B=G, T или C; V=G, C или A; D=G, A или T; и N=G, A, T или C.

Что касается нового описанного здесь птичьего астровируса, то присутствие этого детектируемого генетического маркера позволяет идентифицировать новый вирус и его новую группу путем детектирования, например, посредством секвенирования ДНК или ПЦР.

Секвенирование ДНК представляет собой хорошо известный метод, а стандартные протоколы и оборудование, например, для проведения высокоскоростного автоматического секвенирования, широко применяются специалистами в данной области. Наиболее часто используемыми протоколами являются протоколы, в которых применяется «циклическое секвенирование» на основе ПЦР с последующим проведением электрофореза с высокой степенью достоверности.

Что касается секвенирования нуклеиновых кислот РНК-вирусов, таких как астровирусы, то исследование нуклеиновой кислоты необходимо осуществлять в форме ДНК-копии (кДНК), поскольку пока еще невозможно проводить секвенирование РНК. Для получения кДНК существует множество стандартных протоколов и коммерчески доступных наборов. В таких протоколах используется фермент обратная транскриптаза. Для инициации процедуры копирования обычно используется праймер.

Примером подходящего праймера для проведения реакции с обратной транскриптазой является ДНК-олигонуклеотид, представленный здесь как SEQ ID NO: 3 и имеющий последовательность: 5'-TCG WTS CTA CYC-3'. Этот праймер указан авторами настоящего изобретения как праймер 17.

Указанный праймер гибридизуется с отдаленной 3'-областью генома многих птичьих астровирусов, начиная с нуклеотида, соответствующего нуклеотиду 6731 SEQ ID NO: 1, и такая гибридизация происходит в обратном направлении.

На фигуре 1 проиллюстрировано выравнивание множества последовательностей кДНК фрагмента ОРС1а полученных из выбранного числа изолятов птичьих астровирусов согласно изобретению. Такие последовательности выравнивают с соответствующей частью генома эталонного вируса ANV1, представленного в SEQ ID NO:1. Как хорошо видно из участка, очерченного рамкой, все изоляты имеют область из 12 нуклеотидов, которая отсутствует в ОРС1а ANV1. Последовательности SEQ ID NO кДНК ОРС1а изолятов птичьего астровируса согласно изобретению представлены в таблице 1.

Аналогичным образом, на фигуре 2 проиллюстрировано выравнивание множества предполагаемых аминокислотных последовательностей, полученных путем компьютерной трансляции последовательностей кДНК, перечисленных на фигуре 1. Как видно из участка, очерченного рамкой, белок, кодируемый ОРС1а птичьих астровирусов согласно изобретению, содержит 4 аминокислоты, которые отсутствуют в белке, кодируемом ОРС1а вируса ANV1. SEQ ID NO транслированной последовательности ОРС1а изолятов птичьего астровируса согласно изобретению перечислены в таблице 1.

Что касается изолятов птичьих астровирусов согласно изобретению, то большое число природных изолятов было взято в течение определенного периода времени у кур и индеек, страдающих заболеваниями ног и/или тонкого кишечника, описанными выше. Было проанализировано множество изолятов из числа изолятов, входящих в новую группу птичьих астровирусов согласно изобретению, описанных в настоящей заявке. Однако для определения нового птичьего астровируса в рамках природных изменений, имеющихся в этой группе, в настоящей заявке представлен весь набор только проанализированных изолятов.

В таблице 1 приводится описание изолятов птичьего астровируса согласно изобретению, указанных в настоящей заявке. В таблице 1 также приводится список SEQ ID NO кДНК и предполагаемых последовательностей белка, происходящих от ОРС1 а, 1b и 2 данного набора изолятов.

Таблица 1
Свойства набора изолятов птичьего астровируса согласно изобретению, а также SEQ ID NO секвенированных областей кДНК («nt») и предполагаемых кодируемых белков («aa»)
Номеризолята	Животное-донор	SEQ ID NO:
вид	тип	возраст	ткань	ОРС1а	OPC1b	ОРС2
161319«изолят 19»	Курица	несушка	36 недель	трахея	nt: 4aa: 5	nt: 4aa: 7	nt: 4aa: 9
637	курица	бройлер	12 дней	Сухожилие и хрящ скакатель-ного сустава	nt: 10aa: 11
686	курица	бройлер	10 дней	Различные органы	nt: 12aa: 13
714	курица	бройлер	30 дней	Слепая кишка, миндалины и поджелудоч-ная железа	nt:14aa:15
715	курица	бройлер	30 дней	Слепая кишка, миндалины и поджелудоч-ная железа	nt:16aa:17
1736	курица	бройлер	-	Сухожилие и большебер-цовая кость	nt:18aa:19
2383	индейка	бройлер	-	Сустав и синовиальн-ая жидкость	nt:20aa:21
2388	индейка	бройлер	-	Сухожилие и большебер-цовая кость	nt:22aa:23
7279	курица	-	-	Поджелудоч-ная железа	nt:24aa:25
161317	курица	несушка	36 недель	Трахея	nt:26aa:27

"nt" = нуклеотидная последовательность;"aa" = аминокислотная последовательность;"-" = не известно.

Изолят птичьих астровирусов согласно изобретению может быть получен от птиц, страдающих заболеваниями тонкого кишечника или ног, путем взятия образца из одного или нескольких органов, либо из суставов или сухожилий ног. Образцы, если это необходимо, могут быть гомогенизированы, и, например, смешаны с соответствующим буферным раствором, предпочтительно содержащим антибиотики.

Для амплификации вирусного титра таких изолятов могут быть использованы различные субстраты, такие как птичьи клеточные линии или птичьи яйца с развивающимся эмбрионом. При использовании яиц, суспензия может быть инокулирована в птичьи яйца с развивающимся эмбрионом и культивирована в этих яйцах. Могут быть проведены различные способы инокуляции, такие как инокуляция на хорио-аллантоисной оболочке (CAM) или в желточный мешок или в полости с аллантоисной жидкостью. Первые несколько раундов инокуляции, предпочтительно, проводят в желточном мешке, а остальные раунды (если это необходимо) могут быть проведены в аллантоисной жидкости. Могут быть использованы примерно 5-7-дневные куриные яйца SPF (свободные от специфических контаминантов) с развивающимся эмбрионом. Все эти методы хорошо известны специалистам в данной области, а куриные яйца SPF соответствующего качества и возраста являются коммерчески доступными и поставляются, например, фирмами Spafas® или Lohmann®.

После инкубирования в течение 2-7 дней в соответствующих условиях могут быть собраны эмбрионы, хорио-аллантоисные оболочки (CAM) или (предпочтительно) аллантоисная жидкость. При необходимости, могут быть проведены дополнительные раунды амплификации на яйцах путем инокуляции в желточный мешок или в аллантоисную жидкость. И наконец, может быть собрана аллантоисная жидкость, содержащая большое количество птичьего астровируса согласно изобретению.

Для ПЦР-секвенирования обеих цепей репрезентативной части ОРС1а могут быть использованы нижеследующие праймеры:

SEQ ID NO: 28: 5'-AAA GGK AAG ACD AAG ARR RAC MG-3', и

SEQ ID NO: 29: 5'-TCG CCT TCT GGA AGG TCT TCA-3'.

Авторами настоящего изобретения эти секвенирующие праймеры были названы праймерами F-II и R-II-3, соответственно. SEQ ID NO: 28 гибридизуется начиная с нуклеотидов, соответствующих нуклеотиду 2171 и далее нуклеотидам ANV1 (SEQ ID NO:1); SEQ ID NO: 29 гибридизуется с нуклеотидами, начинающимися с нуклеотида 2640 последовательности SEQ ID NO:1, и такая гибридизация происходит в обратном направлении (см. таблицу 4). Таким образом, геномная область ОРС1а птичьего астровируса согласно изобретению, содержащая 12 нуклеотидов, отсутствующих в ANV1, покрывается частью ОРС1а, которая является секвенированной.

Для компьютерного анализа определенных последовательностей ДНК, эти последовательности усекают так, чтобы они не содержали денатурированных последовательностей от самих праймеров. Кроме того, для достижения репрезентативного выравнивания необходимо, чтобы сравниваемые последовательности имели одинаковую длину. Кроме того, выравнивание осуществляют так, чтобы оно покрывало всю длину усеченных последовательностей.

Так, например, в случае использования праймеров SEQ ID NO: 28 и 29, длина сравниваемой последовательности составляет примерно 400-425 нуклеотидов.

Стандартной компьютерной программой для таких манипуляций и выравниваний является программа Clone Manager™ (Scientific and Educational software™), и альтернативно, доступными программами являются программы, имеющиеся в Интернете: «ClustalW» для множественного выравнивания и «Translate» для трансляций, причем, обе эти программы имеются на сайте www.expasy.org; или программы «Blast», имеющиеся на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov. Предпочтительно, используются параметры весовых коэффициентов по умолчанию.

Для многих изолятов птичьего астровируса согласно изобретению, секвенирование кДНК проводят с использованием праймеров SEQ ID NO: 28 и 29. Набор отобранных усеченных нуклеотидных последовательностей представлен здесь последовательностями SEQ ID NO: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 26, указанными в таблице 1.

Эти последовательности сопоставляли друг с другом с использованием в качестве эталона последовательности одного изолята, выделенного у курицы и обозначенного как 161319, где указанный изолят был назван авторами настоящего изобретения «изолятом 19». Кроме того, проводили выравнивание нескольких последовательностей ДНК соответствующих частей ОРС1а от других астровирусов, имеющихся в базе данных GenBank, например, ANV1 (AB033998, SEQ ID NO: 1), индюшачьего астровируса 1 (TAstV1) (Y15936), индюшачьего астровируса 2 (AF206663), овечьего астровируса (Y15937), астровируса норки (AY179509) и человеческого астровируса (Z25771); а дефисы между ними означают соответствующие регистрационные номера GenBank.

Из этих последовательностей ОРС1а других астровирусов, только последовательность в ANV1, а в частности, часть, соответствующая нуклеотидам 2213-2607 SEQ ID NO:1, имеет последовательность, идентичность которой является значимой, что означает, что процент идентичности нуклеотидных последовательностей значительно превышает 50%. Что касается остальных других астровирусов, то только TAstV1 (GenBank рег. №: Y15936) имеет детектируемую, но почти незначимую идентичность последовательностей в части нуклеотидов 2450-2856. Эти последовательности представлены в таблице 2.

Таблица 2
В данной таблице представлены проценты идентичностей нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 4 (представляющей собой часть ОРС1а изолята 19), и последовательности соответствующей части ОРС1а от других изолятов птичьего астровируса согласно изобретению, а также от других астровирусов.
Номер изолята/вируса	% идентичностинуклеотидных последовательностей с SEQ ID NO:4	SEQ ID NO или регистрационный номер в GenBank
637	90	SEQ ID NO:10
686	88	SEQ ID NO:12
714	89	SEQ ID NO:14
715	98	SEQ ID NO:16

1736	89	SEQ ID NO:18
2383	88	SEQ ID NO:20
2388	88	SEQ ID NO:22
7279	89	SEQ ID NO:24
161317	89	SEQ ID NO:26
ANV1	80	SEQ ID NO:1 (часть: 2213-2607) GenBank: AB033998
TAstV1	56	GenBank: Y15936 (часть: 2450-2856)
TAstV2	<50	GenBank: AF206663 (часть: не детектируемая)

Дендрографическое дерево, построенное на основании результатов выравнивания этих нуклеотидных последовательностей, представлено на фигуре 3.

Таким образом, было неожиданно обнаружено, что группа новых птичьих астровирусов согласно изобретению отличается от всех других астровирусов, как птичьих, так и вирусов млекопитающих, то есть, их нуклеотидные последовательности, при сравнении областей последовательностей ОРС1а ДНК, соответствующих SEQ ID NO:4, имеют идентичность 88% или более.

Поэтому, в своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к птичьему астровирусу согласно изобретению, отличающемуся тем, что ОРС1а указанного птичьего астровируса содержит область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 88% идентична последовательности SEQ ID NO:4.

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к птичьему астровирусу согласно изобретению, отличающемуся тем, что ОРС1а указанного птичьего астровируса содержит область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 89%, а более предпочтительно, на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 %, в порядке предпочтительности, идентична последовательности SEQ ID NO: 4.

В других предпочтительных вариантах изобретения, для характеризации птичьего астровируса согласно изобретению, помимо SEQ ID NO:4, может служить любая из нуклеотидных последовательностей части ОРС1а, описанных в SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 26.

Аналогично множественному выравниванию нуклеотидных последовательностей ОРС1а, представленных в таблице 2, может быть осуществлено выравнивание предполагаемых аминокислотных последовательностей, кодируемых усеченными последовательностями нуклеиновой кислоты, представленными в таблице 2, а именно, SEQ ID NO: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 26. Полученные аминокислотные последовательности, транслированные с помощью компьютера, представлены здесь как SEQ ID NO: 5, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27. Сравниваемой последовательностью является SEQ ID NO: 5, то есть, предполагаемая аминокислотная последовательность части ОРС1а изолята 19. Выравнивание было также проведено с помощью программы Align+, в которой применяется выравнивание по всей длине SEQ ID NO: 5. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Список процентов идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 (транслированных из части ОРС1а изолята 19) и последовательности соответствующей части ОРС1а от других изолятов птичьих астровирусов согласно изобретению, а также от ANV1 и TAstV2.
Номер изолята/вируса	% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:5	SEQ ID NO или регистрационный номер в GenBank
637	97	SEQ ID NO:11
686	97	SEQ ID NO:13
714	97	SEQ ID NO:15
715	99	SEQ ID NO:17
1736	96	SEQ ID NO:19
2383	94	SEQ ID NO:21
2388	93	SEQ ID NO:23
7279	96	SEQ ID NO:25
161317	97	SEQ ID NO:27
ANV1	88	GenBank: ВАА92848 (часть: 734-864)
TAstV2	<40	GenBank: Q9ILI6 (часть: 810-930; почти не детектируемая)

Выравнивание аминокислот подробно проиллюстрировано на фигуре 2.

Результат анализов этой аминокислотной последовательности был сравнимым с результатами, представленными в таблице 2, то есть, аминокислотные последовательности изолятов птичьего астровируса согласно изобретению были более родственными по отношению друг к другу, чем по отношению к другим птичьим астровирусам. Проценты идентичности аминокислотных последовательностей различных изолятов птичьего астровируса согласно изобретению с последовательностью SEQ ID NO:5 составляют 93-99%, тогда как идентичность с вирусом ANV1 является более низкой и составляет 88%.

Поэтому, в своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к птичьему астровирусу согласно изобретению, отличающемуся тем, что ОРС1а указанного птичьего астровируса кодирует аминокислотную последовательность, включающую область, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична последовательности SEQ ID NO: 5.

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к птичьему астровирусу согласно изобретению, отличающемуся тем, что ОРС1а указанного птичьего астровируса кодирует аминокислотную последовательность, включающую область, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 94%, а более предпочтительно, на 95, 96, 97, 98, 99 или 100%, в порядке предпочтительности, идентична последовательности SEQ ID NO: 5.

В других предпочтительных вариантах изобретения, для характеризации птичьего астровируса согласно изобретению, помимо SEQ ID NO:5, может служить любая из предполагаемых транслированных нуклеотидных последовательностей части ОРС1а, описанных в SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27.

Помимо секвениро