Полипептиды, селективные в отношении интегрина αvβ3, конъюгированные с вариантом челевеческого сывороточного альбумина (hsa), и их фармацевтические применения

Полипептиды, селективные в отношении интегрина αvβ3, конъюгированные с вариантом челевеческого сывороточного альбумина (hsa), и их фармацевтические применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом относится к слитым белкам, содержащим вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³, где вариант родостомина конъюгирован с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA). Изобретение также относится к применению указанных слитых белков для лечения и профилактики заболеваний, связанных с интегрином αvβ3.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кость представляет собой сложную ткань, составленную из нескольких типов клеток, которые непрерывно подвергаются процессу обновления и репарации, именуемому «ремоделированием кости». Два основных типа клеток, ответственных за ремоделирование кости, представляют собой остеокласты, которые осуществляют резорбцию кости, и остеобласты, которые образуют новую кость. Известно, что ремоделирование кости регулируется несколькими системными гормонами (например, паратиреоидным гормоном, 1,25-дигидроксивитамином D₃, половыми гормонами и кальцитонином) и местными факторами (например, оксидом азота, простагландинами, факторами роста и цитокинами).

Интегрины представляют собой гетеродимерные матричные рецепторы, которые прикрепляют клетки к субстрату и передают полученные извне сигналы через плазматическую мембрану. Интегрин αvβ3 участвует в опосредованной остеокластами резорбции кости и in vivo, и in vitro. Данная гетеродимерная молекула распознает аминокислотный мотив Arg-Gly-Asp (RGD), содержащийся в матричных белках кости, таких как остеопонтин и сиалопротеин кости. Интегрин αvβ3 экспрессирован в остеокласте, и его экспрессия модулируется резорбтивными стероидами и цитокинами. На основании экспериментов блокирования интегрин αvβ3 был идентифицирован в качестве основного функционального рецептора адгезии на остеокластах. Ингибиторы интегрина αvβ3 снижают способность остеокластов связываться с костью и осуществлять ее резорбцию. Интегрин αvβ3 играет главную роль в функции остеокластов, и ингибиторы данного интегрина рассматриваются в качестве средств для лечения или профилактики остеопороза, остеолитических метастазов и гиперкальцемии, вызванной злокачественными процессами.

Существует много костных заболеваний, которые связаны с остеолизом, опосредуемым остеокластами. Остеопороз является наиболее распространенным костным заболеванием, которое вызывается, когда резорбция и формирование кости не координированы, и распад кости превышает построение кости. Остеопороз также вызывается другими состояниями, такими как гормональный дисбаланс, заболевания или медикаментозные способы лечения (например, кортикостероидами или противоэпилептическими средствами). Кости являются одним из наиболее частых участков метастазирования злокачественных новообразования молочных желез, предстательной железы, легких и щитовидной железы человека, а также других онкологических заболеваний. Остеопороз может также возникать в результате эстрогенной недостаточности в постменопаузе. Вторичный остеопороз может быть связан с ревматоидным артритом. Костные метастазы проявляют очень необычный этап остеопоротической резорбции кости, которая не наблюдается при метастазах других органов. Широко признано, что остеолиз, который связан с онкологическими заболеваниями, по существу опосредуется остеокластами, которые, как представляется, активируются и могут быть косвенно активированы через остеобласты или непосредственно опухолевыми продуктами. Кроме того, гиперкальцемия (повышенная концентрация кальция в крови) является важным осложнением остеолитических костных заболеваний. Она возникает относительно часто у пациентов с обширной деструкцией кости и особенно часто встречается при карциномах молочной железы, легких, почек, яичников и поджелудочной железы и при миеломе.

Дизинтегрины представляют собой семейство пептидов с низкой молекулярной массой, содержащих RDG, которые специфически связываются с интегринами αllbβ3, α5β1 и αvβ3, экспрессируемыми на тромбоцитах и других клетках, включая сосудистые эндотелиальные клетки и некоторые опухолевые клетки. В дополнение к их высокой антитромбоцитарной активности исследования дизинтегринов выявили новые виды применения при диагностике сердечносо-судистых заболеваний и разработке терапевтических средств для лечения артериального тромбоза, остеопороза и связанного с ангиогенезом роста и метастазированием опухолей. Было обнаружено, что родостомин (Rho), дизинтегрин, происходящий из яда Colloselasma rhodostoma, ингибирует агрегацию тромбоцитов in vivo и in vitro посредством блокады тромбоцитарного гликопротеина αllbβ3. Кроме того, сообщается, что родостомин ингибирует адгезию клеток карциномы молочных желез и предстательной железы с внеклеточными матрицами и неминерализованных, и минерализованных костей зависимым от дозы образом, не воздействуя на жизнеспособность опухолевых клеток. Кроме того, родостомин ингибирует миграцию и инвазию клеток карциномы молочной железы и предстательной железы. Было также показано, что родостомин ингибирует адипогенез и ожирение. Однако, ввиду того, что родостомин не специфически связывается с интегринами αllbβ3, α5β1 и αvβ3, фармацевтическое применение родостомина может вызвать тяжелые побочные эффекты. Например, при применении родостомина при лечении карцином ингибирование агрегации тромбоцитов представляет собой нежелательный побочный эффект.

Роль интегрина αvβ3 при костных заболеваниях была хорошо документирована. См., например, F. Patrick Ross et al, Nothing but skin and bone, the Journal of Clinical Investigation, Vol. 116, #5, May 2006; S. B. Rodan et al, Integrin function in osteoclasts, Journal of Endocrinology (1997) 154, S47-S56; Steven L. Teitelbaum, Editorial: Osteoporosis and Integrins, the Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, April 2005, 90(4): 2466-2468; Steven L. Teitelbaum, Osteoclasts, integrins, and osteoporosis, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (2000) 18: 344-349; Ichiro Nakamura et al, Involvement of αvβ3 integrins in osteoclast function, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (2007) 25: 337-344; Le T. Duong et al, The role of integrins in osteoclast function, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (1999) 17: 1 -6; and A Teti et al., The Role of the AlphaVbeta3 Integrin in the Development of Osteolytic Bone Metastases: A Pharmacological Target for Alternative Therapy?, Calcified Tissue International (2002) 71: 293-299.

В дополнение к костным заболеваниям интегрин αvβ3 играет важную роль в ангиогенезе и росте опухолей при состояниях, не связанных с костными заболеваниями.

Таким образом, может быть желательным создание полипептидов, селективных в отношении интегрина αvβ3, с улучшенной устойчивостью и длительно сохраняющимися эффектами. Данные пептиды потенциально подходят для лечения заболеваний и состояний, в развитии которых участвует интегрин αvβ3, включая без ограничения различные костные заболевания, онкологические заболевания и заболевания, вовлекающие ангиогенез.

Технология слияния человеческого сывороточного альбумина (HSA) использовалась в данной области для создания длительно действующих белковых фармацевтических средств. Однако полипептиды, конъюгированные с HSA, могут быть склонны к связанной с дисульфидом агрегации, особенно в кислотных условиях, приводя к образованию межмолекулярных димеров. Образование межмолекулярных димеров может снизить активность полипептидов и/или вызвать иммуногенность, когда эти полипептиды вводятся млекопитающим.

Соответственно, в данной области имеется потребность в создании полипептида, который является селективным в отношении интегрина αvβ3, имеет лучшую устойчивость и вызывает образование меньшего количества межмолекулярных димеров, чем полипептид, слитый с HSA дикого типа.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA), содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность варианта родостомина, имеющего вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 представляют две из возможных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

SEQ ID NO: 4 представляет аминокислотную последовательность варианта HSA, где остаток цистеина в положении 34 аминокислотной последовательности HSA был замещен серином. Данный вариант HSA именуется HSA C34S.

SEQ ID NO: 5 представляет нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант HSA C34S.

В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 6 представляет аминокислотную последовательность варианта HSA, где остаток цистеина в положении 34 аминокислотной последовательности HSA был замещен аланином. Данный вариант HSA именуется HSA C34A.

SEQ ID NO: 7 представляет нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант HSA C34A.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, где указанный полипептид, кроме того, содержит линкерную аминокислотную последовательность или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В более предпочтительном варианте осуществления линкерная аминокислотная последовательность содержит комбинацию аминокислот глицина и серина.

В более предпочтительном варианте осуществления линкерная аминокислотная последовательность содержит SEQ ID NO: 8.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 9 представляет аминокислотную последовательность слитого белка HSA(C34S)-ARLDDL, где вариант родостомина ARLDDL слит с вариантом HSA C34S через линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотную последовательность слитого белка HSA(C34A)-ARLDDL, где вариант родостомина ARLDDL слит с вариантом HSA C34A через линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10.

В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12.

Ввиду вырожденности генетического кода в данной области возможна модификация нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 для создания других полинуклеотидов, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению. Поэтому полипептиды по настоящему изобретению, кодируемые другими полинуклеотидами, также охватываются настоящим изобретением.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом высоко избирательны в отношении интегрина αvβ3 и проявляют сниженное связывание с интегрином αllbβ3 и/или α5β1, по сравнению с дизинтегрином дикого типа.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к αllbβ3 и/или α5β1 по меньшей мере в 5, 50 или 100 раз, по сравнению с родостомином.

В другом варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к интегрину αllbβ3 по меньшей мере в 200 раз по сравнению с родостомином, предпочтительнее уменьшение сродства к интегрину αllbβ3 по меньшей мере в 500 раз по сравнению с родостомином.

В другом варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к интегрину α5β1 по меньшей мере в 20 раз по сравнению с родостомином, а предпочтительнее уменьшение сродства к интегрину α5β1 по меньшей мере примерно в 70 или 90 раз по сравнению с родостомином.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к тромбоцитам по меньшей мере примерно в 5, 50, 100 или 150 раз по сравнению с родостомином.

В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид проявляет существенно сниженную активность в удлинении времени свертывания крови по сравнению с родостомином и/или дизинтегрином дикого типа.

В другом варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, включающей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или фармацевтически приемлемую соль указанного полипептида и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В одном варианте осуществления изобретения заболевание, связанное с интегрином αvβ3, включает без ограничения остеопороз, костную опухоль или рост злокачественной опухоли и симптомы, связанные с ними, рост и метастазирование опухоли, связанные с ангиогенезом, метастазирование опухолей в кости, гиперкальцемию, вызванную злокачественными заболеваниями, болезнь Педжета, физиологическое изменение, вызванное овариэктомией, ревматический артрит, остеоартрит и глазные заболевания, связанные с ангиогенезом, включая без ограничения возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, заболевания роговицы с неоваскуляризацией, ретинопатию с вызванной ишемией неоваскуляризацией, высокую миопию и ретинопатию недоношенных.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу применения полипептида по изобретению для ингибирования и/или предотвращения роста опухолевых клеток в костях или других органах и связанных с ним симптомов у млекопитающего.

В другом варианте осуществления способ лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включает введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида в комбинации с терапевтически эффективным количеством другого активного средства. Другое активное средство может вводиться перед, во время или после введения полипептида по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления другое активное средство выбрано из группы, состоящей из антагонистов VEGF (сосудистого эндотелиального фактора роста), противовоспалительных средств и цитотоксических средств.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида по изобретению, включающему (a) конструирование гена, кодирующего полипептид по изобретению; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (a); (c) выращивание указанной клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, включающему (a) конструирование гена, кодирующего полипептид по изобретению; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (a); (c) выращивание указанной клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

Способы получения полипептидов по настоящему изобретению могут, кроме того, включать выращивание клетки-хозяина в культуральной среде, лишенной аминокислот, и сбор супернатанта для получения указанного полипептида.

Указанные способы могут, кроме того, включать добавление метанола к культуральной среде для индукции экспрессии полипептидов в клетках-хозяевах.

Способы могут, кроме того, включать стадию выполнения колоночной хроматографии для получения указанного полипептида.

В одном варианте осуществления способы могут, кроме того, включать стадию выполнения высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC, ВЭЖХ) для получения изолированного полипептида.

Указанные и другие аспекты станут очевидны из следующего описания различных вариантов осуществления, взятых в сочетании со следующими чертежами, хотя в них могут быть внесены изменения и модификации без отхода от сущности и объема новых концепций описания.

Следует понимать, что и предшествующее общее описание, и следующее детальное описание являются только иллюстративными и поясняющими, а не ограничивающими изобретение, представленное формулой изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A и 1B показаны профили HPLC соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.1C и 1D показаны профили хроматографии с исключением по размеру (SEC) соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.1E и 1F показаны фотографии профилей SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.1G показаны фотографии двумерных профилей SDS-PAGE HSA-ARLDDL, HSA(C34S)-ARLDDL и HSA.

На фиг.1H показаны ЯМР спектры HSA(C34S)-ARLDDL и BSA.

На фиг.2 показана аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 варианта ARLDDL родостомина.

На фиг.3A показана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 варианта ARLDDL родостомина.

На фиг.3B показана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3 варианта ARLDDL родостомина.

На фиг.4A и 4B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 4 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 мутанта HSA C34S.

На фиг.5A и 5B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 7 мутанта HSA C34A.

На фиг.6 показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 8 линкерной аминокислоты.

На фиг.7A и 7B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10 HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.8A и 8B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 11 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 12 HSA(C34A)-ARLDDL.

На фиг.9A, 9B и 9C представлены фотографии гематопоэтических клеток костного мозга, показывающие, что HSA(C34S)-ARLDDL ингибирует дифференциацию остеокластов.

Фиг.10A, 10B и 10C представляют собой графики, показывающие, что HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL ингибируют дифференциацию остеокластов.

Фиг.11A, 11B, 11C и 11D представляют собой графики, показывающие, что HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL ингибируют ангиогенез на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP).

Фиг.11E, 11F и 11G представляют собой графики, показывающие ангиогенез на мышиной модели ретинопатии, вызванной кислородом. Они показывают, что HSA(C34S)-ARLDDL ингибирует ангиогенез при ретинопатии, вызванной у мышей кислородом.

Фиг.12A и 12B представляют собой фотографии мышей, которым инъецировали человеческие опухолевые клетки PC-3 (12A), а на фиг.12B показаны две мыши, подвергаемые обработке HSA(C34S)-ARLDDL.

Фиг.12C и 12D представляют собой фотографии опухолей, иссеченных соответственно у контрольных мышей и мышей, подвергаемых обработке HSA(C34S)-ARLDDL.

Фиг.13 представляет собой график, который показывает, что HSA(C34S)-ARLDDL значительно уменьшал размер опухоли и массу опухоли у мышей, которым инъецировали человеческие опухолевые клетки PC-3.

Фиг.14A представляет собой набор фотографий, показывающий сниженную плотность кровеносных сосудов в пробках MATRIGEL™ от мышей C57BL/6, подвергаемых обработке HSA(C34S)-ARLDDL, по сравнению с контрольными мышами, не подвергавшимися обработке.

Фиг.14B представляет собой график, показывающий содержание гемоглобина в пробках MATRIGEL™ от мышей C57BL/6, подвергаемых обработке HSA(C34S)-ARLDDL, по сравнению с контрольными мышами, не подвергаемыми обработке.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Теперь будут детально описаны различные варианты осуществления изобретения. Пока контекст ясно не диктует иного, используемое в описании и во всей формуле изобретения значение неопределенных и определенных артиклей единственного числа включает соответствующее множественное число. Также, пока контекст ясно не диктует иного, используемое в описании и во всей формуле изобретения значение «в» включает «в» и «на». Кроме того, некоторые термины, используемые в данном описании, конкретнее определены ниже.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины, используемые в описании, в целом, имеют их обычное значение, принятое в данной области, в пределах контекста изобретения и в определенном контексте, где используется каждый термин. Определенные термины, которые используются для описания изобретения, обсуждаются ниже или в других разделах описания, для обеспечения пользователя дополнительным руководством в отношении описания изобретения. Представление одного или более синонимов не исключает использования других синонимов. Использование примеров в любых разделах описания, включая примеры любых терминов, обсуждаемых в настоящем описании, является только иллюстративным и ни в коей мере не ограничивает объем и значение изобретения или любого иллюстрируемого термина. Изобретение не ограничивается различными вариантами осуществления, представленными в данном описании.

Пока нет других определений, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значении, которое обычно понятно среднему специалисту в данной области, для которого предназначено данное изобретение. В случае противоречия преобладающее значение имеет настоящий документ, включая определения.

«Около», «примерно» или «приблизительно» в целом означает в пределах 20%, в пределах 10%, в пределах 5, 4, 3, 2 или 1% данной величины или диапазона. Представленные числовые количества являются приблизительными, и это значит, что, если нет ясных указаний, то могут подразумеваться термины «около», «примерно» или «приблизительно».

Термины «полинуклеотид», «нуклеотид», «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «последовательность нуклеиновых кислот», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо для обозначения полимерных форм нуклеотидов любой длины. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги и производные. Данный термин включает варианты. Варианты могут включать вставки, добавления, делеции или замещения. Нуклеотидные последовательности перечислены в направлении от 5' к 3'.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок», взаимозаменяемо используемые для обозначения полимерной формы аминокислот любой длины, которые могут включать встречающиеся в природе аминокислоты, кодируемые и не кодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные, дериватизированные или сконструированные аминокислоты, аналоги аминокислот, пептидомиметики и депсипептиды и полипептиды, имеющие модифицированные, циклические, бициклические, депси-циклические или депси-бициклические пептидные основные цепи. Данный термин включает одноцепочечный белок, а также мультимеры.

Данные термины также включают слитые белки, включая без ограничения слитые белки с глутатион-S-трансферазой (GST), слитые белки с гетерологичной аминокислотной последовательностью, такие как биолюминесцентные белки, например люциферин или экворин (зеленый флуоресцентный белок), с гетерологичными и гомологичными лидерными последовательностями, слитые белки с N-концевыми метиониновыми остатками и без них, пегилированные белки и иммунологически меченные или Н:S-меченные белки. Такие слитые белки также включают слияния с эпитопами. Такие слитые белки могут содержать мультимеры пептидов по изобретению, например, гомодимеры или гомомультимеры, и гетеродимеры и гетеромультимеры. Данный термин также включает пептидные аптамеры.

Термин «гибридизуется специфически» в контексте полинуклеотида относятся к гибридизации в строгих условиях. Условия, которые увеличивают строгость реакций гибридизации и ДНК/ДНК, и ДНК/РНК широко известны и опубликованы в данной области. Примеры строгих условий гибридизации включают гибридизацию в 4X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC), при температуре примерно 65-70°C, или гибридизацию в 4X SSC плюс 50% формамиде при температуре примерно 42-50°C, с последующим одним или более промываний в 1X SSC при температуре примерно 65-70°C.

Термин «лиганд» относится к молекуле, которая связывается с другой молекулой, включая рецептор.

Термин «млекопитающее» включает, но не ограничивается этим, человека.

Термин «клетка-хозяин» представляет собой отдельную клетку или клеточную культуру, которая может представлять собой или является реципиентом любого рекомбинантного вектора (векторов) или полинуклеотида. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство может необязательно быть полностью идентичным (по морфологии или по общей комплементарности ДНК) исходной материнской клетке вследствие естественной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные или инфицированные in vivo или in vitro рекомбинантным вектором или полинуклеотидом по изобретению. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор по изобретению, может называться «рекомбинантной клеткой-хозяином».

Термин «лечение» относится к любому введению или применению лекарственных средств по поводу заболеваний у млекопитающего и включает ингибирование заболевания, задержку его развития, облегчение течения заболевания, например, вызывая регрессию, или восстановление, или исправление утраченной, отсутствующей или нарушенной функции, или стимуляцию неэффективного процесса. Данный термин включает получение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта, охватывая любое лечение патологического состояния или расстройства у млекопитающего. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения расстройства или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения расстройства и/или неблагоприятного воздействия, которое может быть связано с расстройством. Он включает (1) предотвращение возникновения или рецидива расстройства у индивида, который может быть предрасположен к расстройству, но у которого еще нет симптомов его развития, (2) ингибирование расстройства, например задержку его развития, (3) остановку или прекращение расстройства или, по меньшей мере, связанных с ним симптомов, с тем, чтобы хозяин больше не страдал расстройством или его симптомами, например, вызывая регрессию расстройства или его симптомов, например, восстановлением или исправлением утраченной, отсутствующей или дефектной функции, или стимуляцию неэффективного процесса, или (4) облегчение, смягчение или ослабление расстройства или связанных с ним симптомов, где термин «ослабление» используется в широком смысле для обозначения по меньшей мере уменьшения величины параметра, такого как воспаление, боль и/или размер опухоли.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному компоненту препаративной формы или эксципиенту любого обычного типа. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и совместим с другими ингредиентами состава.

Термин «композиция» относится к смеси, которая обычно содержит носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, который является обычным в данной области и который подходит для введения индивиду в терапевтических, диагностических или профилактических целях. Она может включать клеточную культуру, в которой полипептид или полинуклеотид присутствует в клетках или в культуральной среде. Например, композиции для перорального введения могут образовывать растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, составы с замедленным высвобождением, составы для полоскания ротовой полости или порошки.

Термин «заболевание» относится к любому состоянию, инфекции, расстройству или синдрому, который требует медицинского вмешательства или по поводу которого желательно медицинское вмешательство. Такое медицинское вмешательство может включать лечение, диагностику и/или профилактику.

Аббревиатуры «Rho» означает «родостомин», который представляет собой дизинтегрин, полученный из яда песчаной эфы Colloselasma rhodostorna. Родостомин не специфически связывается с интегринами αllbβ3, α5β1 и αvβ3 и удлиняет время свертывания крови путем ингибирования агрегации посредством блокады тромбоцитарного гликопротеина αllbβ3.

Термин «IC₅₀» или «половинная максимальная ингибирующая концентрация» относится к концентрации Rho или его варианта, которая требуется для 50% ингибирования его рецептора. IC₅₀ представляет собой показатель того, сколько Rho или его варианта требуется для ингибирования биологического процесса на 50%, такого как сродство варианта к его рецептору.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое при введении живому индивиду достигает желательного воздействия на живого индивида. Например, эффективное количество полипептида по изобретению для введения живому индивиду представляет собой количество, которое предотвращает и/или лечит заболевание, опосредованное интегрином αvβ3. Точное количество будет зависеть от цели лечения, и специалист в данной области сможет определить его, используя известные методики. Как известно в данной области, могут потребоваться поправки для системного в сравнении с местным введением с учетом возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, рациона питания, времени введения, лекарственного взаимодействия и тяжести состояния, и специалист в данной области сможет определить необходимые коррекции обычным экспериментированием.

Термин «антагонист рецептора» относится к связывающемуся с рецептором лиганду, который ингибирует функцию рецептора путем блокирования связывания агониста с рецептором или который обеспечивает возможность связывания агониста, но ингибирует способность агониста активировать рецептор.

Термин «по существу сниженная активность блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1» относится к сниженной по меньшей мере в пять раз активности блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1 интегрина по сравнению с родостомином дикого типа или другими дизинтегринами. Например, для расчета снижения активности блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1, IC_5O варианта родостомина в отношении ингибирования связывания рецепторов αllbβ3 и/или α5β1 интегрина с матричным белком, таким как фибриноген, сравнивается с IC₅₀ Rho.

Термин «вариант мотива RGD» относится к пептиду, содержащему модификацию в аминокислотной последовательности, которая охватывает последовательность RGD соответствующей последовательности дикого типа, такой как последовательность, содержащая RGD в родостомине.

Термин «ARLDDL» относится к варианту родостомина, имеющему вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³. Числа «48» и «53» относятся к положениям указанных аминокислот в аминокислотной последовательности родостомина дикого типа.

Термин «HSA C34S» относится к варианту человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен серином. HSA C34S содержит SEQ ID NO: 4.

Термин «HSA C34A» относится к варианту HSA, где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен аланином. HSA C34A содержит SEQ ID NO: 6.

Термин «HSA(C34S)-ARLDDL» относится к слитому белку, содержащему a) вариант человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен серином, b) линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и c) вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

HSA(C34S)-ARLDDL представлен SEQ ID NO: 9.

Термин «HSA(C34A)-ARLDDL» относится к слитому белку, содержащему a) вариант человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен аланином, b) линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и c) вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

HSA(C34A)-ARLDDL представлен SEQ ID NO:11

Термин «ингибиторная селективность в отношении интегрина αvβ3 относительно рецепторов αllbβ3 и/или α5β1» относится к селективности связывания полипептида в отношении интегрина αvβ3 по сравнению с рецепторами αllbβ3 и/или α5β1, которые выражаются в виде отношения IC₅₀ варианта в отношении ингибирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1 в сравнении с ингибированием рецептора αvβ3.

Термин «по существу сниженная активность продления времени кровотечения» относится к сниженной способности полипептида ингибировать свертывание крови статистически значимым образом по данным измерения экспериментов времени кровотечения, описанным в описании.

Термин «пегилированный-ARLDDL» или «пег-ARLDDL» относятся к пегилированному продукту белка ARLDDL.

Термины «альбумин-ARLDDL» или «HSA-ARLDDL» относятся к конъюгированному с человеческим альбумином продукту белка ARLDDL.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Селективные варианты дизинтегрина αvβ3

В заявке на патент США под серийным № 12/004,045 описываются различные полипептиды, селективные в отношении интегрина αvβ3 и проявляющие сниженную активность блокирования рецепторов αllbβ3 и/или рецепторов α5β1 по сравнению с дизинтегрином дикого типа. Эти полипептиды кодируются модифицированными нуклеотидными последовательностями дизинтегрина, которые кодируют модифицированные аминокислотные последовательности. В результате созданы полипептиды, которые имеют по существу сниженную активность блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1.

Варианты дизинтегрина, такие как связанные с RD соединения, активно ингибируют дифференциацию остеокластов in vitro. Они также ингибируют резорбирующую активность остеокластов и вызванное овариэктомией увеличение образования остеокластов в исследованиях на животных. Кроме того, RD ингибирует рост опухоли предстательной железы человека и клеток рака молочной железы в кости. Вызванная злокачественными поражениями гиперкальцемия также эффективно блокировалась связанными с RD белками. Болезнь Педжета (также известная как деформирующий остеит) представляет собой хроническое костное нарушение, которое обычно приводит к увеличению и деформации костей вследствие неравномерного разрушения и образования костей. Бисфосфонаты были утверждены для лечени