Модифицированные антигенсвязывающие молекулы с измененной клеточной сигнальной активностью

Модифицированные антигенсвязывающие молекулы с измененной клеточной сигнальной активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам (АСМ). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным моноклональным антителам или их фрагментам, в том числе химерным, приматизированным или гуманизированным антителам или их фрагментам с измененной способностью опосредовать клеточную сигнальную активность антигеном-мишенью и/или измененной способностью опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих такие АСМ, а также к векторам и клеткам-хозяевам, включающих такие молекулы нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение также относится к способам получения АСМ настоящего изобретения и способам применения АСМ для лечения заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к АСМ с модифицированным гликозилированием, обладающим улучшенными терапевтическими свойствами, в том числе к антителам с повышенным связыванием Fc-рецептора и повышенной эффекторной функцией.

Уровень техники

Антитела, также называемые иммуноглобулинами, имеют структуру, в основу которой входят четыре полипептидные цепи: две одинаковые тяжелые цепи (heavy - Н), спаренные с двумя одинаковыми легкими цепями (light - L). Каждая тяжелая и легкая цепь включает вариабельную область (variable region - VH и VL, соответственно) и постоянную область (constant region - СН и CL, соответственно). Область СН содержит 3 домена (СН1, СН2 и СН3), хотя меньшая область CL содержит только один домен (который просто обозначается «CL»). Каждая VH и VL область включает 3 комплементарно детерминированные области (complementarity determining region - CDR), фланкированные четырьмя каркасными участками в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Комплементарно детерминированные области (CDR) являются наиболее вариабельной частью области V и определяют специфичность антитела. Вместе спаренные VH и VL формируют сайт связывания антигена, и бивалентные антитела имеют два таких антигенсвязываюших сайта. Следует отметить, что базисная структура антитела может быть модифицирована разными способами (например, генерацией фрагментов структуры), хотя она сохраняет или даже улучшает желаемые функции и/или антигенсвязывающую активность.

На границе между доменами VH и СН1 содержатся консервативные аминокислоты. Эта область контакта может быть описана под названием «молекулярного шаровидного сустава» или «шарнирного сочленения». Такое сочленение определяет «движение локтя» и поэтому называется «локтевым углом» областей VH и VL относительно областей СН1 и CL и предупреждает жесткий контакт между областями V и С (Lesk, Chothia, Nature 335, 1988, cc.188-190). «Углубление шаровидного сустава» формируется остатками аминокислот в каркасном участке VH, особенно в положениях 11, 110 и 112 (по системе нумерации Kabat и др. в кн. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1987, 4-е изд., изд-во Public Health Services, NIH, Вашингтон, округ Колумбия). (См. Lesk, Chothia, Nature, 335, 1988, cc.188-190). «Шаровидный выступ» такого «шаровидного сустава» находится в составе домена СН1 и формируется преимущественно двумя аминокислотами в положениях 148 и 149 (см. Landolfi и др., J. Immunol. 166, 2001, cc.1748-1754, Lesk, Chothia, Nature 335, 1988, cc.188-190) (где остатки СН1, формирующие «шаровидный выступ», пронумерованы 149 и 150, соответственно). Различия в аминокислотах в этих положениях могут диктовать локтевой угол, который формируется между областями V и С, и, следовательно, ориентацию димера VH-VL (см. Lesk, Chothia, Nature 335, 1988, cc.188-190). Аминокислотные остатки, занимающие эти положения в VH, являются в высокой степени консервативными для последовательностей иммуноглобулина (см., например, Lesk, Chothia, Nature 335, 1988, cc.188-190). Все аминокислотные остатки, участвующие в этом сочленении (например, в положениях 11, 110, 112, 148 и 149), расположены в каркасных областях (например, остатки 11, 110 и 112) или в составе постоянного домена (например, 148 и 149 согласно Landolfi и др., или 149 и 150 согласно работе Lesk и Chothia), и, видимо, непосредственно не участвуют в связывании антигена. Landolfi и др., J. Immunol. 166, 2001, cc.1748-1754.

Помимо опосредования эффекторных функций, например, антитело зависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (complement dependent cytotoxicity - CDC), моноклональные антитела могут модулировать клеточные функции индукцией или подавлением клеточных сигнальных метаболических путей. Например, установлено, что моноклональные антитела для опосредования антигенного перекрестного сшивания активируют рецепторы гибели (например, облегчая олигомеризацию рецепторов или мимикрируя связывание лиганда) и блокируют опосредованную лигандом передачу клеточного сигнала при росте и дифференциации клетки и/или метаболические пути пролиферации (см., например, Ludwig и др., Oncogene 22, 2003, cc.9097-9106).

Апоптоз, или запрограммированная гибель клеток, может быть индуцирован несколькими разными механизмами. Например, активация сигнальных метаболических путей через связанные с клеточной мембраной «рецепторы гибели», например, представители надсемейства рецептора фактора некроза опухолей (tumor necrosis factor receptor - TNFR), может привести к индукции апоптоза. Подобным образом димеризация или перекрестное сшивание поверхностного антигена может привести к индукции апоптоза. Так димеризация или перекрестное сшивание поверхностного антигена, например, антигена CD20, также может индуцировать апоптоз (см., например, Ludwig и др., Oncogene 22, 2003, cc.9097-9106).

По прежнему сохраняется потребность в совершенствовании терапевтических подходов к нацеливанию антигенов, связанных с передачей клеточного сигнала, включая, но, не ограничиваясь ею, индукцию апоптоза, для лечения заболевания у приматов, включая людей, но, не ограничиваясь ими.

Краткое описание изобретения

Распознавание огромного терапевтического потенциала модифицированных антигенсвязывающих молекул (АСМ), у которых изменена способность опосредовать клеточную сигнальную антигеном-мишенью и/или изменена способность опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней, в настоящем изобретении разработаны такие АСМ и способ получения таких АСМ. Кроме того, настоящий способ предусматривает получение рекомбинантных химерных антител или их химерных фрагментов. Эффективность таких модифицированных АСМ дополнительно повышается конструированием профиля гликозилирования области Fc антитела.

Таким образом, один из объектов настоящего изобретения представляет модифицированную антигенсвязывающую молекулу, включающую вариабельную область тяжелой или легкой цепи, включающую по меньшей мере одну замену остатка аминокислоты по меньшей мере в одном каркасном участке указанной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной антигенсвязывающей молекулы, где указанные замены приводят к измененной клеточной сигнальной активности антигена-мишени, если указанная модифицированная антигенсвязывающая молекула объединяется с указанным антигеном-мишенью. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения измененная активность по передаче клеточного сигнала является апоптозом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированная антигенсвязывающая молекула обладает повышенной способностью индуцировать апоптоз. В другом варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная антигенсвязывающая молекула обладает пониженной способностью индуцировать апоптоз.

Другой объект настоящего изобретения относится к модифицированной антигенсвязывающей молекуле, включающей вариабельную область тяжелой или легкой цепи, в которой по меньшей мере одна аминокислота заменена по меньшей мере в одном каркасном участке указанной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной антигенсвязывающей молекулы, причем указанная модифицированная антигенсвязывающая молекула обладает измененной способностью опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней в качестве результата указанной замены.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированная антигенсвязывающая молекула настоящего изобретения включает замену в каркасном участке FR1 вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену, выбранную из группы, состоящей по меньшей мере из 2 по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 аминокислот.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замена представляет полную замену каркасного участка FR1 вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения FR1 полностью замещается на VH FR1 клеток зародышевой линии. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения VH FR1 клеток зародышевой линии включает аминокислотную последовательность 8-13 по нумерации Kabat, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104 и SEQ ID NO:105.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированная АСМ включает замену в каркасном участке FR1 вариабельной области тяжелой цепи в виде замены аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях 8, 9, 10, 11, 12 или 13 по нумерации Kabat.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 8 по нумерации Kabat. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 8 по нумерации Kabat на остаток аминокислоты, выбранный из группы, состоящей из аргинина и глицина.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 9 по нумерации Kabat. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 9 по нумерации Kabat на остаток аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аланина, пролина, глицина, серина и гистидина.

В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 10 по нумерации Kabat. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 10 по нумерации Kabat на остаток аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из глутамата, треонина, глицина, аланина и валина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на остаток какой-либо аминокислоты за исключением лейцина. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на неполярную аминокислоту. В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на остаток аминокислоты, выбранной из группы, включающей валин, лейцин, изолейцин, серин и фенилаланин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на лейцин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 12 по нумерации Kabat. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 12 по нумерации Kabat на остаток какой-либо аминокислоты, выбранный из группы, включающей лизин, валин, лейцин и изолейцин.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положениях 11 и 12 по нумерации Kabat. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на валин и в положении 12 по нумерации Kabat на лизин; замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на лейцин и в положении 12 по нумерации Kabat на валин; замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на валин и в положении 12 по нумерации Kabat на изолейцин; или замену аминокислотного остатка в положении 11 по нумерации Kabat на валин и в положении 12 по нумерации Kabat на валин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR1 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка в положении 13 по нумерации Kabat. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 13 по нумерации Kabat на остаток аминокислоты, выбранный из группы, включающей лизин, аргинин, глутамин и глутамат.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения замена в АСМ представляет замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в FR4 вариабельной области тяжелой цепи. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в FR4 вариабельной области тяжелой цепи представляет замену аминокислотного остатка по одному или обоим положениям 110 или 112 по нумерации Kabat.

В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения замена аминокислотного остатка в положении 110 по нумерации Kabat на аминокислоту, выбранную из группы, включающей лейцин, изолейцин, треонин или серии. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 110 по нумерации Kabat на изолейцин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена аминокислотного остатка в положении 112 по нумерации Kabat на аминокислоту, выбранную из группы, включающей валин, лейцин, изолейцин или треонин. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 112 по нумерации Kabat на изолейцин.

Один из объектов настоящего изобретения связан с модифицированной антигенсвязывающей молекулой, включающей домен СН1, содержащий по меньшей мере одну замену остатка аминокислоты по сравнению с доменом СН1 исходного полипептида, причем замена приводит к измененной клеточной сигнальной активности антигена-мишени, если модифицированная антигенсвязывающая молекула объединяется с антигеном-мишенью.

Другой объект настоящего изобретения также связан с модифицированной антигенсвязывающей молекулой, включающей домен СН1, содержащий по меньшей мере одну замену остатка аминокислоты по сравнению с доменом СН1 исходного полипептида, причем антигенсвязывающая молекула в результате такой замены обладает измененной способностью опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замена в СН1 представляет замену аминокислотного остатка по одному или нескольким положениям 148, 149 или 150. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену аминокислотного остатка в положении 149 на лейцин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену целого домена СН1. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения замена представляет замену CH1-домена IgG на CH1-домен IgM.

Другой объект настоящего изобретения представляет модифицированную антигенсвязывающую молекулу, включающую по меньшей мере одну замену аминокислоты, в которой указанная замена представляет замену аминокислотного остатка в легкой цепи в пограничной области между вариабельной и постоянной областями, причем замена приводит к измененной активности по передаче клеточного сигнала антигена-мишени связывающей молекулы, если указанная модифицированная антигенсвязывающая молекула объединяется с указанным антигеном-мишенью.

Другой объект настоящего изобретения связан с модифицированной антигенсвязывающей молекулой, включающей по меньшей мере одну замену аминокислоты, в которой указанное замена представляет замену аминокислотного остатка в легкой цепи в пограничной области между вариабельной и постоянной областями, причем указанная модифицированная антигенсвязывающая молекула обладает измененной в результате указанной замены способностью опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замена в вариабельной области легкой цепи АСМ представляет замену аминокислоты по одному или нескольким из положений 10, 12, 39, 40, 41, 80, 81, 83, 84, 103, 105, 106 и 108 по нумерации Kabat. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в вариабельной области легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка по одному или нескольким из положений 40, 80, 83, 105 или 106 по нумерации Kabat.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка по одному или нескольким из положений 40, 80, 83, 105 или 106 по нумерации Kabat на неполярную аминокислоту.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка в положении 40 по нумерации Kabat на аланин.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка в положении 80 по нумерации Kabat на пролин.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка в положении 83 по нумерации Kabat на фенилаланин.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка в положении 105 по нумерации Kabat на аланин.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка в положении 106 по нумерации Kabat на аланин. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замена в легкой цепи АСМ представляет замену аминокислотного остатка в положении 106 по нумерации Kabat, причем у антигенсвязывающей молекулы снижается способность индуцировать апоптоз.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения замена согласно настоящему изобретению представляет комбинацию замен каких-либо аминокислотных остатков в вариабельной и/или постоянной областях тяжелой и/или легкой цепи согласно описанному в настоящем изобретении.

Одним из направлений исследования настоящего изобретения является аминокислотная замена (замены) в модифицированных АСМ настоящего изобретения, которая приводит к измененной клеточной сигнальной активности антигена-мишени, если модифицированная АСМ объединяется с антигеном-мишенью.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения измененная клеточная сигнальная активность является повышенной агонистической активностью. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения повышенная агонистическая активность выбрана из группы, включающей индукцию апоптоза и индукцию клеточной дифференциации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения измененная клеточная сигнальная активность является повышенной антагонистической активностью. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антагонистическая активность выбрана из группы, включающей выживание клеток, рост клеток, пролиферацию клеток и ангиогенез.

Другим объектом настоящего изобретения является модифицированная антигенсвязывающая молекула настоящего изобретения, которая специфически связывается с антигеном CD20 человека. Еще одним объектом настоящего изобретения является модифицированная антигенсвязывающая молекула, которая специфически связывается с представителем суперсемейства рецептора TNF человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представитель суперсемейства рецептора TNF человека выбран из группы, включающей TNFR1, CD95, TRAILR1, TRAILR2, EDAR и p75NGFR.

Другим объектом настоящего изобретения является модифицированная антигенсвязывающая молекула, которая специфически связывается с рецепторной тирозинкиназой. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения рецепторная тирозинкиназа выбрана из группы, включающей HER1 (EGFR1), HER2/neu, HER3, HER4, IGF-1R, FGFR, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения рецепторной тирозинкиназой является HER1 (EGFR1).

Другим объектом настоящего изобретения также является модифицированная антигенсвязывающая молекула (АСМ), которая может быть выбрана из группы, включающей целое антитело, фрагмент Fab или его гибридный белок, фрагмент F(ab')2 или его гибридный белок, миниантитело, двойное антитело, тройное антитело и четырехкомпонентное антитело, но ими перечень не ограничивается. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения АСМ является химерной молекулой или молекулой, полностью полученной от человека. В еще одном более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная АСМ является гуманизированной. В другом варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная АСМ является мультиспецифичной. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная АСМ является биспецифической.

Другим объектом настоящего изобретения является исходная антигенсвязывающая молекула, включающая вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 и SEQ ID NO:62.

Другим объектом настоящего изобретения является исходная антигенсвязывающая молекула, включающая легкую цепь, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133 и SEQ ID NO:134.

Другим объектом настоящего изобретения является модифицированная АСМ также включающая область Fc человека. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения область Fc модифицированной АСМ модифицирована таким образом, что включает в себя измененные олигосахариды. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения область Fc была модифицирована для понижения пропорции остатков фукозы по сравнению с немодифицированной областью Fc. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения область Fc содержит повышенную пропорцию разветвленных олигосахаридов по сравнению с немодифицированной областью Fc. В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированные олигосахариды являются разветвленным комплексом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения модифицированные олигосахариды обладают повышенной пропорцией разветвленных нефукозилированных олигосахаридов в области Fc по сравнению с немодифицированной областью Fc. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения область Fc содержит повышенную пропорцию остатков N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) по отношению к остаткам фукозы в модифицированной области Fc по сравнению с немодифицированной областью Fc. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения разветвленными нефукозилированными олигосахаридами являются гибридные олигосахариды. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения разветвленные нефукозилированные олигосахариды являются комплексными.

Другим объектом настоящего изобретения является рецептор на поверхности клеток, выбранный из группы, состоящей из мембранного транспортного рецептора, G-белок-связывающего рецептора и фермент-связывающего рецептора. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения мембранный транспортный рецептор является канал-сцепленным рецептором. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ферментсвязанный рецептор выбран из группы, состоящей из рецепторных гуанилилциклаз, рецепторных тирозинкиназ, титрозинкиназа-связанных рецепторов, рецепторных тирозинфосфатаз и рецепторных серин/треонин киназ.

Другой объект настоящего изобретения связан с фармацевтической композицией, включающей модифицированную АСМ настоящего изобретения. Предполагается, что фармацевтическая композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или их комбинацию.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, которое поддается лечению за счет измененной клеточной сигнальной активности у пациента, заключающемуся во введении пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей модифицированную АСМ согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Другой объект настоящего изобретения связан с выделенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий вариабельную область тяжелой или легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой или легкой цепи включает по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка по меньшей мере в одном каркасном участке, по сравнению с исходной вариабельной областью тяжелой или легкой цепи, в результате которого происходит изменение клеточной сигнальной активности антигена-мишени, если полипептид объединяется с антигеном-мишенью.

Другой объект настоящего изобретения связан с выделенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий вариабельную область тяжелой или легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой или легкой цепи включает по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка по меньшей мере в одном каркасном участке, по сравнению с исходной вариабельной областью тяжелой или легкой цепи, причем полипептид имеет измененную способность опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней в результате такой замены.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, включающий легкую или тяжелую цепь антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид настоящего изобретения кодирует полипептид, причем этот полипептид представляет гибридный белок. Настоящее изобретение также относится к полипептидам, кодируемым полинуклеотидами настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему полинуклеотид согласно настоящему изобретению и клетку-хозяина, включающую этот вектор.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, включающий вариабельную область тяжелой или легкой цепи, в котором содержится по меньшей мере один аминокислотный остаток по меньшей мере в одном каркасном участке вариабельной области тяжелой или легкой цепи, по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой исходной антигенсвязывающей молекулы, причем полипептид является модифицированной АСМ согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, сконструированной таким образом, что она способна экспрессировать по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, проявляющий активность β(1,4)-N-ацетилглукозамилтрансферазы III, в количестве, достаточном для модификации олигосахаридов в области Fc полипептида, образуемого клеткой-хозяином, причем полипептид является модифицированной АСМ по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий активностью β(1,4)-N-ацетилглукозаминилтрансферазы III, является гибридным полипептидом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный полипептид представляет каталитический домен β(1,4)-N-ацетилглукозаминилтрансферазы III. В другом варианте осуществления настоящего изобретения гибридный полипептид также включает домен локализации Гольджи гетерологического резидентного полипептида Гольджи. Домен локализации Гольджи может быть выбран из группы, включающей домен маннозидазы II, домен локализации β(1,2)-N- ацетилглюкозаминилтрансферазы I, домен локализации β(1,2)-N- ацетилглюкозаминилтрансферазы II, домен локализации маннозидазы I и домен локализации а 1-6 капсидной фукозилтрансферазы, но ими перечень не ограничивается.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения АСМ включает область, эквивалентную области Fc в IgG человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения АСМ, выделяемая клеткой-хозяином настоящего изобретения, проявляет повышенное связывающее сродство Fc и/или повышенную эффекторную функцию в связи с олигосахаридной модификацией. Согласно настоящему изобретению повышенная эффекторная функция выбрана из группы, включающей: повышенную Fc-опосредованную клеточную цитотоксичность, повышенное связывание с природными клетками-киллерами (ПКК), повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с ПКК полиморфоядерными клетками, повышенное связывание с моноцитами, повышенный направленный сигнал-индуцируемый апоптоз, повышенное созревание дендровидных клеток и повышенное примирование Т-клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является Fcγ-активирующим рецептором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рецептор Fc receptor является рецептором FcγRIIIA.

Согласно настоящему изобретению клетка-хозяин может быть выбрана из группы, которая включает клетки: СНО, HEK293-EBNA, BHK, NSO, SP2/0, клетки миеломы YO, клетки миеломы мыши Р3Х63, PER, PER.C6 или клетки гибридомы.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения связан со способом получения модифицированной АСМ, включающей вариабельную область тяжелой или легкой цепи, включающую по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка по меньшей мере в одном каркасном участке вариабельной области тяжелой или легкой цепи по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной АСМ, причем замена приводит к изменению клеточной сигнальной активности антигена-мишени, если модифицированная АСМ объединяется с антигеном-мишенью; указанный способ включает: (i) культивирование клетки-хозяина настоящего изобретения в условиях, допускающих экспрессию полинуклеотида, и (ii) выделение модифицированной АСМ из культуральной среды.

Другой объект настоящего изобретения связан со способом получения модифицированной АСМ, включающей вариабельную область тяжелой или легкой цепи, включающей по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка по меньшей мере в одном каркасном участке вариабельной области тяжелой или легкой цепи по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной антигенсвязывающей молекулы, в которой модифицированная антигенсвязывающая молекула обладает измененной способностью опосредовать перекрестное сшивание в результате замены, который включает: (i) культивирование клетки-хозяина настоящего изобретения в условиях, допускающих экспрессию полинуклеотида, и (ii) выделение модифицированной АСМ из культуральной среды.

Другой объект настоящего изобретения связан со способом изменения способности АСМ облегчать формирование комплексов, включающих антиген-мишень антигенсвязывающей молекулы (АСМ), который содержит: замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка по меньшей мере в одном каркасном участке вариабельной области тяжелой или легкой цепи исходной АСМ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения АСМ повышает индукцию апоптоза в клетке, экспрессирующей антиген-мишень. В другом варианте осуществления настоящего изобретения АСМ повышает индукцию клеточной дифференциации в клетке, экспрессирующей антиген-мишень.

Настоящее изобретение также относится к способу индукции апоптоза в клетке, способу, включающему контактирование клетки с модифицированной АСМ, включающей вариабельную область тяжелой или легкой цепи, которая включает по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка по меньшей мере в одном каркасном участке указанной вариабельной области тяжелой или легкой цепи по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной АСМ, в которой модифицированная АСМ обладает повышенной способностью индуцировать апоптоз по сравнению с исходным полипептидом. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения клетка является опухолевой клеткой. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения контактирование происходит in vivo.

Другой объект настоящего изобретения также связан со способом лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению измененной клеточной сигнальной активностью антигена-мишени, со способом, представляющим введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества модифицированной АСМ, причем модифицированная АСМ включает вариабельную область тяжелой или легкой цепи, включающей по меньшей мере одну замену аминокислоты по меньшей мере в одном каркасном участке вариабельной области тяжелой или легкой цепи по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной АСМ, причем замена приводит к измененной активности передачи клеточного сигнала антигена-мишени, если модифицированная АСМ объединена с антигеном-мишенью.

Другой объект настоящего изобретения также связан со способом лечения заболевания или расстройства, которое поддается лечению измененной способностью опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней, способом, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества модифицированной АСМ, в котором модифицированная АСМ включает вариабельную область тяжелой или легкой цепи, содержащей по меньшей мере одну замену аминокислоты по меньшей мере в одном каркасном участке вариабельной области тяжелой или легкой цепи по сравнению с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи исходной АСМ, причем модифицированная АСМ обладает способностью опосредовать перекрестное сшивание одного или нескольких антигенов-мишеней в качестве результата такой замены.

В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированная АСМ, вводимая согласно настоящему изобретению, включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей последовательности: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:38.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболевание или расстройство, подвергаемое лечению модифицированной АСМ по настоящему изобретению, является расстройством, связанным с пролиферацией клеток. В другом варианте осуществления, настоящего изобретения расстройство, связанное с пролиферацией клеток, является раком. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание или расстройство, подвергаемое лечению модифицированной АСМ по настоящему изобретению, является расстройством В-клеток. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения расстройство В-клеток является В-клеточной лимфомой.

Настоящее изобретение также связано с применением модифицированной АСМ по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения или профилактики рака.

В одном из конкретных вариантов осуществления настоящее изобретение связано с применением модифицированной АСМ по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения или профилактики рака, выбранного из группы, включающей: В-клето