Иммуноконъюгаты, направленные на cd138, и их применение

Иммуноконъюгаты, направленные на cd138, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США 61/016620, поданной 26 декабря 2007, предварительной заявки 61/087466, поданной 8 августа 2008 и предварительной заявки 61/087590, также поданной 8 августа 2008, которые полностью включены в данное описание в качестве ссылки.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к улучшенным средствам, направленным на антиген CD138, иммуноконъюгатам, содержащим такие средства, композициям, содержащим эти иммуноконъюгаты, и к способам их применения.

Уровень техники изобретения

CD138, который действует как рецептор внеклеточного матрикса, сверхэкспрессируется на клетках множественной миеломы (MM) и, как показано, влияет на развитие и/или пролиферацию клеток MM. CD138 также экспрессируется, в числе прочих, на клетках карциномы яичника, карциномы почки, карциномы желчного пузыря, карциномы молочной железы, рака простаты, рака легкого, карциномы толстой кишки, а также на клетках ходжкинской и неходжкинской лимфом и хронического лимфолейкоза (CLL).

Публикации и другие материалы, в том числе патенты, используемые в данном документе для иллюстрации изобретения и, в особенности для предоставления дополнительных деталей, касающихся применения на практике, включены в настоящее описание в качестве ссылки. Для удобства ссылки на публикации приводятся в нижеследующем тексте по фамилии автора и дате публикации и/или они перечисляются в алфавитном порядке по фамилии авторов в прилагающейся библиографии.

Tassone et al. (2004) описывают превосходное связывание мышиного антитела IgG1 B-B4 с антигеном CD138, экспрессируемым на поверхности клеток MM. Tassone также описывают высокую цитотоксическую активность иммуноконъюгата B-B4-DM1, который содержит мутансиноид DM1 в качестве эффекторной молекулы, в отношении клеток множественной миеломы (см. также публикацию патента США 20070183971).

Хотя Tassone et al. вносят большой вклад в разработку эффективного способа лечения MM и композиций, которые могут применяться для такого лечения, в данной области остается ряд проблем.

Существует потребность в иммуноконъюгатах на основе B-B4, которые не обладают некоторыми свойствами и/или функциями, присущими B-B4. В частности, существует потребность в разработке химерного антитела на основе B-B4, которое связывает CD138 так же эффективно, как и B-B4, но не оказывает серьезных побочных эффектов при введении людям. Также существует потребность в иммуноконъюгате на основе B-B4, который имеет одно или несколько преимуществ по сравнению с его мышиным аналогом. Указанные преимущества включают улучшенное связывание антигена, более эффективное уничтожение опухолевых клеток, в особенности опухолевых клеток, экспрессирующих CD138, и вспомогательных клеток или более гомогенное связывание с мишенью.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на иммуноконъюгат, содержащий:

(a) сконструированное антитело против мишени и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат гомогенно направлен на клетки-мишени, экспрессирующие CD138.

Сконструированное антитело против мишени по настоящему изобретению может

(i) состоять по существу из антиген-связывающего участка (ABR) против CD138 нечеловеческого антитела, или

(ii) содержать антиген-связывающий участок (ABR) против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела, и

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть указанного дополнительного участка антитела относится к человеческому антителу.

ABR может содержать:

(a) CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотные остатки 99-111 последовательности SEQ ID NO: 1; и

(b) CDR3 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотные остатки 89-97 последовательности SEQ ID NO: 2, соответственно.

ABR может дополнительно содержать:

(a) CDR1 и CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащие аминокислотные остатки 31-35 и 51-68 последовательности SEQ ID NO: 1; и/или

(b) CDR1 и CDR2 вариабельного участка легкой цепи, содержащие аминокислотные остатки 24-34 и 50-56 последовательности SEQ ID NO: 2, соответственно.

Дополнительный участок антитела может содержать:

(a) аминокислотные остатки 123-448 последовательности SEQ ID NO: 1; и/или

(b) аминокислотные остатки 108-214 последовательности SEQ ID NO: 2, соответственно;

и их мутации, которые

(i) сохраняют на прежнем уровне или снижают антитело-зависимую цитотоксичность и/или комплемент-зависимую цитотоксичность сконструированного антитела против мишени; и/или

(ii) стабилизируют сконструированное антитело против мишени.

Эффекторную молекулу можно присоединить к указанному сконструированному антителу против мишени через линкер. Линкер может содержать дисульфидную связь. Эффекторная молекула (например, DM4) может обеспечивать стерическое затруднение между антителом против мишени и эффекторной молекулой. Эффекторная молекула может представлять собой, по меньшей мере, один майтансиноид (например, DM1, DM3 или DM4), таксан, или CC1065, или его аналог.

Иммуноконъюгат может связывать CD138 с вариацией нацеливания менее чем на 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% или 50%.

Настоящее изобретение также направлено на иммуноконъюгат, содержащий:

Направляющее средство, направленное на CD138, включающее выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1. Константный участок указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее указанной части может представлять собой константный участок изотипа IgG4.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения MM у субъекта, включающий:

получение одного или нескольких из описанных здесь иммуноконъюгатов и

введение указанному субъекту указанного иммуноконъюгата в количестве, эффективном для лечения множественной миеломы.

Направляющее средство иммуноконъюгата может содержать последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:2. Направляющее средство иммуноконъюгата может содержать последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение также направлено на опосредованный иммуноконъюгатом способ доставки лекарственного средства, который включает:

получение одного или нескольких из описанных здесь иммуноконъюгатов и

введение указанного иммуноконъюгата в терапевтически эффективном количестве, где указанный изотип IgG4 облегчает состояние при ADCC, повышает комплемент-зависимую цитотоксичность и/или Fc-опосредованное нацеливание печеночного FcR.

Настоящее изобретение также направлено на способ ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухолевых клеток в клеточной культуре, включающий

введение в указанную клеточную культуру одного или нескольких из описанных здесь иммуноконъюгатов в количестве, эффективном для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухолевых клеток. Эффективное количество может вызывать гибель опухолевых клеток, экспрессирующих CD138, или прекращение непрерывного клеточного цикла в указанных клетках, и, необязательно, во вспомогательных клетках, которые не экспрессируют CD138, в особенности в клетках стромы опухоли. Клетки указанной клеточной культуры можно получить от ракового пациента и, после введения указанного эффективного количества указанного иммуноконъюгата, клетки указанной клеточной культуры можно реимплантировать указанному раковому пациенту.

Настоящее изобретение также направлено на способ ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухоли, содержащей опухолевые клетки CD138, и/или распространения клеток такой опухоли у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает

введение указанному пациенту, по меньшей мере, одного или нескольких описанных выше иммуноконъюгатов, способных ингибировать рост указанной опухоли и/или уменьшать количество или распространение указанных опухолевых клеток,

где указанный иммуноконъюгат ингибирует, замедляет или предотвращает рост и/или распространение указанных опухолевых клеток. Эффекторная молекула указанного иммуноконъюгата (иммуноконъюгатов) может представлять собой токсин, цитотоксический фермент, низкомолекулярное цитотоксическое средство, порообразующее средство, модификатор биологического ответа, фермент, активирующий пролекарство, антитело, цитокин или радионуклид.

Однократная доза иммуноконъюгатов по настоящему изобретению составляет примерно от 5 мг/м² до 300 мг/м², ее можно вводить с часовыми, суточными, недельными интервалами, или можно использовать сочетания таких режимов.

Режимы, включающие введение нескольких доз с часовыми, суточными и недельными интервалами, являются частью настоящего изобретения и конкретно включают введение с интервалами в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 часов, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель.

Настоящее изобретение также направлено на способ ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухоли и/или распространения клеток злокачественной опухоли у пациента, нуждающегося в этом, включающий

(a) введение указанному пациенту одного или нескольких цитотоксических средств и/или облучения в количестве, эффективном для уменьшения опухолевой нагрузки; и

(b) введение указанному пациенту, по меньшей мере, одного из описанных здесь иммуноконъюгатов в количестве, ингибирующем, замедляющем или предотвращающем рост опухоли и/или распространение опухолевых клеток,

где указанный иммуноконъюгат ингибирует, замедляет или предотвращает рост и/или распространение опухолевых клеток, включающих клетки, экспрессирующие CD138.

Цитотоксическое средство может представлять собой, например, мефалан, винкристин, доксорубицин, дексаметазон, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, цисплатин, талидомид, преднизон, талидомид, бортезомид, леналидомид, сорафениб, ромидепсин или их сочетания, или оно может быть получено на основе антитела.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения субъекта, имеющего состояние, которое может улучшаться в результате подавления выживания клеток миеломы, включающий:

(a) получение, по меньшей мере, одного из описанных здесь иммуноконъюгатов; и

(b) введение иммуноконъюгата субъекту с целью селективного уменьшения выживания или роста указанных клеток миеломы у указанного субъекта.

Настоящее изобретение также направлено на фармацевтическую композицию, содержащую любой из описанных здесь иммуноконъюгатов, для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухолей и/или распространения опухолевых клеток, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Фармацевтическая композиция может содержать цитотоксические средства, описанные в данном документе.

Настоящее изобретение также направлено на набор, содержащий в отдельных контейнерах фармацевтические композиции для применения в сочетании для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухолей и/или распространения опухолевых клеток, где один контейнер содержит эффективное количество вышеуказанной фармацевтической композиции, а другой контейнер содержит вторую фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество другого средства, предпочтительно цитотоксического средства для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухолей и/или распространения опухолевых клеток, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Настоящее изобретение также направлено на способ ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухоли, содержащей клетки CD138, и/или распространения клеток такой опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий

(a) получение иммуноконъюгата, содержащего:

сконструированное антитело, направленное против CD138, присоединенное к эффекторной молекуле через расщепляемый линкер, где указанная эффекторная молекула обеспечивает стерическое затруднение; и

(b) введение указанному субъекту иммуноконъюгата (a) в количестве, ингибирующем, замедляющем и/или предотвращающем рост указанной опухоли и/или распространение указанных опухолевых клеток, где (a) ингибирование роста опухоли под действием указанного иммуноконъюгата превышает ингибирование роста опухоли под действием незатрудненного аналога примерно на 10%, примерно на 20%, примерно на 30%, примерно на 40% или больше.

Ингибирование роста опухоли под действием незатрудненного аналога, содержащего нерасщепляемый линкер, может превышать ингибирование роста опухоли под действием незатрудненного аналога, содержащего расщепляемый линкер, по меньшей мере, примерно на 5%, по меньшей мере, примерно на 10%, примерно до 15%.

Указанное сконструированное антитело, направленное против CD138, может состоять по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела, или оно может содержать антиген-связывающий участок против CD138 нечеловеческого антитела и дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть указанного дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела.

Указанный расщепляемый линкер может содержать дисульфидную связь. Эффекторная молекула может представлять собой DM4. Иммуноконъюгат, который может составлять часть фармацевтической композиции, можно вводить субъекту, по меньшей мере, в одной дозе, составляющей от примерно 5 мг/м² до примерно 300 мг/м².

Настоящее изобретение предлагает иммуноконъюгат для применения в качестве лекарственного средства, где иммуноконъюгат содержит:

(a) сконструированное антитело против мишени,

(i) состоящее по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела; или

(ii) содержащее антиген-связывающий участок против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела,

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела; и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат специфически связывается с CD138.

Настоящее изобретение предлагает другой иммуноконъюгат для применения в качестве лекарственного средства, содержащий:

направленное средство, направленное против CD138, включающее

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

В частности, в одном аспекте данного изобретения указанный в предыдущем абзаце иммуноконъюгат предназначен для лечения множественной миеломы. Например, иммуноконъюгат можно использовать для промышленного получения лекарственного средства для лечения множественной миеломы.

Настоящее изобретение также предлагает иммуноконъюгат для применения в опосредованном иммуноконъюгатом способе доставки лекарственного средства пациенту, в особенности для облегчения ADCC, повышения комплемент-зависимой цитотоксичности и/или эффективности Fc-опосредованного нацеливания печеночного FcR, где иммуноконъюгат содержит направляющее средство, направленное на CD138, включающее выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и где константный участок указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, представляет собой константный участок изотипа IgG4.

Настоящее изобретение также предлагает опухолевые клетки для лечения рака у пациента, где опухолевые клетки обрабатывают в клеточной культуре иммуноконъюгатом, содержащим:

(a) сконструированное антитело против мишени,

(i) состоящее по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела; или

(ii) содержащее антиген-связывающий участок против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела, и

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть указанного дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела; и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат специфически связывается с CD138.

Настоящее изобретение также предлагает опухолевые клетки для лечения рака у пациента, где опухолевые клетки обрабатывают в клеточной культуре иммуноконъюгатом, содержащим:

направленное средство, направленное против CD138, включающее

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение предлагает иммуноконъюгат для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухоли, содержащей клетки CD138, и/или распространения клеток такой опухоли у пациента, где иммуноконъюгат содержит:

(a) сконструированное антитело против мишени

(i) состоящее по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела; или

(ii) содержащее антиген-связывающий участок против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела, и

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть указанного дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела; и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат специфически связывается с CD138.

Альтернативно настоящее изобретение предлагает иммуноконъюгат для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухоли, содержащей опухолевые клетки CD138, и/или распространения клеток такой опухоли у пациента, где иммуноконъюгат содержит:

направляющее средство, направленное против CD138, включающее

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Далее настоящее изобретение предлагает лекарственное средство, содержащее иммуноконъюгат и одно или несколько противораковых средств в виде комбинированного препарата, которые можно использовать одновременно, раздельно или последовательно для лечения опухолевых клеток, включающих клетки, экспрессирующие CD138, где иммуноконъюгат содержит:

(a) сконструированное антитело против мишени,

(i) состоящее по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела; или

(ii) содержащее антиген-связывающий участок против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела,

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела; и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат специфически связывается с CD138,

и где одно или несколько противораковых средств могут уменьшать массу опухоли.

Альтернативно настоящее изобретение предлагает лекарственное средство, содержащее иммуноконъюгат и одно или несколько противораковых средств в виде комбинированного препарата, которые можно использовать одновременно, раздельно или последовательно для лечения опухолевых клеток, включающих клетки, экспрессирующие CD138, где иммуноконъюгат содержит:

направляющее средство, направленное против CD138, включающее

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1, и где одно или несколько противораковых средств могут уменьшать массу опухоли.

В следующем аспекте применения двух предыдущих параграфов комбинированный препарат вводят пациенту после лучевой терапии.

В альтернативном аспекте настоящее изобретение предлагает применение иммуноконъюгата в производстве лекарственного средства для лечения у пациента опухолевых клеток, включающих клетки, экспрессирующие CD138, где иммуноконъюгат содержит:

(a) сконструированное антитело против мишени,

(i) состоящее по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела; или

(ii) содержащее антиген-связывающий участок против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела,

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела; и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат специфически связывается с CD138,

и где лекарственное средство вводят пациенту после лучевой терапии для уменьшения опухолевой нагрузки.

Настоящее изобретение также предлагает применение иммуноконъюгата в производстве лекарственного средства для лечения у пациента опухолевых клеток, включающих клетки, экспрессирующие CD138, где иммуноконъюгат содержит:

направляющее средство, направленное против CD138, включающее

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1,

и где лекарственное средство вводят пациенту после лучевой терапии для уменьшения опухолевой нагрузки.

Лекарственное средство, упомянутое в предыдущих параграфах, способно ингибировать, замедлять и/или предотвращать рост опухоли и/или распространение клеток злокачественной опухоли у пациента.

Далее настоящее изобретение предлагает иммуноконъюгат, уменьшающий выживание клеток миеломы у субъекта, где иммуноконъюгат содержит:

(a) сконструированное антитело против мишени,

(i) состоящее по существу из антиген-связывающего участка против CD138 нечеловеческого антитела; или

(ii) содержащее антиген-связывающий участок против CD138, где указанный антиген-связывающий участок получен из нечеловеческого антитела,

дополнительный участок антитела, где, по меньшей мере, часть указанного дополнительного участка антитела получена из человеческого антитела; и

(b) эффекторную молекулу,

где указанный иммуноконъюгат специфически связывается с CD138.

Далее настоящее изобретение предлагает иммуноконъюгат, уменьшающий выживание клеток миеломы у субъекта, где иммуноконъюгат содержит:

направляющее средство, направленное против CD138, включающее

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть, где указанная тяжелая цепь иммуноглобулина

или ее часть, по меньшей мере, на 70% идентична последовательности SEQ ID NO:1.

Указанный в двух предыдущих параграфах иммуноконъюгат, в частности, способен селективно уменьшать выживание или рост указанных клеток миеломы у субъекта.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает иммуноконъюгат для ингибирования, замедления и/или предотвращения роста опухоли, содержащей опухолевые клетки CD138, и/или распространения клеток такой опухоли у субъекта, где иммуноконъюгат содержит сконструированное антитело против мишени против CD138, присоединенное к эффекторной молекуле через расщепляемый линкер, где указанная эффекторная молекула стерически затруднена.

Ингибирующая активность указанного в предыдущем параграфе иммуноконъюгата в отношении роста опухоли, в частности, превышает ингибирующую активность незатрудненного аналога примерно на 10%, примерно на 20%, примерно на 30%, примерно на 40% или больше.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведено схематическое изображение nBT062, содержащего присоединенные эффекторные молекулы.

На фиг. 2 приведено схематическое изображение BT062.

На фиг. 3 показано превращение ансамитоцина P-3 в майтансинол (стереохимия опущена или упрощена).

На фиг. 4 приведена типичная схема синтеза DM4.

На фиг. 5 приведено схематическое получение конъюгата антитела (nBT062 с DM4).

На фиг. 6 показан анализ связывания антитела nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 и nBT062 с клетками OPM-2. К клеткам добавляют разные концентрации nBT062 и конъюгатов и измеряют флуоресценцию методом FACS.

На фиг. 7 (A)-(D) приведена цитотоксичность конъюгатов nBT062-DMx в отношении клеток MOLP-8 (CD138⁺) и BJAB (CD138⁺) in vitro. Клетки культивируют в плоскодонных планшетах и инкубируют с указанными концентрациями иммуноконъюгатов в течение 5 дней. Чтобы определить жизнеспособность клеток, к ним добавляют реагент WST и инкубируют в течение 3 часов. В секции (D) цитотоксическую активность nBT062-SPDB-DM4 анализируют в присутствии или отсутствии блокирующего антитела (1 мкМ nBT062).

На фиг. 8 показаны объемы опухолей у отдельных мышей, обработанных (A) PBS, (B) антителом nBT062, (C) свободным DM4 или (D) неспецифическим конъюгатом huC242-DM4 через некоторое время (дни) после инокуляции опухолевых клеток MOLP-8.

На фиг. 9 показаны объемы опухолей у отдельных мышей, обработанных (A) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 или (D) nBT062-SPP-DM1 через некоторое время (дни) после инокуляции опухолевых клеток MOLP-8.

На фиг. 10 показаны средние объемы опухолей (+/-SD) ксенотрансплантатов множественной миеломы человека MOLP-8 у мышей CB.17 SCID через некоторое время (дни) после инокуляции.

На фиг. 11 A и B показана противоопухолевая активность nBT062-DMx в отношении опухолевых клеток CD138⁺ MOLP-8 модели массивной опухоли MOLP-8 у мышей SCID. Объем опухоли приведен в виде среднего значения для каждой группы (+/-SD).

На фиг. 12 приведен график, отражающий противоопухолевую эффективность конъюгатов nBT062 и DMx на модели SCIDhu/INA-6 в отношении клеток множественной миеломы в среде костного мозга человека. Растворимый человеческий рецептор IL-6, продуцируемый клетками множественной миеломы (shuIL-6R), используют в качестве показателя опухолевой массы. Треугольники: nBT062-SPP-DM1, квадраты: nBT062-SPDB-DM4; ромбы: контроль-среда.

На фиг. 13 показано nBT062-SPDB-DM4-опосредованное уничтожение соседних клеток in vitro. CD138-положительные клетки OPM2 и CD138-отрицательные клетки Namawla культивируют с nBT062-SPDB-DM4 в разных концентрациях и определяют жизнеспособность клеток. Значения OD₄₅₀ служат показателем жизнеспособности клеток.

Подробное описание разных и предпочтительных

воплощений данного изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим средства, направленные на CD138, а также к доставке эффекторной молекулы (эффекторных молекул) иммуноконъюгатов к участкам-мишеням и к сайт-специфическому высвобождению эффекторной молекулы (эффекторных молекул) в целевых клетках, тканях или органах, или вблизи них. Более конкретно, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим средства, направленные на CD138, и к активным эффекторным молекулам, присоединенным к направляющему средству. Эффекторные молекулы могут активироваться в результате отщепления/диссоциации от направляющего фрагмента иммуноконъюгата в целевом участке.

Иммуноконъюгаты по настоящему изобретению можно вводить субъекту, нуждающемуся в терапевтическом лечении, или в клетки, полученные от такого субъекта, нуждающегося в терапевтическом лечении. Эффекторная молекула или эффекторные молекулы могут высвобождаться из иммуноконъюгата в результате отщепления/диссоциации в целевых клетках, тканях или органах, или вблизи них.

В одном примере иммуноконъюгат, содержащий антитело nBT062, направленное на клетки, экспрессирующие CD138, и, по меньшей мере, одно высокоэффективное цитотоксическое средство или токсин в качестве эффекторной молекулы, вводят пациенту, страдающему раком. В данном примере терапевтически эффективное количество иммуноконъюгата вводят пациенту внутривенно, после чего иммуноконъюгат локализуется в раковых клетках. Затем эффекторная молекула или эффекторные молекулы отделяются от антитела под действием природных факторов. После или в процессе отщепления эффекторная молекула может стабилизироваться в результате алкилирования и может диффундировать в соседние вспомогательные клетки, такие как клетки стромы, которые не экспрессируют CD138.

Во втором примере пациенту, страдающему раком, вводят иммуноконъюгат, содержащий антитело nBT062, которое направлено на клетки, экспрессирующие CD138, и, по меньшей мере, одно высокоэффективное цитотоксическое средство или токсин в качестве эффекторной молекулы, и другое цитотоксическое средство. В данном примере терапевтически эффективные количества иммуноконъюгата и цитотоксического средства совместно вводят пациенту внутривенно, после чего они локализуются в раковых клетках. Цитотоксическое средство разрушает более 50% раковых клеток, экспрессирующих CD138, однако иммуноконъюгат эффективно присоединяется к большему количеству раковых клеток, экспрессирующих CD138. Эффекторная молекула или эффекторные молекулы отделяются от антитела под действием природных факторов. После или в процессе отщепления эффекторная молекула может стабилизироваться в результате алкилирования и может диффундировать в соседние вспомогательные клетки, такие как клетки стромы, которые не экспрессируют CD138.

В третьем примере иммуноконъюгат, содержащий антитело nBT062 и, по меньшей мере, одно высокоэффективное цитотоксическое средство или токсин, вводят в популяцию клеток, полученную от ракового пациента. В данном примере количество иммуноконъюгата, вызывающее гибель клеток или прекращение непрерывного клеточного цикла, вводят в популяцию клеток, после чего иммуноконъюгат локализуется в раковых клетках. Эффекторная молекула или эффекторные молекулы отделяются от антитела под действием природных или внешних факторов, вызывая гибель или прекращение непрерывного клеточного цикла раковых клеток.

В четвертом примере пациенту, страдающему раком, вводят иммуноконъюгат, содержащий антитело nBT062 и, по меньшей мере, одно высокоэффективное цитотоксическое средство или токсин в качестве эффекторной молекулы. В данном примере терапевтически эффективное количество иммуноконъюгата вводят пациенту внутривенно, после чего иммуноконъюгат локализуется в раковых клетках. Эффекторная молекула или эффекторные молекулы отделяются от антитела под действием внешних факторов, вызывая гибель или прекращение непрерывного клеточного цикла раковых клеток.

CD138 или синдекан-1 (также обозначаемый SYND1; СИНДЕКАН; SDC; SCD1; CD138 ANTIGEN, номер доступа SwissProt: P18827 человеческий) является членом гликопротеина, который вначале был обнаружен на клетках эпителиального происхождения и затем на гематопоэтических клетках (Sanderson, 1989). CD138 содержит длинный внеклеточный домен, который связывается с растворимыми молекулами (например, с факторами роста EGF, FGF, HGF) и с нерастворимыми молекулами (например, с компонентами внеклеточного матрикса коллагеном и фибронектином) через цепи гепарансульфата (Langford, 1998; Yang, 2007) и действует как рецептор внеклеточного матрикса. CD138 также опосредует прилипание клеток друг к другу посредством гепарин-связывающих молекул, экспрессируемых прилипающими клетками. Показано, что CD138 может служить сорецептором факторов роста клеток миеломы (Bisping, 2006). Исследования дифференциации плазматических клеток демонстрируют, что CD138 следует рассматривать как антиген дифференциации (Bataille, 2006).

При злокачественном гематопоэзе CD138 интенсивно экспрессируется на большинстве клеток MM, карциномы яичника, карциномы почки, карциномы желчного пузыря, карциномы молочной железы, рака простаты, рака легкого, карциномы толстой кишки, ходжкинской и неходжкинской лимфом, хронического лимфолейкоза (CLL) (Horvathova, 1995), острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелобластного лейкоза (AML) (Seftalioglu, 2003 (a); Seftalioglu, 2003 (b)), сарком твердых тканей, карциномы толстой кишки, а также на клетках других гематологических злокачественных заболеваний и солидных опухолей (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al.,1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al.,2004; Orosz and Kopper, 2001).

Другие раковые заболевания, характеризующиеся экспрессией CD138, включают многие аденокарциномы яичников, переходно-клеточные карциномы мочевого пузыря, светлоклеточные карциномы почек, плоскоклеточные карциномы легких; карциномы молочной железы и раковые заболевания матки (см., например, Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).

В нормальном гематопоэтическом компартменте человека экспрессия CD138 ограничивается плазматическими клетками (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999) и CD138 не экспрессируется на лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах и красных кровяных клетках периферической крови. В частности, стволовые клетки и клетки-предшественники CD34⁺ не экспрессируют CD138 и mAb против CD138 не влияют на число колониеобразующих единиц в культурах гематопоэтических стволовых клеток (Wijdenes, 1996). В негематопоэтических компартментах CD138 в основном экспрессируется на однослойном и многослойном эпителии легких, печени, кожи, почек и кишечника. На эндотелиальных клетках наблюдается лишь слабое окрашивание (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). Показано, что CD138 присутствует на полиморфных формах клеток лимфомы человека (Gattei, 1999).

Моноклональные антитела B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в особенности B-B4, описаны как специфичные к CD138. Из них B-B4, 1D4 и MI15 распознают как интактную молекулу, так и центральный белок CD138, причем показано, что они распознают такие же или близкородственные эпитопы (Gattei, 1999). Предыдущие исследования показывают, что B-B4 распознает CD138 только в мембраносвязанной форме, но не распознает растворимый CD138 (Wijdenes, 2002).

B-B4, мышиное mAb IgG1, связывается с линейным эпитопом между остатками 90 и 95 центрального белка человеческого синдекана-1 (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). Показано, что B-B4 в соответствии с характером экспрессии CD138 интенсивно взаимодействует с плазматической клеточной линией RPMI8226, но не взаимодействует с эндотелиальными клетками. Также в соответствии с харктером экспрессии CD138, B-B4 взаимодействует с линиями эпителиальных клеток A431 (полученными из кератиноцитов) и HepG2 (полученными из гепатоцитов). Иммунотоксин B-B4-сапорин тоже является высокотоксичным в отношении плазматической клеточной линии RPMI8226, фактически, значительно более токсичным, чем свободный сапорин. Однако показано, что из двух тестируемых эпителиальных клеточных линий B-B4-сапорин оказывает токсическое действие только на клеточную линию A431, хотя в клоногенном анализе B-B4 сапорин не ингибирует рост клеток A431 (Vooijs, 1996). Другие исследователи отмечают отсутствие специфичности MM-ассоциированных антигенов по отношению к опухолям (Couturier, 1999).

Термин антитело/иммуноконъюгат "состоящее по существу" из определенных компонентов, в контексте настоящего изобретения означает, что антитело/иммуноконъюгат состоит из указанных компонентов и любых других веществ или компонентов, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики антитела.

В соответствии с настоящим изобретением термин "опухолевая клетка" включает раковые клетки наряду с предраковыми клетками, которые могут необязательно образовывать часть солидной опухоли.

"Направляющее средство" или «средство против мишени» в соответствии с настоящим изобретением способно взаимодействовать с молекулой, экспрессируемой клеткой-мишенью, и включает как пептиды, так и не пептиды. В частности, направляющие средства в соответствии с настоящим изобретением включают антитела против мишени и отличные от иммуноглобулинов специфические молекулы, в основе которых могут лежать отличные от иммуноглобулинов белки, включающие, без ограничения, молекулы AFFILIN®, ANTICALINS® и AFFIBODIES®. Отличные от иммуноглобулинов направляющие молекулы включают не пептидные специфические молекулы, такие как олигонуклеотиды ДНК и РНК (аптамеры), а также физиологические лиганды, в особенности лиганды рассматриваемого антигена, такого как CD138.

"Направляющее антитело" или «антитело против мишени» в соответствии с настоящим изобретением представляет собой природное антитело или молекулу, в основе которой лежит природное, или синтетическое, ил