Олигонуклеотидные праймеры, днк-зонд и способ для идентификации вируса инфекционной анемии лошадей методом пцр или от-пцр в режиме реального времени

Олигонуклеотидные праймеры, днк-зонд и способ для идентификации вируса инфекционной анемии лошадей методом пцр или от-пцр в режиме реального времени

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей.

Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) - вирусная болезнь однокопытных, характеризующаяся поражением органов кроветворения и проявляющаяся рецидивирующей или постоянной лихорадкой, анемией, явлениями геморрагического диатеза и нарушением функций сердечнососудистой системы, а также длительным вирусоносительством [1, 2, 5].

Возбудитель ИНАН лошадей - РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae, рода Lentivirus [1, 2, 4, 6].

С 2010 г. по 2013 г. по данным Международного эпизоотического бюро ИНАН лошадей регистрируется во многих странах мира. 2011 год - Франция, Германия, Греция, Япония - 42 вспышки. 2012 год - Бельгия, Германия, Франция, Греция, Великобритания - 24 вспышки. За полгода 2013 - Бельгия, Франция, Германия - 21 вспышка заболевания.

Также ИНАН регистрируется в странах ближнего зарубежья, например, таких, как Украина [3].

На период 2012 года в нашей стране выявили положительно реагирующих на ИНАН лошадей в Омской, Челябинской, Нижегородской, Кировской, Иркутской, Свердловской, Ленинградской, Курской и Томской областях, республике Бурятия и республике Коми, Приморском и Красноярском крае. За первое полугодие 2013 года выявлены больные животные в Нижегородской, Кировской, Омской, Томской областях, Красноярском крае, республике Коми и республике Хакасия.

Лабораторная диагностика ИНАН в Российской Федерации основана на серологических методах (РДП, ИФА), которые выявляют вирусспецифические антитела в сыворотке крови больных лошадей, начиная с 14-38 дня, и не дают возможности диагностировать заболевание на ранних стадиях болезни до образования антител, а также не позволяют определить статус жеребят, полученных от инфицированных кобыл [1, 2].

Разработка тест-системы для выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей в формате реального времени была обусловлена необходимостью раннего обнаружения болезни, повышения чувствительности диагностических тестов, сокращения времени анализа и трудозатрат.

Обнаружение ПЦР-продуктов основанное, на флуоресцентной регистрации накопления ДНК, значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных вирусов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае идентифицировать вирус [5, 6]. Все существующие способы и основанные на них тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.

Целью данного изобретения является разработка способа выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей с помощью ПНР в режиме реального времени с использованием пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда, комплементарных к консервативной области gag-гена вируса ИНАН.

Поставленная цель достигается за счет пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров, ДНК-зонда и способа для обнаружения РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей в крови, пробах органов (селезенка, печень) от больных или погибших животных, при котором проводят амплификацию ДНК.

Специфические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд для обнаружения РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей используется в полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени. Данная процедура включает следующие этапы:

1. Денатурация РНК вируса ИНАН.

2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.

3. ПЦР РВ.

Денатурацию РНК осуществляют при температуре 94°C в течение 5 минут в реакционной смеси со специфической парой олигонуклеотидных праймеров. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 60 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Или для постановки ПЦР можно использовать провирусную ДНК вируса ИНАН, то есть без этапов денатурации и обратной транскрипции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, Mg²⁺, пару спецефических олигонуклеотидных праймеров, ДНК-зонд и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 94°C - 4 мин; циклирование: 94°C - 10 с, 56°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 5 раз без детекции продуктов амплификации. Затем циклирование: 94°C - 10 с, 56°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 35 раз с детекцией продуктов амплификации.

В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, применение специфических олигонуклеотидов и технологии гибридизационных зондов TaqMan. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ вирусспецифических праймеров и зондов (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей gag-гена, референтных штаммов и изолятов вируса ИНАН, опубликованных в информационной базе данных GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3′ конце RTQ1.

Таблица 1
Специфические праймеры и ДНК-зонд для выявления РНК и пДНК вируса ИНАН
ПЦР-мишень	Праймеры /ДНК-зонд	Нуклеотидная последовательность, 5′-3′	Локализация (NC_001450.1)
gag-ген	EIA/q2/F	gTC-TTC-Tgg-Agg-TgT-TCC-T	480-498
EIA/q2/R	CCg-TCA-CCT-TCT-CTA-ACT-TC	560-579
EIA/q2/Z	FAM - Agg-ARg-ACA-ggT-ARg-ATg-ggR-gA - RTQ1	510-532

Техническим результатом изобретения является возможность обнаружения РНК и пДНК вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по выявлению генома вируса ИНАН в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных вирусспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить РНК и пДНК вируса ИНАН. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

Пример конкретного выполнения

Выявление РНК и пДНК вируса ИНАН проводится в образцах биологического материала: кровь от инфицированных вирусом ИНАН животных, 10%-ная суспензия внутренних органов инфицированных животных, лиофилизированный культуральный материал, а также в образцах интактных культур клеток, крови от интактных животных и культуральном материале гетерологичных вирусов.

Из представленных образцов были выделены нуклеиновые кислоты с использованием следующей методики.

Исследуемый материал в объеме 100-200 микролитров (далее - мкл) вносят в 1,5 см³ пробирки, в которые предварительно внесено 800 мкл лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата. Пробирки перемешивают и инкубируют при температуре 56°C в течение 5-10 мин. Затем добавляют 35 мкл нуклеосорбента, который предварительно тщательно ресуспендируют. Смесь инкубируют в течение 7 мин при комнатной температуре с периодическим перемешиванием на смесителе типа «Vortex». Осаждают сорбент центрифугированием при 7 тыс об/мин - 15 сек. При помощи вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой отдельным для каждой пробы наконечником удаляют надосадок.

Затем к осадку добавляют 300 мкл отмывочного буфера и тщательно ресуспендируют сорбент. Центрифугируют пробу при 7 тыс об/мин - 30 сек. Удаляют, используя отдельный наконечник для каждой пробы, надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса с колбой-ловушкой.

Дважды промывают сорбент 75%-ным этиловым спиртом, в количестве 500 мкл на каждую пробу, тщательно ресуспендируют. Центрифугируют пробу при 13 тыс. об/мин - 30 сек. Надосадок удаляют при помощи вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой и отдельного наконечника для каждой пробы.

Осадок в пробирках подсушивают при 56°C в течение 5-10 мин, при этом крышки пробирок должны быть открыты.

К осадку добавляют 50 мкл элюирующего буфера. Перемешивают на смесителе типа «Vortex» и инкубируют 10 мин при 56°C в пробирках с закрытой крышкой.

Центрифугируют пробирки в течение 60 сек при 13 тыс об/мин и переносят надосадочную жидкость в новые пробирки.

Супернатант используют в дальнейшем в качестве матрицы для постановки реакции обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени.

Затем для выявления РНК вируса ИНАН препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции обратной транскрипции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации РНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК или пДНК (нуклеиновые кислоты после выделения без этапа обратной транскрипции) в количестве 8 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации РНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 94°C в течение 5 минут.

Готовят смесь для реакции обратной транскрипции, для этого в отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов. На одну пробу смешивают: 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 60 минут. После окончания реакции к ДНК используют для постановки ПНР.

Проведение ПЦР

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров, 0,3 мкл ДНК-зонда и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 16 мкл в пробирки объемом 0,2 см³. На поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 8 мкл кДНК или пДНК.

Помещают пробирки в амплификатор со следующей программой:

Профиль реакции:

1. Удержание температуры / Hold	94°C - 4 мин
2. Циклирование / Cycling (без детекции	94°C- 10 с
продуктов амплификации)	56°C - 15 с
	72°C - 15 с

Цикл повторить / Cycle repeats 5 раз (5 times)

3. Циклирование / Cycling (с	94°C - 10 с
детекцией продуктов амплификации	56°C - 15 с - детекция!
	72°C - 15 с

Цикл повторить / Cycle repeats 35 раз (35 times)

Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 56°C.

С помощью программы "BioEdit 7.0.8" выравнены доступные в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности полного генома и участков gag-гена вируса ИНАН. При анализе построенного элайнмента внутри gag-гена вируса ИНАН выбран консервативный участок, на который и были подобраны специфические олигонуклеотиды. С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома, размером 99 п.о. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров EIA/q2/F и EIA/q2/R.

С использованием программы "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Свойства олигонуклеотидов, рассчитанные с помощью программы

"Oligo 6.0.

Названиеолигонуклеотида	Температураплавления, °С	AG гибридизации олигонуклеотида на матрицу, kcal/mol	3AG образования шпилечной структуры, kcal/mol	Эффективность отжига олигонуклеотида на матрицу (Priming efficiency number)1
EIA/q2/F	57,5	-33,6	-8,2	365
EIA/q2/Z	68,2	-42,3	-7,9	417
EIA/q2/R	58,5	-35,1	-9,6	393

Примечание:

1- Priming efficiency number - это величина, определяющая эффективность гибридизации данного праймера (зонда) с заданным участком матрицы, рассчитывается по уникальному алгоритму, разработанному создателями программы "Oligo". Минимальное значение Priming efficiency number, при котором праймер (зонд) в ходе ПЦР эффективно гибридизуется со специфическим участком матрицы.

Определение аналитической чувствительности ПЦР в режиме реального времени при выявлении пДНК вируса ИНАН и ОТ-ПЦР в режиме реального времени при выявлении РНК вируса ИНАН.

Аналитическую чувствительность метода определяли с использованием рекомбинантной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса ИНАН и in vitro транскрипта, синтезированного на матрице рекомбинантной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса ИНАН. Концентрация очищенного препарата плазмидной ДНК измеренная спектрофотометрически составила 0,253*10 ^-6 г/мл, что соответствует 0,77×10 ⁸ молекул ДНК/мкл. Спектрофотометрически измеренная концентрация in vitro транскрибированной РНК составила 1,593*10 ^-6 г/мл, что соответствует 1,18 ×10 ⁹ молекул РНК /мкл.

Десятикратные разведения (в трех повторах) препарата рекомбинантной плазмиды и транскрибированной in vitro РНК известной концентрации использовали для определения аналитической чувствительности ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 0,77*10² молекул ДНК /мкл, что соответствует 6,16×10² молекулам ДНК в реакционной смеси. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 1,18*10² молекул РНК /мкл, что соответствует 9,44×10² молекулам ДНК в реакционной смеси.

Учет и интерпретация результатов амплификации

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения C_t в соответствующей графе в таблице результатов. Результаты идентификации вируса ИНАН методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанных специфических олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты идентификации вируса ИНАН методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанных специфических олигонуклеотидов в различных образцах биологического материала.
№ проб	Характеристика биологического материала	Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени
1	культура клеток синовиальной мембраны ягненка (СМЯ), зараженная вирусом висна-маеди, шт. «М-88» 3,5-4,5 lg ТЦД50/мл	-
2	культура клеток синовиальной мембраны козленка (СМК), зараженная вирусом АЭК, шт. «75G-63» 5,0-5,5 lg ТЦД50/мл	-
3	культура клеток CV, зараженная вирусом африканской чумы лошадей, штамм «452» (8 серотип)	-
4	10% суспензия легкого овцы с клиническими и патологическими признаками аденоматоза легких овец №12 (г. Пермь)	-
5	кровь от клинически здоровой лошади	-
6	кровь от клинически здоровой овцы, искусственно контаминированная вирусом висна-маеди, шт. «М-88» в разведении 1:10	-
7	кровь от клинически здоровой козы, искусственно контаминированная вирусом АЭК, шт. «75G-63» в разведении 1:10	-

8	культура клеток лейкоцитов лошади, интактная	-
9	10% суспензия печени лошади, серопозитивной по инфекционной анемии лошадей	+
10	10% суспензия селезенки лошади, серопозитивной по инфекционной анемии лошадей	+
11	антиген (штамм «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ») из «Набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) (организация-производитель ФГУП «Щелковский биокомбинат»)	+
12	кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 2 сутки наблюдения	+
13	кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 14 сутки наблюдения	+
14	кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 35 сутки наблюдения	+

Синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность. Установлено, что тест-система не амплифицирует РНК и ДНК других вирусов.

Таким образом, подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, а также разработан способ, позволяющий с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидов обнаруживать РНК и пДНК вируса ИНАН.

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- высокая специфичность и чувствительность способа идентификации вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности gag-гена генома вируса ИНАН;

- быстрота и относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации вируса ИНАН, благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПНР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала.

Источники информации

1. Архипов, Н.И. Медленные инфекции животных / Н.И Архипов, И.А. Бакулов, Л.И. Соковых. - М.: Агропромиздат, 1987. - 191 с.

2. Юров, К.П. Вирусные болезни лошадей / К.П. Юров, В.Т. Заблоцкий, Н.Е. Косминков. - М.: Зоомедлит, 2010. - 256 с.

3. Эпизоотологический мониторинг, лечение и профилактика заразных болезней лошадей в Украине / А.Е. Галатюк, В.Л. Бегас, А.И. Каневский [и др.] // Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: материалы Международной научно-практической конференции. - Саратов, 2010. - С.109-113.

4. An EIAV field isolate reveals much higher levels of subtype variability than currently reported for the equine lentivirus family / J.K. Craigo, S. Barnes, B. Zhang [et al.] // J. Retrovirology. - 2009. - №6 - P 95.

5. Momtaz, H. Detection of proviral sequences of equine infectious anemia virus in peripheral blood cell of horses in Iran / H. Momtaz, S. Nejat // Bulgarian Journal of Veterinary Medicine. - 2010. - Vol.13, №1, P.18-22.

6. Nagarajan, M.M. Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction / M.M. Nagarajan, C. Simard // Journal of Virological Methods. - 2001. - Vol.94. - P.97-109.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные консервативной области gag-гена вируса ИНАН, используемые для выявления генома вируса инфекционной анемии лошадей, имеющие следующий нуклеотидный состав (5′-3′):EIA/q2/F gTC-TTC-Tgg-Agg-TgT-TCC-TEIA/q2/Z FAM-Agg-ARg-ACA-ggT-ARg-ATg-ggR-gA-RTQ1EIA/q2/R CCg-TCA-CCT-TCT-CTA-ACT-TC

2. Способ выявления генома вируса инфекционной анемии лошадей, включающий постановку полимеразной цепной реакции, амплификацию ДНК вируса, оценку проведения реакции, при этом при выявлении вирусной РНК предварительно проводят реакцию денатурации и обратной транскрипции, а идентификацию проводят с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени при выявлении РНК вируса ИНАН и ПЦР в реальном времени при выявлении пДНК вируса ИНАН, с использованием специфических праймеров и ДНК-зонда по п.1, при этом температурные режимы включают следующие этапы: 5 мин предварительной денатурации при 94°C, 5 циклов амплификации без детекции (94°C - 10 сек, 56°C - 15 сек, 72°C - 15 сек) и 35 циклов амплификации с детекцией (94°C - 10 сек, 56°C - 15 сек, 72°C - 15 сек), а интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold).